Пермеабилизации из прикрепленных клеток с использованием инертного газа Jet

Резюме

Этот протокол описан способ временного проницаемости из адгезивных клеток с использованием инертного газовой струи. Этот метод облегчает перенос генетического материала и биомолекул в прикрепленных клетках млекопитающих путем использования механических сил, чтобы разрушить плазматическую мембрану.

Аннотация

Различные методы клеточной трансфекции существуют и они могут быть разбиты на три основные категории: вирусные, химических и механических. Этот протокол описывает механический способ временно прилипшие клетки проницаемыми с использованием инертного газа струи, что может облегчить передачу нормально не проницаемых макромолекул в клетки. Мы считаем, что этот метод работает путем придания силы сдвига на плазматической мембране адгезивных клеток, что приводит к временному формированию микропор. После того как эти поры создаются, клетки затем проницаемой для генетического материала и других биомолекул. Механические силы, участвующие действительно рискуете навсегда повреждения или отсоединение клеток от субстрата. Существует, следовательно, узкий диапазон инертных газовой динамики, где метод является эффективным. Инертный струя газа оказалась эффективной при permeabilizing различные прилипшие клеточных линий, включая HeLa, HEK293 и брюшной аорты эндотелиальных клеток человека. Этот протокол подходит для рermeabilization из прикрепленных клеток в пробирке и, как мы показали, в естественных условиях, показывает, что это может быть использовано для исследования и потенциально в будущих клинических применений. Он также имеет то преимущество, permeabilizing клетки в пространственно ограничительно, которые могли бы оказаться ценным инструментом исследования.

Введение

С развитием биомедицины и понимания механики клеток, поставка биомолекул в клетки стал жизненно важным для многих областях исследований и медицинских методов лечения. Различные методы были разработаны, чтобы ввести чужеродных молекул через плазматическую мембрану и в цитозоле клетки. Они могут быть в общем классифицировать как: вирусные, химических или механических методов. Вирусные методы могут трансфекции генетического материала, такие как РНК и ДНК с использованием вирусных векторов ^1. Вирусные методы, как правило, имеют высокую эффективность в определенных клеточных линиях, однако у них есть потенциал для иммунных и воспалительных реакций ^2. Общие методы химической трансфекции включают осаждение фосфатом кальция ^3, бактериальных экзотоксинов ⁴ и липофекцией ^5. Эти методы доказали свою эффективность, однако, некоторые проблемы возникают, таких как клеточной токсичности и отсутствие специфичности. Кроме того, такие методы, как Phosphat кальцияе осадки были обнаружены эффективности трансфекции до 70%, но только в определенных клеточных линий, редко в первичных клеток ^6. Это следует отметить, что при более научно-исследовательских работ в настоящее время введены в первичных клеток, особенно в случае проектирования различные процедуры для клинического применения и изучения функционирования ДНК.

Временное нарушение клеточной мембраны с помощью механических раздражителей является альтернативой для введения чужеродных молекул в клетки. Методы включают: микроинъекции молекул ^7, электропорацию с помощью электрического поля, чтобы разрушить мембрану ^8,9, sonoporation с помощью ультразвуковых волн нарушить клеточную мембрану ^10-12, бомбардировки частицами, как показано на "генной пушки", который снимает частицы, связанные с гены в клетку ^13, а в последнее время, применение напряжения сдвига жидкости, что, как было показано временно проницаемыми клеток млекопитающих ^14,15. Хотя механикаль методы избежать некоторых из вышеупомянутых вопросов, они, как правило, сопровождается низкой эффективностью и очень сложных и специализированных установок. Свечение давление на выходе горелки атмосферного (APGD-т) была разработана в McGill с начальным целью функционализации поверхности и снятие прилипшие клетки в пробирке ^16. По счастливой случайности, было обнаружено, что живой / мертвый пятно используется как-то принимаются в клетками без permeabilizing агент добавляются. Кроме того, это, казалось, произошли только в ограниченных областях скважин, которые произошли в соответствии с пути факела. Исследование в проницаемости возможностей APGD-т продолжали и в контрольных исследований было установлено, что носитель инертный газ струя плазмы без возбуждения также был в состоянии проницаемыми клеток. Это противоречило первоначальную гипотезу о том, что активные формы, созданные с помощью плазменной струи временно нарушенной функции мембран и предложил просто механическические силы было достаточно, чтобы вызвать проницаемости клеточной мембраны. Отсюда, исследования продолжались в нашей лаборатории, чтобы попытаться количественно определяет и характеризует эффективность пермеабилизации инертного газовой струи, а также взглянуть на своих возможностей трансфекции ^16.

С помощью этих исследований было обнаружено, что микропоры сделать на самом деле формы в плазматической мембране, и эти поры имеют тенденцию запечатать в течение примерно 5 секунд ^15. Мы продемонстрировали полезность этой техники в пробирке и в естественных условиях в хорионаллантоисной оболочки куриного эмбриона.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Развитие LabView программы

1. Контроллер массового расхода (MKS M100B Масс-Flo контроллер) прикреплен к газовой линии гелия, чтобы обеспечить точную скорость потока газа. Это устройство управляется входным напряжением в диапазоне от 0 до 5 В. контур управления в программе LabView определяет необходимое напряжение в любой момент времени. Взаимодействие между компьютером и регулятор массового расхода производится с помощью сбора данных устройства (NI USB-6009), и источник питания 12 В обеспечивает питание контроллера массового расхода.
2. Два позиционирование линейных слайды используются для управления движением в 6-луночный планшет, по одному на каждую сторону. Каждый узел состоит из MA15-серии Velmex Unislide Ассамблеи в сочетании с шаговым двигателем, и оба сборки под контролем одного Velmex VXM шаговый двигатель контроллер. Контроллер позволяет для ручного бега каждого двигателя или принимает строку внешних последовательных команд, сочетание которых позволяют специфическое движение рatterns. Несколько моделей могут быть запрограммированы в программе LabView, требуя от пользователя предоставить только нужную скорость горелки, а также размеры путей.

2. Подготовка оборудования

1. Откройте как цилиндр гелия и регулятор.
2. Включите контроллер двигателя.
3. Откройте программу LabView и проверить все условия.
4. Убедитесь, что платформа находится в центре. Чтобы проверить, посмотрите на каждом этапе двигателя и убедиться, что каждый вагон не рядом или стадии конце. Либо есть программа центр вагоны или вручную настроить с помощью элементов управления бег на передней панели контроллера двигателя.
5. Если это первый запуск дня, рекомендуется запускать программу один раз, без клеток, чтобы обеспечить установка работает правильно.

3. Подготовка газа Джет капиллярного сопла Высота

1. Снимите капилляр из держателя и обнулить высоты диска.
2. Поместите диск сцепления Ø 6-ан платформа.
3. Заменить и нижней газовой струи капилляр в нижней части скважины, пока не достигнет покровное стекло. Закрепите капилляр в держатель.
4. Использование высоты диска, поднять капиллярную 3 мм. Отметить эту высоту на капиллярной базы.
5. Поднимите капилляр к безопасной высоте, а затем удалить пластину 6-а.

4. Проницаемости клеточной мембраны протокол

1. Культура прилипший клеточной линии до слияния на стеклянной крышкой скользит в 6-луночный планшет с использованием стандартных способов культивирования. Для HeLa клеток, семян 6-луночные планшеты с 2 х 10 ⁵ клеток на лунку и инкубировать в течение 48 часов до начала лечения.
2. Подготовка соответствующий объем раствора, содержащего желаемый вектор. Для hrGFPII-1, концентрация 50 нг / мкл в 1 × PBS обеспечивает прочную флуоресцентного сигнала в клетках HeLa с 24 часами после трансфекции. Для декстрана исследований, 80 мкг / мл 10 кДа зеленого флуоресцентного декстрана рекомендуется. В дальнейшем это решение будет называтьсяс "вектор решения".
3. Удалить питательных сред клеток из хорошо и промыть три раза 1x PBS.
4. Внесите 1370 мкл вектора решения, полученного на стадии 4.2 в скважину. Это должно привести к жидкой глубине около 1,3 мм.
5. Поместите хорошо, содержащий векторную решение в центре платформы. Опустите газовой струи сопла к ранее отмеченного уровня, указывающего высоту сопла 3 мм над горкой.
6. Установить расход гелия в программе LabView и выберите нужный шаблон движения, которые будут использоваться. Выберите "Выполнить", когда будете готовы, чтобы начать протокол пермеабилизации. Там будет начальный период задержки, в течение которого регулятор массового расхода готовится для обеспечения необходимой скорости потока. Как только соответствующая скорость потока была достигнута, программа LabView активирует шаговые двигатели для перемещения скважины в желаемой структуре пермеабилизации. Как только платформа остановилась, подождите примерно 30 секунд и снимите вектор решения.Примечание: Оптимальное пермеабилизации происходит вблизи динамическом давлении от 100 до 200 Па при выходе из сопла, в зависимости от диаметра капилляра.
7. Хорошо промыть три раза 1x PBS.
8. Хорошо Залейте свежее питательных сред.
9. Повторите шаги 4,3 - 4,6 для нужного количества экспериментов. Примечание: Не забудьте включить контрольные образцы, которые состоят из скважин загружаемого с вектором решения без газовой струи наезда них. Оставьте раствор в контрольных скважин в течение приблизительно 1 мин, затем перейдите к шагам 4.5 и 4.6.
10. Если работает под трансфекции эксперимент hrGFP, возвращение 6-луночный планшет в инкубаторе в течение 24 часов, чтобы позволить трансфицированных материал для транскрипции в клетках. Если работает декстрана эксперимент пермеабилизации, вернуться 6-луночный планшет в инкубатор в течение 15 мин.

5. Изображений сотовый

1. При желании, непосредственно перед томография, контрастирующая с соответствующей живой / мертвый пятно для оценки гибели клеток.
2. Клетки Изображение с appropriate микроскоп для исследования трансфекции / пермеабилизации эффективность.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Пермеабилизации из HeLa клеток с 10 кДа зеленого флуоресцентного декстрана с помощью газовой струи гелия с внутренней капилляра диаметром 0,86 мм показан на рисунке 1. Клетки контрастно сразу после пермеабилизации с 2 мкл / мл EthD-1 раствора (LIVE / DEAD Жизнеспособность / цитотоксичности ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Инертный струя газа пермеабилизации является полезным методом для единомышленником трансфекции клеток. Она обеспечивает возможность передачи биомолекул в клетки с использованием механических сил, что исключает необходимость в потенциально вредных химических веществ или вирусных ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable	Life Technologies Inc.	D22910	dextran for permeabilization experiments
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies Inc.	L3224	for counterstaining of mammalian cells
Prolong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	for mounting slides when imaging
Ultra High Purity Helium	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	for HeLa cells
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140079	For DMEM media
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122	For DMEM media
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x			Produced in lab
			Table 1. List of required reagents
6-Well Clear TC-Treated Microplates	Corning	3506
#1 22 x 22 Coverslips	Fisher	12-542B
Glass Capillaries	World Precision Instruments		WPI Sizing Information
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Controller	MKS	M100B01314CS1BV	Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply
USB-6009 DAQ Device	National Instruments	779026-01
UniSlide Assembly with stepping motor and controller	Velmex		Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller
			Table 2. List of required equipment