Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l'analyse des souches périphériques migration cellulaire

Résumé

Microscopie intravitale de la microcirculation souris crémaster M. offre un service unique et bien normalisé modèle in vivo pour l'analyse de la moelle osseuse migration de cellules souches périphériques.

Résumé

À l'ère de protocoles d'application intravasculaire de cellules dans le cadre de la thérapie cellulaire régénérative, les mécanismes sous-jacents de la migration des cellules souches de tissu nonmarrow n'ont pas été complètement clarifiée. Nous décrivons ici la technique de microscopie intravitale appliquée à la cremaster microcirculation de la souris pour l'analyse de la moelle osseuse migration périphérique de cellules souches in vivo. Microscopie intravitale de l'M. crémaster a été préalablement introduit dans le domaine de la recherche inflammatoire pour l'observation directe de l'interaction des leucocytes à l'endothélium vasculaire. Depuis souches périphériques suffisante et la migration des cellules progénitrices comprend les étapes initiales similaires de rouler le long et ferme adhésion à la endothéliales tapissant il est envisageable d'appliquer le modèle de cremaster M. pour l'observation et la quantification de l'interaction des cellules intravasculary souches administrées avec l'endothélium. Comme différents composants chimiques peuvent être appliqués de manière sélective à la cible tquestion par des techniques de surfusion simples, il est possible d'établir des conditions préalables essentielles du micro-environnement, pour le recrutement de cellules souches initiale aura lieu dans un organisme vivant à l'extérieur de la moelle osseuse.

Introduction

Le but du présent article est de décrire la technique de microscopie intravitale (IVM) appliqué sur le crémaster microcirculation de la souris pour l'observation directe et l'analyse de la migration de la moelle osseuse de cellules souches périphériques.

Tissus et organes régénération, le concept actuel de cellules souches basée implique la domiciliation des cellules souches dérivées de la moelle osseuse dans le tissu lésé ^1. Une étape cruciale pour la réussite de la migration de cellules souches comprend des cellules souches interaction avec l'endothélium locale au sein de l'organe lésé suivie par la migration trans-endothéliale et, éventuellement, la prise de greffe organe ^2. Intravitale analyse de ces cellules souches - interactions des cellules endothéliales forme un paramètre idéal pour la quantification d'une réponse par récupération à base de cellules souches dans des contextes différents physiopathologiques in vivo. En outre, il semble concevable que, dans l'avenir, l'analyse intravitale de la capacité migratoire des cellules souches spécifiques populations dans les environnements de la microcirculation normalisés, pourraient être appliquées avant la promotion de ces populations à d'autres essais cliniques.

Microscopie intravitale a été initialement mis au point pour l'observation et la quantification de l'interaction de la cellule leucocyte-endothéliale in vivo dans le domaine de la recherche inflammatoire ^3. Premiers enregistrements succès des études de microscopie intravitale ont été signalés par Cohnheim déjà au 19ème siècle, l'étude des langues et mésentères de grenouilles sous un microscope optique ^4. Depuis sa première utilisation IVM a connu un développement technique énorme et aujourd'hui certains éléments essentiels constituent les conditions préalables pour effectuer IVM quantitative: (i) des préparations de tissus qui permettent l'accès optique, (ii) des sondes moléculaires qui peuvent être détectés par un microscope, (iii ) un microscope raccordé à un système de détection et (iv) sur la base de l'analyse des systèmes informatiques qui peuvent extraire des paramètres d'intérêt à partir des données d'imageset ^4.

Une variété de préparations de tissus a été introduit pour les études IVM y compris les mésentère et le foie de la souris et le rat ^5, les chambres dorsale du pli cutané de la souris et le hamster ^6, l'oreille de lapin et le hamster cheek pouch pour n'en nommer que quelques-uns.

Toutefois, dans ce qui suit, nous allons nous concentrer sur le crémaster muscle de souris, ce qui représente un tissu idéal pour les observations intravitale, la préparation et la visualisation sont possibles par une intervention chirurgicale bien standardisée, et en général pas de problèmes d'artefacts de mouvement se produire. La préparation crémaster muscle ouverte a été réalisée pour la première fois dans les années 1970 par Baez et ses collègues ^7. Initialement décrit chez le rat, il a été adopté avec succès également pour la souris ^8. Après des études antérieures avaient principalement porté sur les interactions des leucocytes avec la paroi du vaisseau, notre groupe a récemment introduit la souris crémaster préparation musculaire comme évable outil pour la visualisation directe et l'analyse quantitative des interactions cellule-souches endothéliales dans un microenvironnement défini ^9. Différentes sous-populations de cellules souches a été étudiée en utilisant ce modèle, y compris murin c-kit ⁺ de la moelle osseuse les cellules souches et les cellules souches mésenchymateuses, ainsi que les CD humaines des cellules souches 133 ⁺ de la moelle osseuse ^{de 10 à 12.} Suite à l'isolation de cellules de moelle osseuse du donneur et un marquage fluorescent pour la visualisation, les cellules souches sont appliqués de manière sélective dans la microcirculation crémaster utilisant une injection artérielle par l'intermédiaire de l'artère fémorale, ce qui évite tout coincement des cellules dans des organes distants. En outre, le modèle de muscle crémaster est particulièrement utile car diverses chimiokines potentiellement médiatrices migration de cellules souches locales dans les paramètres respectifs, peuvent être appliquées par voie topique au tissu cible par une technique de surfusion simple.

Protocole

L'ensemble du protocole après l'isolement cellulaire dure environ 2 heures.

Une. Préparation de microchirurgie

1. Effectuer l'isolement de cellules souches de la moelle osseuse du donneur et un marquage fluorescent de la sous-population isolée selon des protocoles ^9,12 permettre aux cellules de se reposer pendant le temps de l'opération de l'animal est effectuée normalisés. Pour le marquage fluorescent, nous recommandons CFDA (Carboxyfluorescein diacétate de succinimidylester).
2. Anesthésier une souris mâle pesant 20 à 25 g avec de la kétamine (75 mg / kg) et de xylazine (2,5 mg / kg). Tout au long des interventions chirurgicales et des protocoles expérimentaux, l'anesthésie doit être maintenue par des suppléments (10% de l'injection initiale, ip) au besoin (habituellement tous les 30-60 min).
3. Rasage en douceur la face antérieure du droit scrotum ainsi que la cuisse droite et à l'aine. Recueillir tous les perdre les cheveux avec un coton-tige imbibé. Placez la face ventrale de la souris sur un stade plexiglas de visualisation et de fixer la taxet utilisant drap élastique. L'étape est faite sur commande, constitué d'une plaque de base et une seconde plaque au niveau du bord extrême de la plaque de base pour l'élévation des deux jambes et le scrotum. Placez la scène sur un tapis de chauffage pour maintenir la température du corps à 37 ° C. Après fixation sur la scène, placer l'animal sous un microscope d'opération et effectuez les étapes de fonctionnement suivantes en utilisant 10 - 16 fois grossissement.
4. Faire l'incision initiale à l'aide de ciseaux de la peau à la cuisse droite, juste antérieure des vaisseaux fémoraux du genou jusqu'à ce que de l'aine.
5. Identifier l'artère fémorale et suivre proximale, la mobilisation de l'artère de tissus mous environnants. Identifier et couper une grosse branche au testicule gauche en utilisant thermocautère. Ensuite placez un séjour suture superficiellement au testicule gauche. Une traction douce facilitera davantage la mobilisation proximale de l'artère fémorale.
6. Après l'achèvement de la mobilisation proximale, d'identifier et de couper une grosse branche courante medially à la cuisse par thermocautère. Ensuite ligaturer l'artère fémorale dans la partie distale de la cuisse droite. Une légère traction sur la ligature aidera autre préparation.
7. Tournez attention maintenant à l'artère fémorale proximale de nouveau et placer un fil de suture autour de l'artère proximale que possible. Préparez un nœud, mais ne pas l'attacher vers le bas encore. Appliquer une légère traction sur la suture et créer un vrillage artérielle.
8. Après avoir établi le vrillage, inciser l'artère utilise avec soin un microscissor. Faites attention à ne pas endommager la veine fémorale.
9. Insérez un microcathéter préparée (diamètre intérieur de 0,28 mm) par l'incision. Le cathéter doit être désaéré (chlorure de sodium à 0,9%, NaCl) et relié à une insertion préalable de la seringue de 1 ml.
10. Après l'insertion du cathéter de succès, desserrer soigneusement le vrillage afin de faciliter le passage du cathéter. Le flux sanguin artériel doit être immédiatement visible dans le cathéter. Avancer doucement le cathéter quelques millimètress au-delà de la pliure précédente. Par la suite, attacher la ligature préparé pour la fixation du cathéter.
11. Rincez délicatement le cathéter (NaCl 0,9%) et aspirer à confirmer la bonne position. Utilisez un morceau de ruban adhésif pour fixer davantage le cathéter à la phase d'exploitation.
12. Après fixation adéquate, mettre le cathéter de côté pour les étapes suivantes de préparation de la crémaster. Appliquer le rinçage régulier et l'aspiration du cathéter chaque 5-10 min afin d'empêcher la formation de caillots.
13. Tournez attention maintenant à la droite du scrotum et faire une incision en coupant la peau et le fascia-dessus de la face ventrale du droit scrotum. Prenez soin de ne pas toucher le tissu sous-jacent avec tous les instruments.
14. Étendre l'incision jusqu'à pli inguinal et caudale à l'extrémité distale du scrotum.
15. Tissu soigneusement séparée sous-jacent doux et conjonctif au-dessus du sac crémaster, sans le toucher. Identifier l'extrémité distale du crémaster, et placer un séjour suture ici pour slétendre ightly le muscle. Réséquer maintenant restant tissus mous sous le sac de muscle en tirant doucement le muscle en bas et en avant.
16. Après la séparation complète du tissu conjonctif, ouvrir le sac crémaster à un point sur le bord du crâne avec des ciseaux. Étendre l'incision vers le bas à partir de cette ouverture à l'extrémité distale du muscle.
17. Sceller le petit bateau reliant le testicule et le crémaster utilisant thermocautère, puis couper les connexions restantes entre le muscle et le testicule avec des ciseaux.
18. Mettons de côté le testicule, sur le domaine de la microscopie.
19. Le crémaster ouvert établit maintenant à plat sur la scène. Placez quatre 6-0 Prolene séjour sutures sur les bords du tissu et les fixer avec drapé élastique afin de répartir le tissu cremaster musculaire. A partir de maintenant humidifier le tissu en continu avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une seringue de 1 ml (Figure 1).
20. Autoriser maintenant la préparation se reposer pendant 15 min. Injecter la suiteDe 0,05 à 0,1 ml de 1% de rhodamine-dextran par l'intermédiaire de l'artère fémorale gauche pour l'amélioration du contraste du système microvasculaire. Si des chimiokines ou inflammatoires sont prévues pour l'application, vous devriez maintenant topique humidifier le muscle avec le réactif respectif en utilisant une seringue de 1 ml. Dans le cas d'une expérience de contrôle, poursuivre l'humidification avec de la PBS.

2. Microscopie intravitale

1. Gardez la souris fixé sur la phase d'exploitation et de passer sous un microscope à fluorescence modifiée pour épi-illumination et relié à un capteur CCD (dispositif à couplage de charge) caméra vidéo. Prenez soin de ne pas disloquer le cathéter dans l'artère fémorale.
2. Mener des expériences en utilisant un objectif à immersion d'eau.
3. Après réglage de l'objectif pour la visualisation suffisante de la microcirculation crémaster et avant l'injection des cellules, de définir de manière stochastique six veinules post-capillaires pour une analyse ultérieure de l'adhérence ferme sur les cellules souches.
4. Administrer les cellules souches marqués par fluorescence,dissous dans 200 ul de PBS, à 0,4 x 10 ⁶ cellules par injection, avec un total de cinq injections consécutives en utilisant le cathéter de l'artère fémorale et une seringue de 1 ml. Secouez l'échantillon de cellules avant la première injection.
5. les cellules souches de la fiche de laminage immédiatement après l'injection des cellules, de manière à définir "rouler" comme une réduction de plus de 50% de la vitesse de cellule le long de la paroi endothéliale en combinaison avec cellulaire typique "stick and release" mouvements. Effectuer le comptage des cellules souches de roulement et toutes les cellules souches passant une distance de veinules prédéfinie pendant 1 min d'observation après chaque injection. La quantité de laminage de cellules souches est exprimée en pourcentage de toutes les cellules qui passent. Ne pas compter les cellules présentant de brefs phénomènes d'attache aléatoires que les cellules de roulement.
6. Après la dernière injection de cellules de déterminer le nombre de cellules souches adhérentes en comptant fermement et exprimer la quantité par rapport à la surface de l'endothélium calculé èmee six veinules prédéfinis (diamètre x longueur x π) comme cellules adhérentes / mm ^2. L'adhérence est considérée comme ferme lorsque aucun mouvement de la cellule est détectable pendant 30 sec.
7. Après l'achèvement de la microscopie intravitale retirer délicatement le muscle crémaster et le stocker dans la correspondance à une analyse ultérieure (immunohistochimie ou biologie moléculaire). Sacrifier l'animal par dislocation cervicale. L'analyse des enregistrements de microscopie intravitale pour la quantification de la tige de laminage et l'adhésion cellulaire endothéliale ferme, ainsi que les paramètres hémodynamiques microvasculaires, telles que la vitesse du sang rouge des cellules (mm / sec), la longueur du navire (um), cuve diamètre (um), la vitesse de l'action de paroi (sec ^-1); doit être effectuée en ligne par un enquêteur aveugle pour le traitement de tissu expérimental respectif en utilisant un logiciel de traitement d'image.

Résultats

En général, l'interaction d'injecter directement des cellules souches ou progénitrices avec l'endothélium vasculaire au sein de la microcirculation du muscle crémaster est un événement rare et se produit exclusivement dans veinules post-capillaires (diamètre: 30 à 80 um). En raison de la fluorescence étiquetage laminage et les cellules souches fermement adhérentes peuvent être clairement quantifiés dans la séparation de leucocytes circulants endogènes dans les veinules observés (Figur...

Discussion

La microscopie à fluorescence intravitale permet la visualisation directe et une analyse quantitative des interactions cellules-souches endothéliales. Le modèle de muscle crémaster est particulièrement utile, étant donné que l'exposition et les techniques de microchirurgie visualisation intravitale ont été bien établies au cours de la recherche sur les interactions des leucocytes et l'endothélium différents composants chimiques peuvent être appliqués de façon sélective à du tissu cible par...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500