Permeabilizzazione delle cellule Aderito utilizzo di un gas inerte Jet

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per la permeabilizzazione temporanea di cellule aderenti mediante un getto di gas inerte. Questa tecnica facilita il trasferimento di materiale genetico e biomolecole in cellule di mammifero aderenti mediante l'utilizzo delle forze meccaniche di distruggere la membrana plasmatica.

Abstract

Esistono varie tecniche di trasfezione cellulare e questi possono essere suddivisi a tre grandi categorie: virale, chimici e meccanici. Questo protocollo descrive un metodo meccanico per permeabilize temporalmente cellule aderenti mediante un getto di gas inerte che può facilitare il trasferimento di normalmente macromolecole non permeabili nelle cellule. Crediamo che questa tecnica funziona impartendo forze di taglio sulla membrana plasmatica di cellule aderenti, causando la formazione temporanea di micropori. Una volta che questi pori sono creati, le cellule sono poi permeabile al materiale genetico e altre biomolecole. Le forze meccaniche coinvolte non corrono il rischio di cellule permanentemente danneggiare o staccano dal loro substrato. Esiste, quindi, una ristretta gamma di dinamica dei gas inerti dove la tecnica è efficace. Un getto di gas inerte è dimostrata efficace in permeabilizzante varie linee cellulari aderenti, compresi HeLa, HEK293 e cellule endoteliali dell'aorta addominale umani. Questo protocollo è appropriato per la permeabilization di cellule aderenti sia in vitro che, come abbiamo dimostrato, in vivo, mostrando esso può essere usato per la ricerca e potenzialmente in future applicazioni cliniche. Essa ha anche il vantaggio di permeabilizzante cellule in modo spazialmente restrittiva, che potrebbe rivelarsi un valido strumento di ricerca.

Introduzione

Con l'evoluzione della biomedicina e la comprensione della meccanica delle cellule, la consegna di biomolecole nelle cellule è diventato di vitale importanza per molti settori di ricerca e le terapie mediche. Diverse tecniche sono state sviluppate per introdurre molecole estranee attraverso la membrana plasmatica e nel citoplasma cellulare. Questi possono essere generalmente classificati come: tecniche virale, chimici o meccanici. Tecniche virali possono trasfettare materiale genetico come RNA e DNA utilizzando vettori virali ^1. Tecniche virali tendono ad avere alte efficienze in certe linee cellulari, tuttavia hanno il potenziale di reazioni immunitarie e infiammatorie ^2. I metodi più comuni di transfezione chimici includono precipitazione con fosfato di calcio ^{a 3,} esotossine batteriche ⁴ e lipofezione ^5. Queste tecniche hanno dimostrato di essere efficace, tuttavia, alcuni problemi sorgono come tossicità cellulare e non specificità. Inoltre, tecniche come phosphat calcioe precipitazione sono stati trovati per avere efficienze di trasfezione fino al 70%, ma solo in certe linee cellulari, raramente in cellule primarie ^6. Questo è da notare come crescenti sforzi di ricerca sono stati messi in cellule primarie, soprattutto nel caso di progettazione di vari trattamenti per uso clinico e lo studio del funzionamento del DNA.

Interruzione temporale della membrana cellulare attraverso stimoli meccanici è un'alternativa per introdurre molecole estranee nelle cellule. Tecniche includono: microiniezione di molecole ^7, elettroporazione usando un campo elettrico di distruggere la membrana ^8,9, sonoporazione utilizzando onde ad ultrasuoni per distruggere la membrana cellulare ^10-12, bombardamento di particelle come dimostrato dal "gene gun", che spara particelle legate con geni nella cella ^13, e, più recentemente, l'applicazione di un fluido sforzo di taglio che ha dimostrato di permeabilize temporalmente cellule di mammifero ^14,15. Sebbene meccanicometodi AL evitare alcuni dei problemi di cui sopra, sono in genere accompagnati da efficienze inferiori e configurazioni molto complesse e specializzate. Una torcia scarica a bagliore a pressione atmosferica (APGD-t) è stato sviluppato presso la McGill con l'obiettivo iniziale di funzionalizzazione di superfici e staccando le cellule aderenti in vitro ^16. Casualmente, si è scoperto che una macchia dal vivo / morto utilizzato era in qualche modo essere presa in dalle cellule senza essere aggiunto un agente permeabile. Inoltre, questo sembrava si sono verificati solo in aree ristrette dei pozzi che è accaduto a corrispondere con il percorso della torcia. Da studi sulle capacità di permeabilizzazione della APGD-t proseguito in studi di controllo, è stato trovato che il gas di trasporto inerte getto di plasma senza eccitazione era anche in grado di permeabilize cellule. Questo contraddice l'ipotesi iniziale che le specie reattive create dal getto di plasma alterati temporaneamente la funzione della membrana e ha suggerito che semplicemente le meccanicheforze CAL erano sufficienti a causare permeabilizzazione cellulare. Da qui, gli studi continuarono nel nostro laboratorio per cercare di quantificare e caratterizzare l'efficienza permeabilizzazione di un getto di gas inerte come pure un'occhiata alle sue capacità di trasfezione ^16.

Attraverso questi studi, si è scoperto che micropori costituiscano effettivamente nella membrana plasmatica, e questi pori tendono a richiudere entro circa 5 sec ^15. Abbiamo dimostrato l'utilità della tecnica in vitro e in vivo nella membrana corioallantoidea di embrione di pollo.

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Protocollo

1. Sviluppo di LabView Programma

1. Un controllore di flusso di massa (MKS M100B Mass-Flo Controller) è collegato alla linea di gas elio per garantire una portata gas precisa. Questa unità è controllata da una tensione di ingresso, compreso tra 0 e 5 V. Un circuito di controllo nel programma LabView determina la tensione richiesta in un dato momento. Interfacciamento tra il computer ed il controllore di flusso di massa è eseguita con un dispositivo di acquisizione dati (NI USB-6009), e un alimentatore 12 V fornisce alimentazione al controllore di flusso di massa.
2. Due slitte di posizionamento lineari sono usati per controllare il movimento della piastra da 6 pozzetti, uno per ciascuna direzione. Ogni gruppo è costituito da una serie MA15 Velmex Assemblea Unislide accoppiato con un motore passo-passo, ed entrambi i gruppi sono controllati da un unico Velmex VXM Stepping Motor Controller. Il controllore consente pareggiare manuale di ogni motore o accetta una stringa di comandi seriali esterni, la cui combinazione consente di movimento specifico patterns. Diversi modelli possono essere programmati nel programma LabView, richiedere all'utente di fornire solo la velocità torcia desiderato così come le dimensioni di percorso.

2. Preparazione delle attrezzature

1. Aprire sia la bombola di elio e il regolatore.
2. Accendere il controller del motore.
3. Aprire il programma LabView e verificare tutte le condizioni.
4. Assicurarsi che la piattaforma sia centrato. Per controllare, guardare in ogni fase del motore e verificare che ogni carrello non è vicino a entrambe le estremità palco. O hanno al centro del programma le carrozze o regolare manualmente utilizzando i comandi da jogging sul frontale del controller del motore.
5. Se questa è la prima corsa della giornata, si consiglia di eseguire il programma una volta senza le cellule, al fine di garantire il setup è corretto.

3. Preparazione del Height Gas Jet capillare Nozzle

1. Rimuovere il capillare dal supporto e azzerare il quadrante altezza.
2. Posizionare la piastra da 6 pozzetti on la piattaforma.
3. Sostituire e abbassare il capillare getto di gas al fondo del pozzo fino a raggiungere il vetrino. Fissare la capillare nel supporto.
4. Utilizzando la manopola di altezza, sollevare il capillare 3 mm. Segnare questa altezza sulla base capillare.
5. Sollevare il capillare a un'altezza di sicurezza e quindi rimuovere la piastra da 6 pozzetti.

4. Cella Permeabilization protocollo

1. Culture linea cellulare aderente a confluenza sul coperchio vetro scivola in una piastra da 6 pozzetti utilizzando tecniche di coltura standard. Per le cellule HeLa, sementi 6 pozzetti con 2 x 10 ⁵ cellule per pozzetto e incubare per 48 ore prima del trattamento.
2. Preparare appropriato volume di soluzione contenente il vettore desiderato. Per hrGFPII-1, una concentrazione di 50 ng / ml in PBS 1x fornisce un forte segnale fluorescente in cellule HeLa 24 ore dopo la trasfezione. Per gli studi di destrano, si raccomanda di 80 mg / ml di 10 kDa destrano fluorescente verde. D'ora in poi, questa soluzione si farà riferimento ad uns "vettore soluzione".
3. Rimuovere cellule di coltura da bene e sciacquare tre volte con PBS 1x.
4. Pipettare 1.370 ml di soluzione di vettore preparati in fase 4.2 nel bene. Ciò dovrebbe tradursi in una profondità liquida di circa 1,3 mm.
5. Posizionare il pozzetto contenente il vettore soluzione nel centro della piattaforma. Abbassare l'ugello getto di gas al livello precedentemente contrassegnato indica un'altezza di ugello 3 mm sopra la diapositiva.
6. Impostare portata elio nel programma LabView e selezionare il modello di movimento desiderata da utilizzare. Seleziona "Esegui" quando è pronto per iniziare il protocollo di permeabilizzazione. Ci sarà un periodo di ritardo iniziale in cui il controllore di flusso di massa si appresta a fornire la portata necessaria. Una volta portata appropriata è stato raggiunto, il programma LabView attiverà i motori passo-passo per spostare il bene nel modello permeabilizzazione desideri. Una volta che la piattaforma è fermato, attendere circa 30 sec e rimuovere la soluzione vettoriale.Nota: permeabilizzazione ottimale si verifica vicino ad una pressione dinamica di 100 a 200 Pa all'uscita dell'ugello, a seconda del diametro del capillare.
7. Lavare ben tre volte con PBS 1x.
8. Riempire bene con terreni di coltura fresco.
9. Ripetere i passaggi 4,3-4,6 per il numero desiderato di esperimenti. Nota: Assicurati di includere campioni di controllo che consistono di pozzi essere riempiti con la soluzione di vettore senza il getto di gas che viene eseguito su di loro. Lasciare la soluzione nei pozzetti di controllo per circa 1 minuto poi procedere alle fasi 4.5 e 4.6.
10. Se si esegue un esperimento di transfezione hrGFP, ritorno 6 pozzetti di incubatore per 24 ore per permettere il materiale transfettati da trascrivere dalle cellule. Se si esegue un esperimento di permeabilizzazione destrano, ritorno 6 pozzetti di incubatore per 15 min.

5. Imaging cellulare

1. Se lo si desidera, subito prima di imaging, di contrasto con adeguate macchia dal vivo / morto per valutare la morte cellulare.
2. Celle di immagine con appropriate microscopio per studiare l'efficacia di trasfezione / permeabilizzazione.

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Risultati

Permeabilizzazione delle cellule HeLa con 10 kDa destrano fluorescente verde utilizzando un getto di gas elio con un diametro interno di 0,86 millimetri capillare è mostrato in Figura 1. Le cellule sono state contrastate immediatamente dopo permeabilizzazione con 2 microlitri / ml EthD-soluzione 1 (LIVE / DEAD Viabilità / citotossicità Kit) per visualizzarne la morte cellulare. Subito dopo di contrasto, vetrini sono stati montati e ripreso. Questa figura mostra risultati dell'esecuzione del getto...

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Discussione

Getto di gas inerte permeabilizzazione è una tecnica utile per la trasfezione di cellule aderenti. Offre la possibilità di trasferire biomolecole nelle cellule con l'uso di forze meccaniche, che elimina la necessità di prodotti chimici potenzialmente dannosi o vettori virali. La tecnica potrebbe potenzialmente offrire ai ricercatori e medici un modo efficiente e relativamente semplice per transfettare con precisione le cellule. La selettività del permeabilizzazione è unico anche consentendo ai ricercatori di tr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable	Life Technologies Inc.	D22910	dextran for permeabilization experiments
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies Inc.	L3224	for counterstaining of mammalian cells
Prolong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	for mounting slides when imaging
Ultra High Purity Helium	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	for HeLa cells
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140079	For DMEM media
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122	For DMEM media
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x			Produced in lab
			Table 1. List of required reagents
6-Well Clear TC-Treated Microplates	Corning	3506
#1 22 x 22 Coverslips	Fisher	12-542B
Glass Capillaries	World Precision Instruments		WPI Sizing Information
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Controller	MKS	M100B01314CS1BV	Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply
USB-6009 DAQ Device	National Instruments	779026-01
UniSlide Assembly with stepping motor and controller	Velmex		Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller
			Table 2. List of required equipment