Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

Özet

Fare M. Cremaster'ın mikro intravital mikroskopi eşsiz ve çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için in vivo model yanı sıra standart sunmaktadır.

Özet

Rejeneratif hücre tedavisinin bağlamında intravasküler hücre uygulama protokolleri çağında, doku nonmarrow için kök hücre göçünün altında yatan mekanizmaları tamamen açıklığa olmamıştır. Burada in vivo çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için fare Cremaster'ın mikro uygulanan intravital mikroskobu tekniğini tarif eder. M. Cremaster'ın Intravital mikroskopi önceden vasküler endotel ile lökosit etkileşiminin doğrudan gözlem için inflamatuar araştırma alanında girmiştir. Yeterli periferik kök ve progenitör hücre göçü bu endotel ile intravasculary uygulanan kök hücre etkileşim gözlem ve ölçümü için M. Cremaster'ın modeli uygulamak için düşünülebilir astar endotel yanlarında ve sağlam yapışma haddeleme benzer ilk adımları içerdiğinden. Çeşitli kimyasal bileşenlerin seçici olarak hedef t uygulanabilir gibiBasit süperfüzyon teknikleri ile sorun, bu kemik iliği dışında yaşayan organizmada gerçekleşecek ilk kök hücre toplanması için, gerekli microenvironmental önkoşullar kurmak mümkündür.

Giriş

Bu makalenin amacı, periferik kemik iliği kök hücre göçü doğrudan gözlem ve analiz için fare Cremaster'ın mikrosirkülasyonda uygulanan intravital mikroskopi tekniği (IVM) tanımlamaktır.

Kök hücre mevcut kavram tabanlı doku ve organ yenilenmesi yaralı dokuya ¹ kemik iliği kaynaklı kök hücrelerin homing içerir. Başarılı bir kök hücre göçü için önemli bir adım transendotelyal göç ve sonunda organı engraftment ² tarafından takip yaralanan organ içinde yerel endotel ile hücre etkileşimini kök içermektedir. Bu kök hücre Intravital analizi - endotel hücre etkileşimleri in vivo olarak farklı patofizyolojik ortamlarda bir kök hücre tabanlı rejeneratif tepkisinin ölçümü için ideal bir parametre oluşturur. Bundan başka, bu akla görünüyor ki, gelecekte belirli kök hücre p göç kapasitesinin intravital analizistandardize mikrosirkülatuar ortamlarında opulations, önce başka klinik testler için bu popülasyonları ilerleyen uygulanan olabilir.

İntra vital mikroskopik ilk olarak enflamatuar araştırma ³ alanında, in vivo olarak lökosit-endoteliyal hücre etkileşiminin gözlenmesi ve ölçümü için geliştirilmiştir. Intravital mikroskopi çalışmaların ilk başarılı kayıtları bir ışık mikroskobu altında ⁴ kurbağaların dilleri ve mesentere okuyan, 19. yüzyılda zaten Cohnheim tarafından bildirilmiştir. Ilk kullanım IVM büyük bir teknik gelişme ve bugün uğramıştır yana bazı temel bileşenleri kantitatif IVM gerçekleştirmek için, ön koşullar meydana getirir: (i) ya da doku, optik erişim izni preparasyonlar, (ii) bir mikroskop ile tespit edilebilir, moleküler problar, (iii ) bir algılama sistemi ve görüntü verilerinden ilgi parametreleri özü (iv) bilgisayar destekli analiz sistemlerine bağlı bir mikroskop^4. set.

Doku preparatlarının çeşitli mesentere ve fare ve sıçan ^{5, 6} ve fare, hamster, tavşan kulak ve birkaç isim Hamster yanak kese dorsal Deri kıvrım odalarının karaciğer de dahil olmak üzere IVM çalışmalar için getirilmiştir.

Ancak, hazırlık ve görselleştirme iyi standardize cerrahi işlemin mümkün olduğu kadar aşağıda biz intravital gözlemleri için ideal doku temsil fare Cremaster'ın kas, üzerinde durulacak, ve genel olarak hareket eserler hiçbir sorunlar oluşur. Açık Cremaster'ın kas hazırlık Baez tarafından 1970'li yıllarda ilk kez gerçekleştirilen ve arkadaşları ^7. oldu. Başlangıçta tarif edilen fareler için, bu fare ⁸ de başarılı bir şekilde kabul edilmiştir. Önceki çalışmalarda ağırlıklı olarak damar duvarı ile lökosit etkileşimlerine odaklanmış ettikten sonra, kendi grubu son bir değerleme olarak fare Cremaster'ın kas hazırlık tanıttıdoğrudan görselleştirme ve tanımlanmış bir mikro ⁹ içindeki kök hücre-endotel etkileşimleri kantitatif analiz için ble aracı. Çeşitli kök hücresi alt-popülasyonları murin c-kit ⁺ kemik iliği kök hücre ve mezenkimal kök hücreleri, hem de insan CD 133 ⁺ kemik iliği kök ^{hücreleri, 10-12} de dahil olmak üzere, bu model kullanılarak incelenmiştir. Vericinin kemik iliği ve görselleştirme için floresan etiketleme hücre izolasyonu takiben, kök hücreler selektif bir şekilde uzak organlardaki içinde herhangi bir cep tutulmasının önüne, femoral arter yoluyla arteriyel enjeksiyonu kullanan Cremaster'ın mikrosirkülasyondaki içine uygulanır. Potansiyel olarak ilgili ayarları içinde yerel kök hücre göçü aracılık çeşitli kemokinler, topikal basit süperfüzyon tekniği ile hedef dokuya uygulanabilir Bundan başka, Cremaster'ın kas modeli özellikle yararlıdır.

Protokol

Hücre izolasyonu sonra tüm protokol, yaklaşık olarak 2 saat sürer.

1.. Mikrocerrahi Hazırlık

1. ^9,12 hücreler, hayvan işlem gerçekleştirilir süre boyunca dinlenmeye bırakın standart protokollere göre vericinin kemik iliği ve izole edilmiş alt populasyonun floresan etiketleme kök hücre izolasyon yapın. Floresan etiketleme için biz CFDA (Carboxyfluorescein diasetate succinimidyl ester) öneririz.
2. Ketamin (75 mg / kg) ve ksilazin (2.5 mg / kg) ile, 20-25 g ağırlığında, erkek fare anestezisi. (Genellikle her 30-60 dk) gerektiği gibi cerrahi işlemler ve deneysel protokolleri boyunca, anestezi takviyeleri (ilk enjeksiyon% 10, ip) muhafaza edilmelidir.
3. Yavaşça sağ skrotum ön yönü yanı sıra sağ uyluk ve kasık tıraş. Tüm nemlendirilmiş pamuklu çubukla saç kaybetmek toplayın. Pleksiglas görüntüleme sahnede fare ventral yüzü yukarı yerleştirin ve ücretini saptamakelastik örtü kullanarak t. Sahne bacak ve skrotum hem yüksekliği için taban plakasının kaudal kenarında bir taban plakası ve bir ikinci levha içeren, özel yapılır. 37 ° C de vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerine yerleştirin sahne Sahnede tespit sonra, operasyon mikroskobu altında hayvan koyun ve 10 kullanılarak aşağıdaki işlem adımları gerçekleştirin - 16 kat büyütme.
4. Kasık kadar sağ uyluk, diz femoral damarların sadece anterior cilt makas kullanarak ilk kesi olun.
5. Femoral arter tespit ve yumuşak doku çevreleyen arter seferber, proksimale izleyin. Belirlemek ve thermocautery kullanarak sol testis büyük bir dalı kesti. Bundan sonra sol testiste yüzeysel bir konaklama dikiş yerleştirin. Nazik çekiş femoral arter daha yakın seferber kolaylaştıracaktır.
6. Proksimal harekete tamamlanmasından sonra, tespit etmek ve büyük bir dal çalışan kesme MEDIALLthermocautery tarafından uyluk y. Bundan sonra sağ uyluk distal kısmında femoral arteri bağlayın. Bağı nazik traksiyon daha hazırlanmasına yardımcı olacaktır.
7. Yine proksimal femoral arter şimdi dikkat ters çevirin ve proksimale mümkün arter çevresinde bir dikiş yerleştirin. Bir düğüm hazırlayın ancak henüz aşağı kravat yok. Sütür hafifçe çekin ve bir arteriyel dolaştırmaktan oluşturun.
8. Dolaştırmaktan kurduktan sonra, arter dikkatli bir microscissor kullanıyor deşmek. Femoral ven zarar vermemek için özel dikkat gösterin.
9. Insizyon ile hazırlanmış bir mikrokateter (iç çapı 0.28 mm) takın. Kateter (% 0.9 sodyum klorür, NaCl) deaired ve 1 ml'lik bir şırınga, sokulmadan önce bağlanmalıdır.
10. Kateterin başarılı yerleştirilmesinden sonra, dikkatli bir şekilde, kateterin geçişini kolaylaştırmak için bir dolaşması gevşetin. Arteryal kan akımı, kateter içinde hemen görünür olmalıdır. Kateter yavaşça birkaç milimetre ilerlemekönceki dolanma ötemde. Bundan sonra, kateter tespiti için hazırlanan ligatürün aşağı kravat.
11. Yavaşça doğru konumunu onaylamak için kateter (% 0.9 NaCl) ve aspire yıkayın. Bundan başka, işlem aşamasına kateteri sağlamak için bir parça bant kullanın.
12. Yeterli Tespit edildikten sonra, Cremaster'ın kas aşağıdaki adımları hazırlanması için bir kenara kateter koydu. Pıhtı oluşumunu önlemek için normal yıkama ve kateter, her 5-10 dk aspirasyonunun uygulanır.
13. Sağ testis şimdi dikkat açın ve sağ skrotum ventral yukarıda cilt ve fasya kesim tarafından bir kesi yapmak. Herhangi aletleri ile altta yatan doku dokunmamaya özen gösterin.
14. Kadar inguinal kat ve kaudal skrotum uzak ucuna kesi uzatın.
15. Dokunmadan Cremaster'ın çuvalın üzerinde dikkatle ayrı yatan yumuşak ve bağ dokusu. Cremaster'ın uzak ucunu belirlemek ve sl burada bir konaklama sütür koyunightly kas uzanır. Yavaşça kaudal ve öne kas çekerek kas çuval altında artık kalan yumuşak doku rezeke.
16. Bağ dokusundan tam ayrılmasından sonra, makas kullanılarak kraniyal kenarında bir noktada Cremaster'ın çuval açın. Kas uzak ucuna bu açıklıktan aşağı kesi uzatın.
17. Sonra makas kullanarak kas ve testis arasında kalan bağlantıları kesilmiş, thermocautery kullanarak testisi ve Cremaster'ın bağlayan küçük bir gemi Seal.
18. Mikroskop alanının dışında, testis kenara koymak.
19. Açıldı Cremaster'ın artık sahnede düz bırakır. Cremaster'ın kas dokusu yaymak amacıyla doku kenarlarında dört 6-0 Prolene kalmak sütür koyun ve elastik örtü ile onları düzeltmek. Şu andan itibaren sürekli bir 1 ml şırınga (Şekil 1) kullanılarak, fosfat tamponlu tuz (PBS) ile doku ıslatın.
20. Artık, 15 dakika boyunca geri kalanı için hazırlık izin verin. Bundan sonra enjekteMikro damarların kontrast için sol femoral arter yoluyla,% 1 Rodamin-dekstran 0.05-0.1 ml. Herhangi bir kemokin veya inflamatuvar ajanlar uygulaması için planlanan ise, şimdi topikal 1 ml şırınga kullanarak ilgili reaktif ile kas nemlendirin gerekir. Bir kontrol deneyi durumunda, PBS ile nemlendirme devam etmektedir.

2. İntra vital mikroskopik

1. Işletme aşamasında sabit fare tutmak ve epi-aydınlatma için modifiye edilmiş ve bir CCD (şarj bağlı cihaz) video kamera bağlanmış bir floresan mikroskop altında hareket. Femoral arter kateteri yerinden değil özel özen gösterin.
2. Bir suya daldırma objektif kullanarak deneyler.
3. Cremaster'ın mikrodolaşımında yeterli görselleştirme ve hücre enjeksiyonu öncesi hedefi ayarladıktan sonra, davranışsal firma kök hücre bağlılık daha sonra analiz için altı postkapiller venüllerinde tanımlar.
4. Floresan etiketli kök hücreleri yönetmek,Femoral arter kateteri kullanılarak beş ardışık enjeksiyonları toplam bir 1 ml şırınga ile, enjeksiyon başına 0.4 x 10 ⁶ hücre, 200 ul PBS içinde çözülmüştür. Dikkatle önce ilk enjeksiyondan hücre örneği sallayın.
5. Record kök hücre böylece tipik bir hücresel birlikte endotel hücre astar boyunca bir hız daha fazla% 50 azalma olarak "pano" tanımlayan hücre enjeksiyonundan hemen sonra haddeleme "çubuğu ve serbest" hareketleri. Haddeleme kök hücre sayma ve her enjeksiyonunu takiben gözlem 1 dakika boyunca önceden tanımlanmış bir venüler mesafeyi geçen tüm kök hücreleri gerçekleştirin. Kök hücre haddeleme miktarı her geçen hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. Haddeleme hücreleri gibi rasgele kısa bağlama olayları sergileyen hücreler sayılmaz.
6. Son hücre enjeksiyon sayılması ile sıkıca yapışık kök hücre sayısını belirlemek ve th hesaplanan endotel yüzeyine göre miktarı ifade izlenerekE önceden tanımlanmış altı venüller (çap x uzunluk x π) yapışık hücre / mm ² olarak. Hiçbir hücre hareketi, 30 saniye için tespit olduğunda Firma yapışma olarak kabul edilir.
7. Intravital mikroskopi tamamlanmasından sonra dikkatlice Cremaster'ın kas kaldırmak ve daha sonra analiz (immünhistokimya veya moleküler biyoloji) yazışmanın içinde saklayın. Servikal dislokasyon ile hayvan kurban. Kök hücre haddeleme ve sağlam endotel yapışma, yanı sıra kırmızı kan hücresi hızı (mm / sn), damar uzunluğu (um), damar çapı (mikron), duvar payı oranı olarak mikrovasküler hemodinami, ölçümü için intravital mikroskopi kayıtların analizi (sn ^-1); bir görüntü işleme yazılımı kullanan ilgili deneysel doku tedavisi bilmeyen bir araştırmacı tarafından çevrimdışı yapılmalıdır.

Sonuçlar

Genel olarak, doğrudan bir etkileşim Cremaster'ın kas mikro dolaşımı içinde vasküler endotelyum ile kök veya projenitör hücreleri enjekte edilen bir nadir bir olaydır ve kılcal damarlar (çap: 30-80 um) içinde özel olarak ortaya çıkar. Dolayı floresan etiketleme haddeleme ve sıkıca yapışık kök hücreleri net bir şekilde (Şekil 2) gözlenen venüllerde lökosit endojen dolaşan ayrılmasında belirlenebilir.

Kan akım hızı ve duvar kayma hızı...

Tartışmalar

Intravital floresan mikroskopi doğrudan görselleştirme ve kök hücre-endotel etkileşimleri kantitatif analiz için izin verir. Mikrocerrahi teknikleri maruz kalma ve intravital görselleştirme de lökosit-endotel etkileşimleri ve çeşitli kimyasal bileşenlerin üzerinde yapılan araştırmalar sırasında seçici olarak basit bir teknik ile süperfüzyon hedef dokuya uygulanabilir kurulmuştur yana Cremaster'ın kas modeli, özellikle yararlıdır. Nedeniyle hareket artefaktları ve ağır görüntü ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500