Bir atıl gaz püskürtüsünün kullanılması Uygulanan Hücrelerinin Permeabilization

Özet

Bu protokol, bir atıl gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelerin geçici nüfuziyet için bir yöntem tarif etmektedir. Bu teknik, plazma zarını bozan mekanik kuvvetlerin kullanılması ile yapışık memeli hücrelerine genetik malzeme ve biyomoleküllerin transferini kolaylaştırır.

Özet

Çeşitli hücre transfeksiyon teknikleri var ve bu üç geniş kategoriye ayrılabilir: viral, kimyasal ve mekanik. Bu protokol, geçici olarak hücrelerin içine normal olarak geçirgen makromoleküllerin transferini kolaylaştırmak için bir inert gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelere nüfuz edilebilir kılınması için mekanik bir yöntemi tarif etmektedir. Bu teknik, mikro gözenek geçici oluşumu ile sonuçlanan, yapışkan hücrelerin plazma zarı üzerinde kesme kuvvetleri aktarmanın çalışır inanıyoruz. Bu gözenekler oluşturulur sonra, hücreler daha sonra, genetik madde ve diğer biyomoleküllerin geçirgendir. Kullanılan mekanik kuvvetlerin kendi alt-tabakaya kalıcı ya da zarar ayırma hücre riski yoktur. Teknik etkili olan atıl gaz dinamiği dar bir aralık, bu nedenle bulunmaktadır. Bir atıl gaz jet HeLa, HEK293 ve insan abdominal aort endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre çizgileri yapışkan geçirimli de etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, p için uygunbunun gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda potansiyel olarak araştırma ve kullanılabilir gösteren in vivo olarak gösterdiği gibi, in vitro ve hem de yapışık hücre ermeabilization. Ayrıca, değerli bir araştırma aracı olarak kanıtlamak olabilir ki, uzaysal olarak kısıtlayıcı bir şekilde hücrelerin geçirgenleştiren avantajına sahiptir.

Giriş

Biyotıbbın evrim ve hücre mekaniği anlayışı ile, hücre içine biyomoleküllerin teslim birçok araştırma alanları ve tıbbi tedaviler için hayati hale gelmiştir. Farklı teknikler plazma zarı ve hücre sitozolüne yabancı molekülleri tanıtmak için geliştirilmiştir. Viral, kimyasal ya da mekanik teknikler: Bunlar genellikle ya olarak sınıflandırılabilir. Viral teknikleri, viral vektörleri ¹ kullanarak, RNA ve DNA gibi genetik malzemeyi transfekte olabilir. Viral teknikleri ancak bunlar immün ve enflamatuar reaksiyonlar ² için potansiyel var, bazı hücre kuşaklarında yüksek verimliliğe sahip olma eğilimindedir. Genel kimyasal transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat ^{3, 4} bakteriyel ekzotoksin ve lipofeksiyon ⁵ ile çökelmesini içerir. Bu teknikler etkili olduğu kanıtlanmıştır, ancak bazı sorunlar, hücre toksisitesi ve non-özgüllük olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, bu tür kalsiyum fosfata gibi tekniklere nadiren çökelme primer hücrelerde ^6, en fazla% 70, ancak sadece belli hücre hatlarında transfeksiyon verimliliği sahip olduğu tespit edilmiştir. Artan araştırma çabaları, özellikle klinik kullanımı ve DNA işleyişi çalışma için çeşitli tedaviler tasarımı durumunda, primer hücrelerin içine koymak ediliyor gibi bu notun olduğunu.

Mekanik uyarıcılara yoluyla hücre zarının zamansal bozulması hücre içine yabancı moleküllerin sokulması için bir alternatiftir. Teknikler şunlardır: molekül ⁷ mikroenjeksiyon, membran ^8,9 bozmak için bir elektrik alanı kullanılarak elektroporasyon, sonoporation ile bağlı parçacıklar sürgünler "gen tabancası" ile gösterildiği gibi, hücre ^{zarını, 10-12,} partikül bombardımanı bozmak için ultrason dalgaları kullanarak hücrenin ¹³ içine genleri, ve son zamanlarda, memeli hücreleri geçici olarak ^14,15 permeabilize gösterilmiştir akışkan kesme stresi uygulaması. Her ne kadar mekanikal yöntemleri yukarıda belirtilen sorunların bazılarını önlemek için, tipik olarak daha düşük verim ve son derece karmaşık ve uzman düzeneklerinin eşlik eder. Bir atmosferik basınçta ışıltılı tahliye meşale (APGD-t) yüzeyler işlevselleştirilmesiyle ve in vitro ¹⁶ yapışık hücreleri ayırmanın ilk hedefi ile McGill de geliştirilmiştir. Tesadüfen çok kullanılan canlı / ölü leke nasılsa bir geçirimli madde eklenmeden hücreleri tarafından alınan edildiğini keşfedildi. Ayrıca, bu sadece meşale yolu ile maç oldu kuyu kısıtlı alanlarda meydana gelmiş gibiydi. APGD-t permeabilization yetenekleri soruşturma devam etti ve kontrol çalışmaları, bu uyarımı olmadan plazma taşıyıcı atıl gaz püskürtüsü da permeabilize hücrelerin mümkün olduğu bulunmuştur. Bu plazma jeti tarafından oluşturulan reaktif türler geçici membran fonksiyonu bozulmuş ilk hipotezi çeliştiğini ve önerilen basit mekanik olduğunucal kuvvetler hücre geçirgenliği neden için yeterli idi. Buradan itibaren, çalışmalar denemek ve ölçmek ve Permeabilization inert gaz jetinin etkinliğin yanı sıra tranfeksiyon yetenekleri ¹⁶ bakmak karakterize bizim laboratuvarda devam etti.

Bu çalışmalar sayesinde, mikro-plazma membranında gerçek biçimde yapmak olduğu bulunmuştur ve bu gözeneklerin yaklaşık 5 saniye ¹⁵ içinde yeniden mühürlemek için eğilimindedir. Bir piliç embriyo koriyoalantoik zara in vitro ve in vivo olarak tekniğin yarar göstermiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. LabView Programının Geliştirilmesi

1. Bir kütle akış kontrol cihazı (MKS M100B Mass-Flo Controller) kesin bir gaz akış oranı sağlamak için helyum gazı hattına bağlanmıştır. Bu birim, 0 ve 5 V LabView programındaki bir kontrol döngüsü herhangi bir zamanda gerekli voltaj tespit arasında değişen bir giriş gerilimi ile kontrol edilir. Bilgisayar ve arayüz arasındaki kütle akış kontrolörü bir veri toplama cihazı (NI USB-6009) tarafından gerçekleştirilen ve 12 V güç kaynağı kütle akış kontrol için güç sağlar.
2. İki pozisyonlama lineer slaytlar 6-plaka, her yön için bir hareketini kontrol etmek için kullanılır. Her derleme bir adım motor ile birleştiğinde bir MA15 serisi Velmex Unislide Meclisi oluşur ve her iki meclisleri Motor Kontrol Stepping tek Velmex VXM tarafından kontrol edilir. Kontrolör, her motorun manuel koşu için izin verir veya harici seri bir komut kabul, kombinasyonu spesifik hareket p izinatterns. Çeşitli desenler sadece istenilen meşale hızı hem de yol boyutları sağlamak için kullanıcı gerektiren, LabView programa programlanabilir.

2. Ekipman hazırlanması

1. Helyum silindiri ve regülatörü hem açın.
2. Motor kontrol açın.
3. LabView programını açın ve tüm koşullarını doğrulayın.
4. Platform merkezli olduğundan emin olun. , Her kontrol motor aşamada bakmak ve her vagon aşama sonunda da yakın olmadığını doğrulamak için. Program merkezi arabaları ya da elle motor kontrol önündeki koşu denetimleri kullanarak ayarlayın ya.
5. Bu günün ilk çalışma ise, kurulum düzgün çalıştığından emin olmak için, hücreleri olmadan bir kez programı çalıştırmak için tavsiye edilir.

3. Kılcal gaz püskürtüsü Nozul Yükseklik hazırlanması

1. Tutucudan kılcal çıkarın ve yükseklik kadranı sıfır.
2. 6-delikli plaka o yerleştirinn platformu.
3. Değiştirin ve kapak kayma edecek kadar kuyunun dibine gaz jet kılcal daha düşük. Tutucuya kılcal elde edin.
4. Yükseklik kadranının kullanılması, kılcal 3 mm yükseltmek. Kılcal bazında bu yüksekliğe işaretleyin.
5. Güvenli bir yüksekliğe kılcal kaldırın ve daha sonra 6-çukurlu plaka çıkarın.

4. Hücre Permeabilization Protokol

1. Cam kapak üzerinde izdiham Kültür yapışkan hücre hattı, standart kültür teknikleri kullanılarak, 6-çukurlu bir plaka içerisinde kayar. HeLa hücreleri için, tohum 6-çukurlu, oyuk başına 2 x 10 ⁵ hücre plakaları ve tedavi öncesi 48 saat için inkübe edilir.
2. İstenen vektörü içeren çözeltinin uygun hacmi hazırlayın. HrGFPII-1, 1 x PBS içinde 50 ng / ul 'lik bir konsantrasyon HeLa hücrelerinde güçlü bir floresan sinyali transfeksiyondan sonra 24 saat için, içerir. Dekstran çalışmaları için, 10 kDa, yeşil fluoresan dekstran 80 ug / ml önerilir. Bundan sonra, bu çözelti, adlandırılacaktırs "vector çözüm".
3. Kuyudan hücre kültürü ortamını çıkarın ve 1x PBS ile üç kez çalkalayın.
4. Kuyuya aşama 4.2 'de hazırlanan vektör çözeltisi 1.370 ul Pipet. Bu, yaklaşık 1.3 mm'lik bir derinliğe sıvı ile sonuçlanmalıdır.
5. Platformun merkezinde vektör çözeltisi içeren kuyu yerleştirin. Sürgünün üzerinde 3 mm'lik bir meme yüksekliğinin gösteren önceden işaretli seviyeye gaz püskürtme memesi indirin.
6. LabView programında helyum akış hızını ayarlamak ve kullanılacak istenilen hareket desen seçin. Zaman Permeabilization protokolü başlamak için hazır "Çalıştır" seçeneğini seçin. Kütle akış kontrol cihazı için gerekli akış oranını temin etmek üzere hazırlanıyor sırasında bir ilk gecikme süresi olacaktır. Uygun akış hızı ulaşıldığında, LabVIEW programı istenen permeabilization desen iyi hareket için kademeli motora aktive edecektir. Platformu durduktan sonra, yaklaşık 30 saniye bekleyin ve vektör çözüm kaldırmak.Not: Optimal permeabilizasyon kılcal çapına bağlı olarak, meme çıkışında 100-200 Pa bir dinamik basınç yakınında meydana gelir.
7. 1x PBS ile de üç kez yıkayın.
8. Taze kültür ortamı ile iyi doldurun.
9. Deneylerin istenilen sayıda 4.6 - 4.3 adımları tekrarlayın. Not: onlar üzerinde yürütülüyor gaz jetsız vektör çözümü ile dolu olan kuyuların oluşmaktadır kontrol örnekleri yer alıyor emin olun. Adımlara 4.5 ve 4.6 için devam yaklaşık olarak 1 dakika boyunca, kontrol çukurlarındaki çözelti bırakın.
10. Bir hrGFP transfeksiyon deneyi çalışan ise, transfekte edilmiş hücreler tarafından malzeme transkripsiyonu izin vermek için 24 saat boyunca inkübatör 6-çukurlu plaka döndürür. Bir dekstran permeabilizasyon deney çalışan takdirde, yaklaşık 15 dakika boyunca inkübatör 6-çukurlu plaka döndürür.

5. Hücre Görüntüleme

1. İsterseniz, hemen önce görüntüleme, hücre ölümünü değerlendirmek için uygun ölü / canlı leke ile counterstain.
2. Approp ile Görüntü hücrelertransfeksiyon / permeabilizasyon etkinliğini araştırmak için yaklaşımlarına yön mikroskop.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bir 0.86 mm iç çap kapiller ile bir helyum gaz püskürtüsünün kullanılarak 10 kDa yeşil floresan dekstran ile HeLa hücre Permeabilization Şekil 1 'de gösterilmiştir. Hücreler hemen hücre ölümünü görselleştirmek için 2 ul / ml EthD-1 çözeltisi (LIVE / DEAD Canlılık / Sitotoksite Kit) ile geçirgenleştirmeden sonra zıt. Hemen counterstaining ardından, kapak fişleri monte edilmiş ve görüntülenmiştir. Bu şekil, bir kontrol numunesi ile karşılaştırıldığında, ü?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Inert gaz jet permeabilizasyon yapışık hücre transfeksiyonu için yararlı bir tekniktir. Bu, zararlı kimyasal maddeler ya da viral vektörler için olan ihtiyacı ortadan kaldırır mekanik kuvvetlerin kullanımı ile hücrelere biyomoleküllerin aktarma yeteneği sağlar. Teknik potansiyel araştırmacılara ve klinisyenlere hassas hücreleri transfect verimli ve nispeten basit bir yol verebilir. Nüfuziyet seçiciliği de araştırmacılar sadece çok uygulamalarda yararlı olabilir, tek bir koloni bazı hücrel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable	Life Technologies Inc.	D22910	dextran for permeabilization experiments
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies Inc.	L3224	for counterstaining of mammalian cells
Prolong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	for mounting slides when imaging
Ultra High Purity Helium	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	for HeLa cells
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140079	For DMEM media
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122	For DMEM media
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x			Produced in lab
			Table 1. List of required reagents
6-Well Clear TC-Treated Microplates	Corning	3506
#1 22 x 22 Coverslips	Fisher	12-542B
Glass Capillaries	World Precision Instruments		WPI Sizing Information
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Controller	MKS	M100B01314CS1BV	Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply
USB-6009 DAQ Device	National Instruments	779026-01
UniSlide Assembly with stepping motor and controller	Velmex		Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller
			Table 2. List of required equipment