Отслойки Модель в Грызуны по субретинальной инжекции гиалуронат натрия

Резюме

Создание экспериментальных сетчатки отряды с воспроизводимым и устойчивой высоте отряда, и без субретинальной кровоизлияния, имеет важное значение для изучения патофизиологии потери фоторецепторов клеток в заболевания сетчатки и оценки потенциальных терапевтических вмешательств. Здесь мы сообщаем такой метод в деталях.

Аннотация

Субретинальной инъекции гиалуроната натрия является широко распространенным методом индукции отслойки сетчатки (RD). Однако высота и продолжительность RD или возникновения субретинальной кровоизлияния может повлиять на гибель фоторецепторных клеток в отслоение сетчатки. Следовательно, предпочтительно, чтобы создать воспроизводимые RDS без субретинальной кровотечения для оценки фоторецептор гибель клеток. Мы изменили сообщалось ранее метод для создания буллезный и стойких RDS воспроизводимым месте с редком возникновении субретинальной кровоизлияния. Важным шагом этого модифицированного метода является создание самоуплотняющейся склеры разрез, который может предотвратить утечку гиалуроната натрия после инъекции в субретинальной пространстве. Для того, чтобы самогерметизирующийся склеры разрез, склеры туннель будет создан, а затем склеры проникновения в сосудистой оболочке глаза с 30 G иглы. Хотя хориоидальная кровоизлияние может произойти во время этого шага, запор с хирургической копьем снижает скорость хориоидальной подолorrhage. Этот метод позволяет более воспроизводимый и надежную модель фоторецепторов смерти при заболеваниях, которые связаны RD например регматогенной РД, ретинопатии недоношенных, диабетическая ретинопатия, центральной серозной хориоретинопатия и возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Введение

Гибель клеток фоторецептора и последующего визуального снижение происходит, когда фоторецепторов отделены от основного пигментного эпителия сетчатки. Физическое разделение фоторецепторов видно в различных заболеваний сетчатки, в том числе возрастной макулярной дегенерации (ВМД), центральной серозной хориоретинопатия, диабетическая ретинопатия, и ретинопатии недоношенных, а также Регматогенная (т.е. вызванные перерывом в сетчатке) отслойки сетчатки ( RD). Субретинальной инъекции гиалуроната натрия является широко распространенным модель для создания RD, что приводит к гибели клеток фоторецепторов, обеспечивая понимание патофизиологии фоторецепторов дегенерации ^1-15.

Фоторецептор дегенерация индуцируется субретинальной инъекции гиалуроната натрия, впервые представленная в 2001 году ^7, имеет то преимущество, разумного периода курс (несколько дней или недель). Тем не менее, он может иметь значительное изменчивость потери клеток фоторецепторов от животного к анимыл за счет двух основных факторов, которые влияют на смерть фоторецепторов клеток после РД: 1) высота и продолжительность РД, и 2) возникновение субретинальной кровоизлияния. Существует крутой техническое обучение методу, который способствует обоих факторов. Фоторецептор клеток дегенерация увеличивается с высоты РД, а расстояния между пигментного эпителия (РПЭ) слой и фоторецепторы увеличивает ^16-17. В соответствии с этим сообщениям, наши предыдущие эксперименты показали больше фоторецепторов смерть в буллезный RDs чем мелких RDS. Кроме того, было сообщено, что субретинальной кровоизлияния является токсичным для клеток фоторецепторов и влияет фоторецепторов гибель клеток ^18-21. Кроме того, мы наблюдали более фоторецепторов смерть в RDs с субретинальной кровоизлияния чем RDs без субретинальной кровоизлияния. Таким образом, методы, чтобы минимизировать изменчивость должны сосредоточиться на достижении согласованных высот РД, избегая при этом субретинальной кровоизлияния.

Наш модифицированный метод впродуцирующих РД может сделать воспроизводимое буллезный и постоянное RD в том же положении глаза с редком возникновении субретинальной кровоизлияния. Мы провели операцию с использованием временной подход, поскольку он легче достичь более широкий операционное поле по сравнению с другими сайтами. После конъюнктивы разрез, самогерметизирующийся склеры надрез с использованием 30 г иглы. Склеры туннель будет создан, а затем склеры проникновения в сосудистой оболочке глаза. Если хориоидальная кровотечение происходит на этом этапе, кровоизлияние выйдет в глаз через склеры раны, и кровотечение может быть остановлено запор с хирургической копьем. Передняя камера прокол Затем выполняется из роговицы для снижения внутриглазного давления. Это важный шаг, потому что в одиночку субретинальной впрыска приведет к увеличению внутриглазного давления с результирующей окклюзии артерии сетчатки и ишемии внутренней сетчатки. 33 G иглу подключен к Hamilton 10 мкл шприца затем вставляется в субретинальной пространстве и 3,5 μ; Л гиалуронат натрия осторожно вводят отделить нейросенсорной сетчатки от базовой РПЭ. В отличие от других методов индуцирующего РД, которые выполняются под наблюдением глазного дна, этот метод выполняется под непосредственным наблюдением. Поскольку склеры рана самогерметизирующийся, гиалуронат натрия не будет вытекать после инъекции. Наконец, клей наносится на склеры раны, и конъюнктива повторного подключения в исходное положение. Эти шаги длится также уменьшить риск утечки гиалуроната натрия. Инъекция 3,5 мкл гиалуроната натрия создает воспроизводимые RDS (50% сетчатки) в глазах 8-недельных мышей. Создание самогерметизирующийся рану является наиболее важным шагом в нашей модифицированной методике, потому что это препятствует вводят гиалуронат натрия от утечки из глаза, что позволяет воспроизводимый буллезный и стойких RDS.

протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Ассоциации для Исследования в видении и офтальмологии Заявление для использовании животных в офтальмологической и Vision Research, и руководящие принципы и правила, изложенные Массачусетского глаз и ухо лазарет комитета по уходу за животными.

1. Предварительная обработка

1. Обезболить 8-недельного возраста мышь с внутрибрюшинной инъекцией смеси 60 мг / кг кетамина и 6 мг / кг ксилазина.
2. Разрежьте усы. Это делается потому, что они мешают визуализации и размещения прибора.
3. Расширить зрачок 5% фенилэфрина и 0,5% тропикамида.
4. Разрежьте реснички. Это также делается потому, что они мешают визуализации и размещения прибора.
5. Применить местной анестезией (гидрохлорид пропаракаина 0,5% глазной раствор).

2. Хирургия под микроскопом

1. Установите курсор в боковом позition с носом к хирургу. Носок щепотка проводится для подтверждения хирургической анестезии, и стерильные перчатки надевают перед началом операции.
2. Надрезать временную конъюнктиву на заднем лимба и отделить конъюнктиву от склеры. Избегайте проникновения в склеры. После этого шага, понять конъюнктиву у лимба щипцами для контроля на первый взгляд.
3. Сделать самогерметизирующийся склеры разрез с помощью кончика 30 G иглы с фаской направлен вверх. Сделайте склеры туннель через склеру и проникают склеры в сосудистой оболочки (рис. 1). Избегайте проникновения в сетчатку. Если хориоидальная кровотечение происходит и выходит через склеры раны, не выполнить стягивание с хирургической копьем, пока не остановится кровотечение. Это склеры рана будет самостоятельно запечатлены внутриглазного давления.
4. Прокол роговицы с помощью иглы 30 G для снижения внутриглазного давления. Используйте иглы параллельно радужной оболочки, чтобы не повредить диафрагму и объектив во время еNtry в переднюю камеру. Внутриглазное давление вызовет рану на самоопределение печатью.
5. Вставьте 33 г иглу, соединенную с Гамильтон 10 мкл шприца в субретинальной пространстве с скос направлен вниз (по направлению к внутренним взором), и ввести 3,5 мкл гиалуронат натрия осторожно отделить нейросенсорной сетчатки от основной РПЭ. Избегайте проникновения в сетчатку с иглой 33 G, потому что гиалуронат натрия пойдет в стекловидное тело, но не субретинальной пространства, если сетчатка пронизана. Кроме того, избегайте быстрой инъекции, потому что это создаст устный слезу, и гиалуронат натрия будет течь в переднюю камеру.
6. Пусть внутриглазной жидкости вытекать из роговицы прокола, нажав на роговицу вокруг роговицы прокола щипцами для регулировки внутриглазное давление.
7. Подтвердите отсутствие утечки из склеры раны с помощью хирургического копье.
8. Чтобы уменьшить риск утечки гиалуроната натрия, разместить цианакрилатный хирургического клея насклеры рана.
9. Установите на конъюнктиву в исходное положение с помощью цианакрилатный хирургического клея. Это еще больше снижает риск утечки гиалуроната натрия.
10. Проверьте глазного дна с использованием покровного стекла и подтвердите создание буллезной РД без субретинальной кровоизлияния.

3. После обращения

1. Применение бацитрацин мазь с антибиотиком для глаз, чтобы уменьшить риск инфекции.
2. Держите мышей на грелку, чтобы предотвратить анестезию (смесь кетамина и ксилазина) от причинения низкая температура тела после низкого кровяного давления.
3. Положите мышей обратно в животных клетке после того как они пробуждают от наркоза. Монитор мышей ежедневно для осложнений. Если возникают какие-либо осложнения, усыпить мышей, как описано ниже.

4. Жертва

1. Эвтаназии мышей путем смещени шейных позвонков после внутрибрюшинной инъекции 100 мг / кг пентобарбитала натрия и enucleaт.е глаза в соответствующих точках времени для каждого эксперимента (не показан). Избегайте применения давления на глаза во время энуклеации потому гиалуронат натрия может просачиваться. Буллезные РСВ должны быть стойкими, по крайней мере 14 дней.

Результаты

Для оценки стойкости РД, сделанного этого протокола, криосрезы были сделаны на 3, 7 и 14 после индукции RD. Шесть глаза были использованы для каждой временной точке. Гематоксилином и эозином (HE) окрашивание используется для визуализации разделы. Все разделы показали буллезный RD приближается объектив (рис. 2). Один глаз показал субретинальной кровоизлияния на 7-й день. Нет глаза не показали никаких признаков инфекции или травмы объектива.

Рисунок 1. Создание самоуплотняющийся склеры разрез. Это схематично показан в поперечном сечении изображение обычного глаза мыши. Красная линия показывает самогерметизирующийся склеры разрез. Склеры туннель последующим склеры проникновения в сосудистой оболочке глаза с 30 G иглой создает самогерметизирующийся склеры разрез. Это склеры ранабудет самостоятельно запечатлены внутриглазного давления, которое может предотвратить утечку гиалуроната натрия после инъекции в субретинальной пространства и достижения стойких буллезные сетчатки отряды.

Рисунок 2. Время, конечно отслойки сетчатки. Это дно фотография показывает буллезный отслоение сетчатки без субретинальной кровоизлияния сразу после операции. Криосрезы гематоксилином и эозином (HE) окрашивание шоу упорной буллезной отслойки сетчатки без субретинальной кровоизлияния по крайней мере 14-й день.

Обсуждение

Существует несколько методов для создания модели RD грызунов глазах были зарегистрированы ^{3-15, 22.} Большинство из них используют субретинальной инъекции гиалуроната натрия, потому что это вязкий материал обычно используется во время операции внутриглазного в организме человека, и это не связано с каким-либо известным глазной токсичности ^1-15. Гиалуронат натрия, а не физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), увеличивает продолжительность RD.

Методы субретинальной инъекции гиалуроновой кислоты использовать один из двух подходов: transvitreal подход ^3-6 или транссклеральная подход ^7-15. Оба метода выполняются с соблюдением глазного дна. В подходе transvitreal, субретинальная инжектор вводится в полость стекловидного тела, ретинотомии создается в периферийной сетчатке, а также гиалуронат натрия вводят в субретинальной пространстве. В этом способе две разрывы сетчатки сделаны, что увеличивает риск сетчаткил кровоизлияния, которые могут идти в субретинальной пространстве. Кроме того, существует риск получения травмы объектива, когда ретинотомии создается. Есть несколько модифицированные методы подхода транссклеральной. В большинстве из этих методов ^7-12, после снижения внутриглазного давления с передней камеры прокола, в G иглу 30, соединенного с шприц, наполненный гиалуроната натрия непосредственно вставленной в субретинальной пространства через конъюнктивы, склеры, сосудистой оболочки и ПЭС. Гиалуронат натрия затем вводят в субретинальной пространстве. Риск разрывов сетчатки и линзы травмы с помощью этого метода транссклеральная меньше, чем с использованием подхода transvitreal. Тем не менее, отверстие, сделанное в склере иглой 30 G является большим, особенно для глаз мыши, и гиалуронат натрия вводят в пространстве субретинальной легко протекает из глаза через склеры раны. Это приводит к более низкой, менее стойких РД и более переменной смерти фоторецепторов клеток. Более того, если хориоидальная кровотечение происходит всклеры шаг перфорации, кровотечение будет распространяться в субретинальной пространства, потому что внутриглазное давление было уменьшено до субретинальной инъекции гиалуроната.

Ряд факторов может повлиять на эффект РД на отслоение сетчатки, в том числе как субретинальной кровоизлияния и высоты и настойчивости РД ^16-21. Фоторецептора гибель клеток возрастает с увеличением высоты RD ^{16, 17,} и повреждение клеток фоторецептора может быть более обширный из-за уменьшения диффузии кислорода и необходимых питательных веществ из хориокапилляров с более высокой по сравнению с RD мелкой RD. Субретинальной кровоизлияния также токсичны для клетки фоторецепторов ^18-21; возможные механизмы этого токсичности в отслоение сетчатки включают гипоксии и метаболического нарушения по субретинальной кровоизлияния в качестве диффузионного барьера, а также прямой нейротоксичность, вызванную компонентов крови (например, железа). Травмы объектива, который, как сообщается, имеют защитное действие на RETINAL ганглиозных клеток ^23, также может повлиять на смерть фоторецепторов клеток после индукции РД. Кроме того, если запись рана сайт не запечатан, гиалуронат натрия может вытечь с манипуляцией глаз во время энуклеации. Это может привести к ошибочному классификации в РД, как мелкой, которые в свою очередь влияют на интерпретацию результатов.

Мы модифицировали метод транссклеральная для субретинальной инъекции гиалуроновой кислоты, чтобы увеличить воспроизводимость RDs и сокращения темпов субретинальной кровоизлияния. Важным шагом этого протокола является создание самоуплотняющийся склеры разрез, используя иглу 30 G, который предотвращает утечку гиалуроната натрия после инъекции. В отличие от предыдущих методов, этот протокол выполняется без соблюдения глазного дна так больше внимания уделяется склеры раны. Применение клея также предотвращает гиалуронат натрия от утечки из глаза. По нашему опыту, скорость субретинальной кровоизлияния с этим протоколом жкак значительно меньше, чем с другими протоколами. Если кровотечение хориоидеи происходит в течение склеры шаге разреза, он будет выходить из глаза через склеры раны, потому что этот этап выполняется до снижения внутриглазного давления. Если хориоидальная кровотечение имеет место после снижения внутриглазного давления и отрядом нейросенсорной сетчатки, кровь будет рассекать в субретинальной пространстве. Мы обнаружили, что это произойдет в приблизительно 5% случаев, в отличие от 10-20% с другими способами. Эти животные должны быть исключены из анализа.

Этот метод также может быть использован для субретинальной инъекции вектора-опосредованного переноса гена в целевой фоторецептора или клетки ПЭС ^{24, 25.} Потому что типичный автомобиль (PBS, солевой раствор) для этих инъекций значительно менее вязкой, чем гиалуроната натрия, стандартные методы страдают от более утечек. Методика описано здесь, за счет уменьшения этого риска делает эксперименты вектор переноса и более воспроизводимымнадежный.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Microscope	Leica	MG90
30G1/2 PrecisionGlide Needle	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 Microliter Syringe	Hamilton	7635-01
33 gauge, 0.5 inch needle	Hamilton	7803-05
18x18mm Cover Glass	Fisher Scientific	18-548A