나트륨 히알루 론산의 망막 주사 설치류에있는 망막 박리 모델

요약

, 분리의 재현성 및 유지 높이 실험 망막 박리를 작성하고, 망막 하 출혈없이하는 망막 질환의 광 수용체 세포 손실의 병태 생리를 공부하고 잠재적 인 치료 개입을 평가하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 세부 사항에 이러한 방법을보고한다.

초록

히알루 론산 나트륨의 망막 주사는 망막 박리 (RD)를 유도하는 널리 사용되는 방법입니다. 그러나, RD 또는 망막 하 출혈의 발생의 높이와 기간은 분리 망막 시각 세포 사멸에 영향을 미칠 수있다. 그러므로, 시각 세포 사멸을 평가하기 위해 망막 하 출혈없이 재현성의 RD를 생성하는 것이 유리하다. 우리는 망막 하 출혈의 드문와 재생 가능한 위치에 수포와 영구의 RD를 생성하기 위해 이전에보고 된 방법을 수정했습니다. 이러한 변형 방법의 중요한 단계는 망막 하 공간 내로 주입 한 후 히알루 론산 나트륨의 누설을 방지 할 수있는 자기 - 밀봉 공막 절개의 창조이다. 30 G 바늘 맥락막 공막에 침투 한 다음 자체 밀봉 공막 절개, 공막 터널이 생성을 확인합니다. 맥락막 출혈이 단계에서 발생할 수 있지만, 수술 창으로와 수렴 맥락막 단의 속도를 감소orrhage. 이 방법은 열공 RD, 조산, 당뇨병 성 망막증, 중심 장액 맥락 망막 병증, 연령 관련 황반 변성 (AMD)의 망막 병증 등의 RD를 포함 질병에 광수 죽음보다 재현성 및 신뢰성있는 모델을 할 수 있습니다.

서문

광 수용체는 기본 망막 색소 상피 세포에서 분리 될 때 광 수용체 세포의 죽음 이후 시각적 감소가 발생. 감광체의 물리적 분리는 연령 관련 황반 변성 (AMD), 중심 장액 맥락 망막 병증, 당뇨 망막 병증, 및 미숙아 망막증,뿐만 아니라 열공 (즉 망막 브레이크로 인한) 망막 박리 (등 각종 망막 질환에서 볼 RD). 히알루 론산 나트륨의 망막 주사 광 수용체의 변성 ^1-15의 병태 생리에 대한 통찰력을 제공하는 광 수용체 세포 죽음에 이르게 RD를 만들 수있는 널리 사용되는 모델입니다.

2001 년 처음 ^7에 도입 된 망막 히알루 론산 나트륨 주입에 의해 유도 된 광 수용체의 변성, (주 일) 적당한 시간 코스의 이점이있다. 그러나, 애니에 동물로부터 시각 세포 손실의 상당한 변동을 가질 수있다1) 높이와 RD의 기간, 망막 하 출혈의 2) 발생 : 인해 RD 후 광 수용체 세포의 죽음에 영향을 미치는 두 가지 주요 요인에 L. 두 요인에 기여하는 방법에 대한 기술 가파른 학습 곡선이있다. 시각 세포 변성 RD의 높이에 따라 증가, 망막 색소 상피 간의 거리로서 (RPE)는 층과 감광체는 ^16-17을 증가시킨다. 이 보고서와 일치, 우리의 이전 실험은 얕은의 RD보다 포성의 RD에 더 많은 광 수용체의 죽음을 보여 주었다. 또한, 망막 출혈 감광체 세포 독성이며 시각 세포 사멸에 ^영향을 미치는 ^18-21 것으로보고되었다. 마찬가지로, 우리는 망막 하 출혈없이 RD를보다 망막 하 출혈의 RD에 더 많은 광 수용체의 죽음을 관찰했다. 따라서, 변동성을 최소화하는 기술은 망막 하 출혈을 피하면서 RD의 일관성을 높이 달성에 초점을해야합니다.

에서의 우리의 수정 방법으로 줄 RD는 망막 하 출혈의 드문과 눈의 같은 위치에 재현 할 수 포성과 지속적인 RD을 만들 수 있습니다. 우리는 다른 사이트에 비하여 더 넓은 동작 필드를 달성하기 쉽기 때문에 시간적 방법을 이용하여 수술을 수행 하였다. 결막의 절개 후, 자기 밀봉 공막 절개 30 G 바늘을 사용하여 제조된다. 공막 터널, 생성 된 맥락막 공막에 침투옵니다. 맥락막 출혈이 단계에서 발생하는 경우, 출혈 상처 공막을 통해 눈을 종료하고, 출혈 수술 창으로 수렴에 의해 중단 될 수있다. 전방 천자는 다음 안압을 줄이기 위해 각막에서 수행됩니다. 혼자 망막 주사 결과 망막 동맥 폐쇄 및 내부 망막의 허혈과 안압 상승으로 이어질 것입니다 때문에 이것은 중요한 단계입니다. 해밀턴 10 μL 주사기에 연결된 33 G 바늘은 다음 망막 하 공간에 삽입하고, 3.5 μ된다그럼 난 히알루 론산 나트륨 부드럽게 기본 RPE에서 감각 신경 망막을 분리 주입된다. 안저 관찰 하에서 수행되는 유도 RD의 다른 방법과 대조적으로,이 기술을 직접 관찰하에 수행된다. 공막 상처가 자체 밀봉하기 때문에, 히알루 론산 나트륨 주입 후 누설하지 않습니다. 마지막으로, 접착제는 공막 상처에 넣어되고 결막이 원래의 위치로 다시 연결됩니다. 이러한 단계는 또한 히알루 론산 나트륨 누설의 위험을 감소 지속. 3.5 ㎕의 히알루 론산 나트륨의 주입은 8 주 된 생쥐의 눈에 재현 된 RD (망막의 50 %)을 만듭니다. 그것은 따라서 재현 포성 및 영구의 RD를 허용, 눈의 누출로부터 주입 된 히알루 론산 나트륨을 방지하기 때문에 자기 밀봉 상처를 만드는 것은 우리의 수정 과정에서 가장 중요한 단계입니다.

프로토콜

동물의 모든 실험은 비전있는 연구를위한 협회와 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 안과 정책에 따라 수행하고, 지침과 규정은 매사추세츠 눈과 귀 부속 진료소 동물 보호위원회에 의해 규정되었다.

1. 전처리

1. MG (60)의 혼합물을 복강 내 주사로 8 주령 마우스를 마취 / 케타민과 10 ㎎ / kg 자일 라진을 kg.
2. 수염을 잘라. 그들은 시각화 및 기기 배치를 방해하기 때문에이 수행됩니다.
3. 5 % 페닐에 0.5 %의 tropicamide와 동공을 팽창.
4. 속눈썹을 잘라. 그들은 시각화 및 기기 배치를 방해하기 때문에이 또한 이루어집니다.
5. 국소 마취 (0.5 % proparacaine 염산염 눈 해결책)을 적용합니다.

2. 현미경 수술

1. 측면 POS에서 마우스를 설정외과 의사를 향해 코 ition. 발가락 핀치는 수술 마취를 확인하기 위해 수행되고, 멸균 장갑 전에 수술을 시작하기 입게된다.
2. 사후 각막 윤부에서 시간 결막을 절개하고 공막에서 결막을 분리합니다. 공막을 관통하지 마십시오. 이 단계 후, 눈을 제어하는​​ 집게와 각막 윤부에 결막을 파악.
3. 확인 경사와 30 G 바늘의 끝 부분을 사용하여 자체 밀봉 공막 절개는 지적했다. 공막을 공막 터널을 확인하고 맥락막에 공막 (그림 1) 침투. 망막을 관통하지 마십시오. 맥락막 출혈이 발생하고 공막 상처를 통해 제공하는 경우, 출혈이 멈출 때까지 수술 창으로 수렴를 수행합니다. 이 공막 상처가 각자 밀봉 안압과 함께있을 것입니다.
4. 안압을 감소시키기 위해 30 G 바늘로 찔린 각막. 전자시 조리개와 렌즈를 손상하지 않도록 아이리스 바늘 평행 사용전방에 n 다음. 안압은 각자 물개로 상처의 원인이됩니다.
5. 베벨 (안 눈을 향해) 아래로 향하게 한 망막 하 공간에 해밀턴 10 μL 주사기에 연결된 33 G 바늘을 삽입하고 기본 RPE에서 감각 신경 망막을 분리 부드럽게 3.5 μL의 히알루 론산 나트륨을 주입. 망막이 침투하면 히알루 론산 나트륨은 유리 같은 공간이 아니라 망막 하 공간으로 이동하기 때문에 33 G 바늘로 망막을 관통하지 마십시오. 또한,이 경구 눈물을 생성하기 때문에 빠른 주입을 피하고, 히알루 론산 나트륨은 전방으로 누출됩니다.
6. 수성 유머는 안압을 조절하는 집게로 각막 구멍 주위에 각막을 눌러 각막 구멍에서 흘러 보자.
7. 수술 창을 사용하여 공막 상처 누설의 유무를 확인합니다.
8. 히알루 론산 나트륨 누설의 위험을 줄이기 위해, 시아 노 아크릴 레이트 접착제 수술에 배치공막 상처.
9. 시아 노 아크릴 레이트 수술 접착제를 사용하여 원래의 위치로 결막을 다시 연결합니다. 이것은 상기 히알루 론산 나트륨 누설의 위험을 감소시킬 것이다.
10. 커버 유리를 사용하여 안저를 확인하고, 망막 하 출혈없이 수포 RD의 생성을 확인합니다.

3. 후 처리

1. 감염의 위험을 줄이기 위해 눈 바시 트라 신 항생제 연고를 적용한다.
2. 낮은 혈압 낮은 체온 이후 일으키는 마취 (케타민 (ketamine)과 자일 라진의 혼합물)을 방지하기 위해 가열 패드에 마우스를 유지합니다.
3. 그들이 마취에서 각성 후 다시 동물 케이지에 마우스를 놓습니다. 합병증 매일 쥐를 모니터링합니다. 어떤 합병증이 발생하는 경우, 아래에 설명 된대로 쥐를 안락사.

4. 희생

1. 100 mg을 복강 내 주사 후 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사 / 펜 토바 비탈 나트륨 및 enuclea kg을각 실험을위한 적절한 시점에서 눈 테 (미도시). 히알루 론산 나트륨이 누출 수 있기 때문에 안구 적출하는 동안 눈에 압력을 가하지 마십시오. 수 포성 RDS는 적어도 14 일 동안 지속되어야한다.

결과

이 프로토콜에 의해 RD의 지속성을 평가하기 위해, 저온부는 일 3, 7 일했고, RD의 유도 후 14되었다. 여섯 눈은 각 시점을 위해 사용되었다. 헤 마톡 실린과 에오신 (HE) 염색이 부분을 시각화하는 데 사용되었다. 모든 섹션은 렌즈 (그림 2)에 접근하는 수 포성 RD을 보여 주었다. 한쪽 눈은 7 일째에 망막 하 출혈을 보였다. 아니 눈 감염이나 렌즈 손상의 징후를 보여 주었다.

그림 1. 자체 밀봉 공막 절개를 만들기.이 도식은 일반 마우스의 눈의 단면 이미지를 보여줍니다. 레드 라인은 자체 밀봉 공막 절개를 나타냅니다. 30 G 바늘 맥락막 공막에 침투 한 다음 공막 터널은 자동 밀봉 공막 절개를 만듭니다. 이 공막 상처각자 밀봉 망막 하 공간에 주입 한 후 히알루 론산 나트륨의 누출을 방지하고 영구적 인 수 포성 망막 박리를 달성 할 수 안압, 함께있을 것입니다.

그림 2. 망막 박리의 시간 코스.이 안저 사진은 즉시 수술 후 망막 하 출혈이없는 포성 망막 박리를 보여줍니다. 적어도 하루에 14를 통해 망막 하 출혈없이 헤 마톡 실린과 에오신 (HE) 염색 쇼 지속적 포성 망막 박리와 저온부.

토론

설치류의 눈 RD 모델을 확립하기위한 방법은 여러 가지가 ^{3-15, 22을보고되었습니다.} 그것은 일반적으로 인간의 안구 내 수술 중에 사용되는 점성 재료이며, 어떠한 공지 안구 독성 ^1-15와 연관되지 않기 때문에 그들의 대부분은 히알루 론산 나트륨의 망막 주입을 이용한다. 히알루 론산 나트륨은, 통상보다 오히려 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)는 RD의 지속 시간을 증가시킨다.

transvitreal 방식 ^3-6 또는 경공 방법 ^7-15 : 히알루 론산 나트륨의 망막 주사하는 방법으로는 두 가지 방법 중 하나를 사용합니다. 두 방법 모두 안저 관찰로 수행됩니다. transvitreal 접근 방법에서는, 망막 인젝터 retinotomy가 말초 망막에 만들어, 유리 체강 내로 도입하고, 히알루 론산 나트륨는 망막 하 공간 내로 주입된다. 이 방법에서는,이 망막 눈물은 망막의 위험을 증가시키는, 만들어진다L 출혈 즉, 망막 하 공간으로 이동 될 수 있습니다. 또, retinotomy가 만들어 렌즈 부상의 위험이있다. 경공 방법에 대한 몇 가지 수정 방법이 있습니다. 전방 천자 직접 결막, 공막, 맥락막과 망막 색소 상피를 통해 망막 하 공간에 삽입되는 히알루 론산 나트륨으로 가득 주사기에 연결된 30 G 바늘로 안압을 감소 후, 이러한 방법 ^7-12 대부분. 히알루 론산 나트륨이어서 망막 하 공간 내로 주입된다. 경공이 방법을 사용하여 망막 눈물 및 렌즈 부상의 위험 transvitreal 방식을 사용하여보다 작다. 그러나, 30 G 바늘로 공막 제 구멍 특히 마우스의 눈을 위해, 대형이며, 망막 하 공간 내로 주입 된 히알루 론산 나트륨은 쉽게 흠집 공막을 통해 눈 모레. 이 낮은, 덜 지속적인 RD 더 많은 변수 광 수용체 세포 죽음에 이르게한다. 더욱이, 맥락막 출혈 발생하면안압 전에 망막 히알루 론산 주입으로 감소되어 있기 때문에 공막 천공 단계는 출혈은 망막 하 공간에 확산됩니다.

몇몇 요인 망막 하 출혈 및 높이와 RD ^16-21의 지속성 둘 다를 포함 분리 망막 RD의 효과에 영향을 미칠 수있다. 증가 RD ^{(16, 17)의} 높이 및 광 수용체 세포 손상과 광 수용체 세포 사멸이 증가하기 때문에 산소와 얕은 RD에 비해 높은 RD와도 경미한에서 필수 영양소의 감소 확산의 더 광범위한 수 있습니다. 망막 하 출혈은 광 수용체 세포 ^{18 ~ 21에} 대한 독성, 분리 된 망막이 독성의 가능한 메커니즘은 저산소증과 망막 하 출혈에 의한 신진 대사 중단 확산 장벽, 그리고 (철과 같은) 혈액 성분에 의해 유도 된 직접적인 신경 독성이 (가) 있습니다. RETI에 대한 보호 효과가보고되었다 렌즈 부상NAL 신경절 세포 ^(23)는 또한, RD의 유도 후 시각 세포 사멸에 영향을 미칠 수있다. 사입구 ​​사이트가 밀봉되어 있지 않은 경우뿐만 아니라, 나트륨, 히알루 론산은 적출 동안 눈 조작으로 새어있다. 이것은 차례로 결과의 해석에 영향을 미칠 수있는, 같은 얕은 RD의 잘못된 분류로 이어질 수 있습니다.

우리의 RD 재현성을 높이고 망막 하 출혈의 비율을 감소하는 히알루 론산 나트륨의 망막 하 주사 경공 방법 변경됨. 이 프로토콜의 핵심 단계는 주사 후 소듐 히알루로의 누설을 방지 30 G 바늘을 사용하는 자기 밀폐 공막 절개를 생성한다. 더 큰주의가 공막 상처에 지급되도록 이전의 방법과는 달리,이 프로토콜은 안저의 관찰없이 수행됩니다. 접착제의 응용 프로그램은 눈 밖으로 누출되는 히알루 론산 나트륨을 방지 할 수 있습니다. 우리의 경험에 의하면,이 프로토콜 W와 망막 하 출혈의 비율로 크게 다른 프로토콜보다 적은. 맥락막 출혈 공막 절개 단계 동안 발생하는 경우,이 단계는 안압을 감소시키기 전에 수행되기 때문에, 상기 공막의 상처를 통해서 눈을 종료한다. 맥락막 출혈 안압 및 감각 신경 망막 박리의 환원 후에 발생하면, 혈액 망막 하 공간 내로 절개한다. 우리는 다른 기술을 가진 10 ~ 20 %에 대비하여 케이스의 약 5 %에​​서 이런 일이 발견. 이 동물들은 분석에서 제외되어야한다.

이 기술은 ^또한, 감광체 또는 RPE ^{세포를 25 (24)} 타겟팅 벡터 - 매개 유전자 전달의 망막 분사를 위해 사용될 수있다. 이러한 주사의 일반적인 차량 (PBS, 생리 식염수) 히알루 론산 나트륨보다 훨씬 적은 점성 때문에, 표준 기술은 더 누수에 시달리고있다. 본 명세서에 기재된 기술은, 이러한 위험을 감소시킴으로써, 벡터 전달 실험보다 재현성있게믿을 수있는.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Microscope	Leica	MG90
30G1/2 PrecisionGlide Needle	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 Microliter Syringe	Hamilton	7635-01
33 gauge, 0.5 inch needle	Hamilton	7803-05
18x18mm Cover Glass	Fisher Scientific	18-548A