Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

Resumo

Microscopia intravital do cremaster microcirculação rato M. oferece um único e bem padronizados modelo in vivo para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas.

Resumo

Na era de protocolos de aplicação intravascular de células no contexto da terapia celular regenerativa, os mecanismos subjacentes à migração de células-tronco para nonmarrow tecido não foram completamente esclarecidas. Descrevemos aqui a técnica de microscopia intravital aplicada a microcirculação cremaster rato para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas in vivo. Microscopia intravital do cremaster M. tenha sido previamente introduzido no campo da pesquisa inflamatória por observação directa de interacção de leucócitos com o endotélio vascular. Desde tronco periférica suficiente e migração de células progenitoras inclui passos iniciais semelhantes de rolando e adesão firme ao endotélio forro é concebível aplicar o modelo cremaster M. para a observação e quantificação da interação de células-tronco administrados intravasculary com o endotélio. Como vários componentes químicos pode ser aplicada selectivamente ao alvo tquestão por meio de técnicas de superfusão simples, é possível estabelecer um requisito essencial do microambiente, para o recrutamento de células-tronco inicial para ocorrer em um organismo vivo fora da medula óssea.

Introdução

O objetivo do presente artigo é descrever a técnica de microscopia intravital (IVM), aplicada sobre a microcirculação cremaster rato para observação direta e análise de medula óssea migração de células-tronco periférica.

Regeneração de tecidos e órgãos O conceito atual de células-tronco com base envolve o homing de medula óssea células-tronco derivadas do tecido lesado ^1. Um passo crucial para a migração de células-tronco de sucesso inclui tronco interação célula com o endotélio local dentro do órgão lesionado seguido de migração transendotelial e, eventualmente, o enxerto de órgãos ^2. Análise intravital destas células-tronco - as interações de células endoteliais formam um parâmetro ideal para a quantificação de uma resposta regenerativa com células-tronco com base em diferentes contextos fisiopatológicos in vivo. Além disso, parece concebível, que, no futuro, a análise intravital da capacidade migratória das células estaminais p específicoopulations dentro de ambientes microcirculação padronizadas, pode ser aplicado antes avanço dessas populações para mais testes clínicos.

Microscopia intravital foi inicialmente desenvolvido para a observação e quantificação da interacção das células de leucócitos-células endoteliais in vivo, no campo da pesquisa inflamatória ^3. As primeiras gravações de sucesso de estudos de microscopia intravital foram relatados por Cohnheim já no século 19, estudando línguas e mesentério de rã sob um microscópio de luz ^4. Desde a sua primeira utilização IVM sofreu um desenvolvimento técnico enorme e hoje certos componentes essenciais formar os pré-requisitos para a realização de MIV quantitativa: (i) as preparações de tecidos que permitam o acesso óptico, (ii) as sondas moleculares que podem ser detectados por um microscópio, (iii ) um microscópio ligado a um sistema de detecção e (iv) a partir de sistemas de análise de computador que é capaz de extrair os parâmetros de interesse a partir dos dados de imagemset ^4.

Uma grande variedade de preparações de tecido tenha sido introduzida para estudos IVM incluindo os mesentério e no fígado do rato e na ratazana ^5, as câmaras de dobras cutâneas dorsal de rato e hamster ^6, a orelha de coelho e a bolsa jugal do hamster, para citar alguns.

No entanto, a seguir vamos nos concentrar no músculo cremaster mouse, o que representa um tecido ideal para observações intravital, como são possíveis preparação e visualização por um procedimento cirúrgico bem padronizado, e em geral não ocorrem problemas de artefatos de movimento. A preparação do músculo cremaster aberto foi realizada pela primeira vez em 1970 por Baez e colegas ^7. Originalmente descrito para ratos, tem sido adotado com sucesso também para o mouse ^8. Após estudos anteriores haviam se concentrado principalmente nas interações leucócitos com a parede do vaso, o nosso próprio grupo introduziu recentemente a preparação do músculo cremaster mouse como um valuable ferramenta para a visualização direta e análise quantitativa de interações célula-tronco do endotélio dentro de um microambiente definida ^9. Vários subpopulações de células estaminais têm sido estudada utilizando este modelo, incluindo murino células estaminais da medula óssea 133 ⁺ c-kit ⁺ de medula óssea em células estaminais e células estaminais mesenquimais, assim como humana CD ^10-12. A seguir ao isolamento de células de medula óssea do dador e marcação fluorescente para visualização, as células estaminais são aplicadas selectivamente na microcirculação cremaster utilizando uma injecção arterial através da artéria femoral, evitando-se assim qualquer aprisionamento de células dentro de órgãos remotos. Além disso, o modelo do músculo cremaster é particularmente útil uma vez que várias quimiocinas potencialmente medeiam a migração de células estaminais local dentro das respectivas configurações, pode ser topicamente aplicada ao tecido alvo através de uma simples técnica de superfusão.

Protocolo

O protocolo de todo após o isolamento das células leva cerca de 2 horas.

1. Microsurgical Preparação

1. Realizar o isolamento de células estaminais da medula óssea do dador e marcação fluorescente da subpopulação isolado de acordo com protocolos padronizados ^9,12 aceitam as células repousar durante o tempo que o animal é realizada a operação. Para marcação fluorescente recomendamos CFDA (Carboxifluoresceína diacetate éster succinimidyl).
2. Anestesiar um rato macho pesando 20-25 g, com cetamina (75 mg / kg) e xilazina (2,5 mg / kg). Durante os procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, anestesia deve ser mantida por suplementos (10% de injecção inicial, ip), conforme necessário (normalmente a cada 30-60 min).
3. Raspe suavemente a face anterior do escroto direito, bem como a coxa e virilha direita. Colete todos perdem o cabelo com um cotonete umedecido. Coloque o mouse lado ventral em um palco de visualização plexiglass e fixar a taxat usando cortina elástica. A fase é feito à medida, que consiste em uma placa de base e uma segunda placa da extremidade caudal da placa de base para a elevação de ambas as pernas e o escroto. Coloque a fase de uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Após a fixação no palco, coloque o animal sob um microscópio de operação e executar as seguintes etapas da operação por meio de 10 - a ampliação de 16 vezes.
4. Faça a incisão inicial usando uma tesoura de pele na coxa direita, logo anterior dos vasos femorais do joelho até a virilha.
5. Identificar a artéria femoral e segui-lo proximamente, mobilizando a artéria de tecidos moles circundantes. Identificar e cortou um grande ramo para o testículo esquerdo usando termocautério. Posteriormente colocar uma sutura de estadia superficialmente no testículo esquerdo. Tração suave vai facilitar ainda mais a mobilização proximal da artéria femoral.
6. Após a conclusão da mobilização proximal, identificar e cortar um grande ramo executando medially na coxa por termocautério. A partir de então ligar a artéria femoral, na parte distal da coxa direita. Tração suave na ligadura vai ajudar ainda mais a preparação.
7. Rode-se agora a atenção para a artéria femoral proximal e novamente colocar uma sutura em torno da artéria como proximalmente possível. Prepare um nó, mas não amarrá-lo para baixo ainda. Aplicar tração suave para a sutura e criar um kinking arterial.
8. Depois de estabelecer a dobras, inciso artéria é cuidadosamente usando uma microtesoura. Tome especial cuidado para não danificar a veia femoral.
9. Inserir um microcateter preparado (diâmetro interno 0,28 milímetro) através da incisão. O cateter deve ser deaired (cloreto de sódio a 0,9%, NaCl) e ligado a um inserção antes seringa de 1 ml.
10. Após a inserção com êxito do cateter, cuidadosamente solte o enroscamento, a fim de facilitar a passagem do cateter. Fluxo arterial deve ser imediatamente visível dentro do cateter. Delicadamente, avançar o cateter alguns milímetross além do kinking anterior. A partir de então, amarrar a ligadura preparado para fixação do cateter.
11. Lavar cuidadosamente o cateter (0,9% NaCl) e aspirado para confirmar a posição correta. Utilizar um pedaço de fita adesiva para prender ainda mais o cateter para a fase de operação.
12. Após a fixação adequada, colocar o cateter de lado para as seguintes etapas de preparação do músculo cremaster. Aplicar a lavagem regular e aspiração do cateter cada 5-10 min, a fim de impedir a formação de coágulos.
13. Vire a atenção agora para o escroto direito e fazer uma incisão, cortando a pele e fáscia acima do aspecto ventral do escroto direito. Tome cuidado para não tocar no tecido subjacente com quaisquer instrumentos.
14. Estender a incisão até a dobra inguinal e caudal para a extremidade distal do escroto.
15. Tecidos cuidadosamente separado subjacente suave e conjuntivo acima do saco cremaster, sem tocá-lo. Identificar a extremidade distal do cremaster, e colocar uma sutura de estadia a slightly estender o músculo. Ressecar agora tecido mole remanescente sob o saco muscular, puxando suavemente o músculo caudal e anteriormente.
16. Após a separação completa do tecido conjuntivo, abra o saco cremaster em um ponto na borda cranial com uma tesoura. Estender a incisão desta abertura para baixo a extremidade distal do músculo.
17. Selar a pequena embarcação que liga o testículo eo cremaster usando termocautério, depois cortar as conexões restantes entre o músculo eo testículo com uma tesoura.
18. Deixe de lado o testículo, fora do campo de microscopia.
19. O cremaster abriu agora está na horizontal no palco. Coloque quatro 6-0 estadia prolene nas bordas do tecido e corrigi-los com caimento elástico, a fim de espalhar o tecido do músculo cremaster. De agora em diante continuamente humedecer o tecido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma seringa de 1 ml (Figura 1).
20. Permitir agora a preparação para descansar por 15 min. Posteriormente injetar0,05-0,1 ml de 1% de Rodamina-dextrano através da artéria femoral esquerda para o realce do contraste da microvasculatura. Se algum quimiocinas ou agentes inflamatórios estão previstas para aplicação, você deve agora topicamente umedecer o músculo com o respectivo reagente usando uma seringa de 1 ml. No caso de uma experiência de controlo, continuar humedecendo com PBS.

2. Microscopia intravital

1. Manter o rato fixado na fase de operação e mover-se sob um microscópio de fluorescência modificado para epi-iluminação e ligada a uma câmara CCD (charge-coupled device) da câmara de vídeo. Tome especial cuidado para não deslocar o cateter de artéria femoral.
2. Realizar experimentos usando uma objetiva de imersão em água.
3. Depois de ajustar o objetivo de visualização suficiente da microcirculação cremaster e antes da injeção das células, estocasticamente definir seis vênulas pós-capilares, para posterior análise da aderência de células-tronco firme.
4. Administrar as células estaminais marcado com fluorescentes,Dissolveu-se em 200 ul de PBS, a 0,4 x 10 ⁶ culas por injecção, com um total de cinco injecções consecutivas, utilizando o cateter da artéria femoral e uma seringa de 1 ml. Agitar a amostra de células antes da primeira injecção.
5. Células estaminais da ficha de rolamento imediatamente após a injecção das células, definindo, assim, "rolar" como uma redução de mais de 50% da velocidade da célula ao longo do revestimento endotelial em combinação com típico celular "vara e solte" movimentos. Realizar contagem de células-tronco rolantes e todos as células-tronco que passam a uma distância pré-definida venular durante 1 min de observação após cada injeção única. A quantidade de rolamento de células estaminais é expressa como percentagem de todas as células que passam. Não conte células exibindo fenômenos amarrar breves aleatórios como células de rolamento.
6. Após a última injecção de células determinar o número de células estaminais, firmemente aderentes por contagem e expressar a quantidade em relação à superfície endotelial de th calculadoe seis vênulas predefinidos (diâmetro x comprimento x π) como células aderentes / mm ^2. Adesão firme é considerado quando há movimento celular é detectável por 30 seg.
7. Após a conclusão da microscopia intravital remova cuidadosamente o músculo cremaster e armazená-lo em correspondência para posterior análise (imunohistoquímica e biologia molecular). Sacrificar o animal por deslocamento cervical. A análise de microscopia intravital gravações para a quantificação de células estaminais de rolamento e adesão celular endotelial firmes, bem como a hemodinâmica microvasculares, tais como a velocidade do sangue de células vermelhas (mm / s), o comprimento do vaso (mm), o diâmetro dos vasos (mM), a taxa de partes de parede (seg ^-1); deve ser realizada off-line por um investigador cego para o respectivo tratamento do tecido experimental utilizando um software de processamento de imagem.

Resultados

Em geral, a interação de injetado diretamente as células-tronco ou progenitoras com o endotélio vascular dentro da microcirculação músculo cremaster é um evento raro e ocorre exclusivamente em vênulas pós-capilares (diâmetro: 30-80 mm). Devido à fluorescência rotulagem de rolamento e as células-tronco, firmemente aderentes pode ser quantificada claramente na separação de leucócitos circulantes endógenos nas vénulas observados (Figura 2).

As condições da ...

Discussão

Microscopia de fluorescência intravital permite a visualização direta e análise quantitativa de interações célula-tronco do endotélio. O modelo do músculo cremaster é particularmente útil, já que a exposição de microcirurgia e técnicas de visualização intravital têm sido bem estabelecidos durante a investigação sobre as interacções de leucócitos-endotélio e os vários componentes químicos podem ser selectivamente aplicado ao tecido alvo através de uma simples técnica de superfusão. Devi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500