Sodyum Hyaluronat subretinal Enjeksiyon Kemirgenler Retina Dekolmanı Modeli

Özet

, Dekolmanı bir tekrarlanabilir ve sürekli yüksekliği ile deneysel retina dekolmanı oluşturma ve subretinal kanama olmadan retina hastalığında fotoreseptör hücre kaybı patofizyolojisi okuyan ve potansiyel terapötik müdahalelerin değerlendirilmesi için önemlidir. Burada ayrıntılı olarak, böyle bir yöntem sunulmaktadır.

Özet

Natriumhyaluronat subretinal enjeksiyon retina dekolmanı (RD) uyaran bir yaygın kabul gören bir yöntemdir. Ancak, RD veya subretinal kanama oluşma yüksekliği ve süresi müstakil retinada fotoreseptör hücre ölümünü etkileyebilir. Bu nedenle, fotoreseptör hücre ölümü değerlendirmek için retina altı kanama olmadan üretilebilir RDS oluşturmak için avantajlıdır. Biz subretinal kanama nadir rastlanılan bir tekrarlanabilir konumda büllü ve kalıcı RDS oluşturmak için önceden bildirilen yöntem değiştirdi. Modifiye edilmiş bu yöntemin önemli bir aşaması, subretinal boşluk içine enjeksiyondan sonra sodyum hiyalüronat sızmasını önlemek için kendi kendine yapışan bir skleral kesik, yaratılmasıdır. 30 G iğne ile koroid içine sklera penetrasyon ardından kendinden sızdırmazlık skleral kesi, bir skleral tünel oluşturulur yapmak. Koroid kanama Bu aşama sırasında meydana de, cerrahi bir mızrak ile astriction koroid etek hızını azaltanorrhage. Bu yöntem, bu tür regmatojen RD, prematüre, diyabetik retinopati, seröz santral korioretinopati, ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyon (AMD) ve retinopati gibi RD kapsayan hastalıklarda fotoreseptör ölüm, daha güvenilir ve tekrarlanabilir bir model sağlar.

Giriş

Fotoreseptör temel retinal pigment epitel ayrıldığı zaman fotoreseptör hücre ölümü ve daha sonra görsel bir düşüş meydana gelir. Fotoreseptör fiziksel olarak ayrılması, yaşa bağlı maküler dejenerasyon (AMD), santral seröz korioretinopati, diyabetik retinopati, prematüre retinopati ve yanı sıra yırtıklıı (örneğin retina, bir çizikten) retina dekolmanı (dahil olmak üzere çeşitli retinal hastalıklar, görülür RD). Sodyum hiyalüronat subretinal enjeksiyon fotoreseptör dejenerasyonu ^1-15 patofizyolojisine ilişkin bilgi veren, fotoreseptör hücre ölümüne yol açan bir RD oluşturmak için yaygın olarak kabul edilmiş bir modeldir.

Ilk olarak 2001 yılında piyasaya ⁷ subretinal sodyum hiyalüronat enjeksiyonu ile indüklenen fotoreseptör dejenerasyonu, (hafta günü) makul bir zaman süresi avantajına sahiptir. Ancak, Anima hayvana fotoreseptör hücre kaybının önemli değişkenlik olabilir1) boy ve RD süresi ve subretinal kanama 2) oluşumu: nedeniyle RD sonra fotoreseptör hücre ölümünü etkileyen iki önemli faktör l. Her iki faktör katkıda yönteme dik bir teknik öğrenme eğrisi vardır. Fotoreseptör hücre dejenerasyonu RD yüksekliği ile artar, retinal pigment epitel arasındaki mesafe olarak (RPE) katmanı ve fotoreseptör ^16-17 artırır. Bu raporlar ile tutarlı, önceki deneyler sığ RDS daha büllöz RDS fazla fotoreseptör ölüm gösterdi. Ayrıca, alt retinal hemorhaj, fotoreseptör hücreleri için toksik olan ve fotoreseptör hücre ölümü ^18-21 etkilediği bildirilmiştir. Aynı şekilde, biz subretinal kanama olmadan RDS daha subretinal kanama ile RDS daha fotoreseptör ölüm gözlemledik. Bu nedenle, değişkenliği en aza indirmek için teknikler subretinal hemoraji kaçınarak RD tutarlı zirvelere ulaşmak odaklanmak zorunda.

Bizim içinde değişik bir şekliducing RD subretinal kanama görülen, gözün aynı pozisyonda tekrarlanabilir büllü ve kalıcı RD yapabilirsiniz. Biz bunu diğer siteleri ile karşılaştırıldığında daha geniş bir operasyon sahasını ulaşmak daha kolaydır çünkü zamansal yaklaşım kullanılarak ameliyat gerçekleştirildi. Konjunktival kesildikten sonra, kendi kendine yapışan bir skleral kesik bir 30 G iğne kullanılarak yapılır. Bir skleral tünel, oluşturulan koroid içine sklera penetrasyon tarafından takip edilir. Koroid kanama bu adımda ortaya çıkarsa, kanama skleral yara yoluyla gözü çıkar ve kanama cerrahi mızrakla astriction durdurulabilir. Bir ön kamara lastik sonra göz içi basıncını azaltmak için, kornea gerçekleştirilir. Yalnız subretinal enjeksiyon çıkan retinal arter tıkanıklığı ve iç retina iskemi ile artmış göz içi basıncı yol açacaktır, çünkü bu önemli bir adımdır. Bir Hamilton 10 ul şırınga bağlanmış olan bir 33 G iğne daha sonra subretinal boşluğa sokulur ve 3,5 μ olan, L, sodyum hiyalüronat yavaşça temel RPE arasındaki duyu siniri retinasına ayırmak için enjekte edilir. Fundus gözlem altında gerçekleştirilir uyaran RD diğer yöntemlerin aksine, bu yöntem doğrudan gözlem altında gerçekleştirilir. Skleral yara kendinden sızdırmaz olduğundan, sodyum hiyalüronat sonra dışarı sızıntı olmayacak. Son olarak, tutkal skleral yara üzerine konur ve konjonktiva orijinal konumuna tutturulur. Bu adımlar da sodyum hiyaluronat sızıntı riskini azaltmak sürer. 3.5 ul sodyum hiyalüronat enjeksiyon 8 haftalık farelerin gözlerinde tekrarlanabilir RDS (retinanın% 50) oluşturur. Böylece tekrarlanabilir büllü ve kalıcı RDS sağlayan, gözün dışarı sızmasını enjekte sodyum hialüronat engeller nedeniyle kendi kendine kapanan bir yara oluşturmak bizim modifiye prosedüründe en önemli adımdır.

Protokol

Tüm hayvanlar üzerinde deneyler Vizyon Araştırma Derneği ve Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Oftalmoloji Bildirimi uyarınca gerçekleştirilen ve kurallar ve yönetmelikler Massachusetts Göz ve Kulak Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından belirlenen edildi.

1.. Tedavi öncesi

1. 60 mg bir intraperitoneal enjeksiyonu ile bir 8 haftalık bir fare anestezisi / ketamin ve 6 mg / kg ksilazin kg arasındadır.
2. Bıyıkları kesti. Onlar görselleştirme ve alet yerleştirme ile müdahale çünkü bu yapılır.
3. % 5 fenilefrin ve% 0.5 tropikamid ile öğrenci dilate.
4. Kirpikler kesti. Onlar görselleştirme ve alet yerleştirme ile müdahale çünkü bu da yapılır.
5. Topikal anestezi (% 0.5 proparacaine hidroklorür oftalmik solüsyon) uygulayın.

2. Mikroskop altında Cerrahi

1. Lateral pos içinde fare ayarlayıncerrahın doğru burun ile ition. Bir ayak tutam cerrahi anestezi teyit etmek için yapılır ve steril eldiven önce ameliyat başlamadan donned.
2. Posterior limbusta zamansal konjonktiva kesilirken ve skleradan konjonktiva ayrı. Sklera nüfuz kaçının. Bu adımdan sonra, göz kontrolü için forseps ile limbusta konjonktiva kavramak.
3. Yapmak konik bir 30 G iğne ucu kullanarak kendi kendine kapanan skleral kesi işaret etti. Sklera yoluyla skleral tünel yapmak ve koroid içine sklera (Şekil 1) nüfuz. Retinayı nüfuz kaçının. Koroid kanama oluşur ve skleral yara yoluyla dışarı çıkarsa, kanama durana kadar bir cerrahi mızrakla bir astriction gerçekleştirin. Bu skleral yara kendinden contalı göz içi basıncı olacak.
4. Göz içi basıncını azaltmak için, bir 30 G iğne ile kornea delin. E sırasında iris ve lens yaralanmasına önlemek için iris için iğne paralel kullanınön odasına ntry. Göz içi basınç kendiliğinden sızdırmaz hale gelmesine, yaranın neden olur.
5. Konik (iç gözün doğru) aşağı işaret ile subretinal boşluğa Hamilton 10 ul şırınga bağlı bir 33 G iğne takın ve altta yatan RPE nörosensöriyel retina ayırmak için hafifçe 3.5 ul sodyum hialüronat enjekte. Retina nüfuz ise sodyum hiyaluronat vitreus alanı değil subretinal uzaya gidecek çünkü 33 G iğne ile retina nüfuz kaçının. Ayrıca, bir sözlü gözyaşı yaratacak çünkü hızlı enjeksiyon önlemek ve sodyum hiyaluronat ön odasına sızdırıyor.
6. Sulu mizah göziçi basıncını ayarlamak için forseps ile kornea delinmesi etrafında kornea iterek kornea delinmesi dışarı akmasına izin verin.
7. Bir cerrahi mızrak kullanarak skleral yara sızıntı olmadığını onaylayın.
8. Sodyum hiyaluronat sızıntı riskini azaltmak için, siyanakrilat cerrahi yapıştırıcı yerleştirebilirsinizskleral yara.
9. Siyanoakrilat cerrahi yapıştırıcı kullanılarak orijinal konumuna konjonktiva takın. Bu da sodyum hiyalüronat sızıntısı riskini azaltır.
10. Bir kapak camını kullanarak fundusunu kontrol ve subretinal kanama olmadan bir büllöz RD oluşturulmasını onaylayın.

3. Sonra Tedavi

1. Enfeksiyon riskini azaltmak için göze basitrasin antibiyotik merhem uygulanır.
2. Düşük kan basıncı, düşük vücut ısısı sonraki neden olan anestezi (ketamin ve ksilazin karışımı) önlemek için bir ısıtma pedi üzerine fareler tutun.
3. Bunlar anestezi uyandırmak sonra geri hayvan kafesine fareler koyun. Komplikasyonlar için günlük fareler izleyin. Herhangi bir komplikasyon ortaya çıkması durumunda aşağıda tarif edildiği gibi fareler euthanize.

4. Kurban

1. 100 mg intraperitoneal enjeksiyondan sonra servikal dislokasyon ile fareler Euthanize / sodyum pentobarbital ve enuclea kgHer deney için uygun zaman noktalarında gözleri te (gösterilmemiştir). Sodyum hiyaluronat dışarı sızabilir çünkü enükleasyon sırasında gözün üzerinde baskı uygulamaktan kaçının. Büllöz RDs en az 14 gün boyunca kalıcı olması gerekir.

Sonuçlar

Bu protokol ile yapılan RD kalıcılığını değerlendirmek için, cryosections gün 3, 7 yapılmış ve RD indüksiyonundan sonra 14 edildi. Altı gözü Her bir zaman noktası kullanılmıştır. Hematoksilin ve eosin (HE) boyama bölümleri görselleştirmek için kullanılmıştır. Tüm bölümler lens (Şekil 2) yaklaşan bir büllöz RD gösterdi. Bir göz 7. gününde subretinal kanama gösterdi. Hiçbir gözleri enfeksiyon veya lens hasarının belirtisi gösterdi.

Şekil 1. Kendi kendine yapışan bir skleral kesik oluşturma. Bu şematik normal fare göz bir kesit görüntüsünü göstermektedir. Kırmızı çizgi kendinden sızdırmaz skleral kesi gösterir. Bir 30 G iğne ile koroid sklera içine nüfuz ardından bir skleral tünel kendi kendine yapışan bir skleral kesik oluşturur. Bu skleral yarakendinden contalı subretinal boşluğa enjeksiyon sonrası Natriumhyaluronat sızmasını önlemek ve kalıcı büllöz retina dekolmanı elde edebilirsiniz göz içi basıncı, olacak.

Şekil 2. Retina dekolmanı zaman tabii ki. Bu fundus fotoğraf ameliyattan hemen sonra subretinal kanama olmadan bir büllöz retina dekolmanı gösterir. En az 14 gün boyunca subretinal kanama olmadan hematoksilen ve eozin (HE) boyama gösterisi kalıcı büllöz retina dekolmanı ile kriyokesitler.

Tartışmalar

Kemirgen gözünde RD modeli oluşturmak için çeşitli yöntemler ^{3-15, 22,} rapor edilmiştir. Genel olarak, insanlarda ameliyat sırasında kullanılan göz içi yapışkan bir madde olduğunu ve bilinen herhangi bir toksisite ^1-15 ile ilişkili değildir, çünkü çoğu sodyum hiyalüronat subretinal enjeksiyon kullanmaktadır. Sodyum hiyaluronatın yerine normal tuzlu su ya da fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), RD süresini arttırır.

Bir transvitreal yaklaşım ^3-6 veya transskleral yaklaşım ^7-15: Natriumhyaluronat subretinal enjeksiyon yöntemleri iki yaklaşımdan birini kullanın. Her iki yöntem de fundus gözlem ile gerçekleştirilir. Transvitreal yaklaşımda, retina altı enjektör, bir retinotomi periferik retina oluşturulur, vitröz kavitesine sokulur ve sodyum hiyaluronat subretinal boşluğa enjekte edilir. Bu yöntemde, iki retina yırtıkları retina riskini artırır yapılır,l kanama olduğu subretinal uzaya gidebilir. Buna ek olarak, retinotomi oluşturulur lens yaralanma riski vardır. Skleral yaklaşım için çeşitli tadil edilmiş yöntem vardır. Bir ön kamara ponksiyonundan doğrudan, konjunktiva, sklera, koroid ve RPE ile retina altına yerleştirildiğinde, sodyum hiyaluronat ile doldurulmuş bir şırınga bağlı bir 30 G iğne ile, göz içi basıncını azaltmak sonra, bu yöntemlerin çoğunda ^7-12. Sodyum hiyalüronat sonra retina altına enjekte edilir. Bu yöntemi kullanarak skleral retinal yırtılma ve lens yaralanma riskini transvitreal yaklaşım kullanılarak daha azdır. Bununla birlikte, bir 30 G iğne ile sklera yapılan delik, özellikle fare gözleri için, büyük, ve retina altına enjekte sodyum hiyaluronat kolayca skleral yara yoluyla göz dışarı sızar. Bu, daha düşük, daha az kalıcı RD ve daha değişken fotoreseptör hücre ölümüne yol açar. Dahası, koroid kanama oluşursa,göziçi basıncı önce subretinal hiyalüronat düşürüldü çünkü skleral perforasyon adım, kanama subretinal alana yayılacak.

Çeşitli faktörler subretinal kanama ve yükseklik ve RD ^16-21 sebat dahil olmak üzere, müstakil retina RD etkisini etkileyebilir. Artan RD ^{16, 17} yüksekliği ve fotoreseptör hücre hasarı ile fotoreseptör hücre ölümü artar, çünkü oksijen ve sığ RD kıyasla daha yüksek RD koryokapillaris gelen temel besin düşük difüzyon daha geniş olabilir. Ayrıca, alt retinal hemorhaj, fotoreseptör hücrelerinin ^18-21 için toksik olan, müstakil retinada Bu toksisite olası mekanizmalar hipoksi ve retina altı kanama metabolik bozulmaya bir difüzyon bariyeri olarak ve (demir gibi) kan bileşenleri ile uyarılan doğrudan nörotoksisiteyi içerir. Reti üzerinde koruyucu etkisi olduğu rapor edilmiştir lens hasarı,nal ganglion hücrelerinin ^23, ayrıca RD indüksiyonundan sonra fotoreseptör hücre ölümünü etkileyebilir. Giriş yarası sitesi kapalı değilse ek olarak, sodyum hiyaluronat enükleasyon sırasında göz manipülasyon ile dışarı sızabilir. Bu da, sonuçların yorumunu etkileyebilecek, sığ bir RD hatalı sınıflandırmasına yol açabilir.

Biz RDS tekrar elde edilebilirliğini arttırmak ve subretinal kanama oranını azaltmak için Natriumhyaluronat subretinal enjeksiyon için transskleral yöntem değiştirilmiş. Bu protokolün kritik adım enjeksiyon sonrasında sodyum hiyalüronat sızmasını engelleyen bir 30 G iğne kullanılarak bir kendinden sızdırmaz skleral kesik yaratıyor. Daha fazla önem skleral yara ödenir böylece önceki yöntemlerden farklı olarak, bu protokol fundus gözlem olmaksızın gerçekleştirilir. Tutkal uygulaması, aynı zamanda, gözün dışarı sızmasını sodyum hyaluronat engeller. Bizim tecrübelerimize göre, bu protokol w ile subretinal kanama oranıönemli ölçüde diğer protokolleri ile daha az. Koroid kanama skleral kesi adımı sırasında ortaya çıkarsa bu adımı göz içi basıncını azaltarak önce gerçekleştirilir, çünkü skleral yara yoluyla göz çıkacaktır. Koroid kanama göz içi basıncı ve nörosensöriyel retina dekolmanı azalma sonra meydana gelirse, kan subretinal boşluğa teşrih edecek. Bu, diğer teknikler ile yaklaşık% 10-20 aksine vakaların yaklaşık% 5 bunun bulunmuştur. Bu hayvanlar analiz dışında tutulmalıdır.

Bu teknik aynı ^zamanda, fotoreseptör ve RPE hücreleri ^{25, 24,} hedef vektör-aracılı gen transferi retina altı enjeksiyon için kullanılabilir. Bu enjeksiyonlar için tipik bir araç (PBS, tuzlu su), sodyum hiyalüronat önemli ölçüde daha az yapışkan olduğu için, standart teknikler daha sızıntı boğulmuş bulunmaktadır. Burada anlatılan teknik, bu riskini azaltarak, vektör aktarma deneyleri daha tekrarlanabilir hale getirir vegüvenilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Microscope	Leica	MG90
30G1/2 PrecisionGlide Needle	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 Microliter Syringe	Hamilton	7635-01
33 gauge, 0.5 inch needle	Hamilton	7803-05
18x18mm Cover Glass	Fisher Scientific	18-548A