Organik Elektrokimyasal Transistör Bariyer Doku bozulması ve Algılama

Özet

Organik Elektrokimyasal Transistor canlı hücreler ile entegre ve mide-bağırsak epitelyal bariyer boyunca iyon akışı izlemek için kullanılır. Bu çalışmada, kalsiyum kenetleme maddesi EGTA (etilen glikol-bis (beta-aminoetil eter)-N, N, N ', N'-tetra asetik asit varlığı ile indüklenen sıkı birleşme bozulması ile ilişkili iyon akışında bir artış, asit), ölçülür.

Özet

Gastrointestinal sistem, gerekli iyon ve moleküllerin geçişine izin verirken, patojen ve toksinlerin girişine karşı fiziksel bir engel oluşturur bariyer doku bir örnektir. Bu bariyer bir kırılma hücre dışı kalsiyum konsantrasyonunda bir azalmaya neden olabilir. Kalsiyum konsantrasyonundaki bu azalma, paraselüler akısının bir artışa yol açan, bariyerin mühürlenmesi ile ilgili proteinlerin yapısal bir değişikliğe neden olmaktadır. Bu etkisini taklit etmek için kalsiyum kenetleme maddesi, etilen glikol-bis (beta-aminoetil eter)-N, N, N ', N'-tetra asetik asit (EGTA), gastrointestinal sistemin temsili olarak bilinen hücrelerin bir mono-tabakası üzerinde kullanıldı. Bariyer dokusunun bozulması tespit etmek için farklı yöntemler daha önce bu imüno ve geçirgenlik deneyleri gibi, mevcuttur. Ancak, bu metodlar zaman alıcı ve pahalı ve dinamik veya yüksek verimlilik ölçümleri için uygun değildir. Bariyer doku ölçülmesi için elektronik yöntemlerbütünlüğü de transepitelyal direnci (TER) ölçülmesi için mevcut, ancak bu genellikle pahalı ve karmaşıktır. Bariyer doku bütünlüğü ilaç keşfi ve patojen / toksin teşhis önemli bir parametre olduğu, ucuz, hızlı ve hassas yöntemlerinin geliştirilmesi acilen ihtiyaç vardır. Bariyer doku oluşturan hücreler ile entegre Organik elektrokimyasal transistör (OECT) dinamik bariyer doku bütünlüğünün izleme yeteneğine sahip yeni bir cihaz olarak gösterilmiştir. Cihaz bariyer doku bütünlüğünün bir göstergesi olarak, gerçek zamanda, görülmemiş zamansal çözünürlük ve hassasiyet ile iyonik flux dakika varyasyonları ölçmek mümkün değildir. Bu yeni yöntem, yüksek veri akışı tarama uygulamaları ile uyumlu olması ve düşük maliyetle imal edilmiş olabilir, basit bir cihaz dayanmaktadır.

Giriş

Mide-bağırsak epiteli, vücudun çeşitli kompartmanlar arasında moleküllerin geçişini kontrol bariyer doku, bir örneğidir. Su ve vücut sürdürmek için gerekli besin geçişine izin verirken epitelyum, patojenler ve toksinlere karşı fiziksel bir engel sağlamak ¹ proteinlerin kompleksleri ile birbirine uzatılmış sütun hücrelerden oluşur. Lumen ve alttaki dokulara ^2,3 üzerine bağlanan hücrelerin bazal tarafına maruz kalan hücrelerin tepe tarafı: Bu seçicilik, iki farklı membran etki yaratır epitel hücrelerinin polarizasyon, kaynaklanmaktadır. Sıkı bağlantıları (TJ) epitel hücrelerinin apikal kısmı mevcut proteinlerin kompleksleri olan ve apikal birleşme ⁴ olarak bilinen büyük bir kompleks bir parçasıdır. Bariyer doku boyunca iyon akışı (hücre yoluyla) ile veya hücre üzerinden (iki bitişik hücreler arasında) bir paraselüler yolu ile ya da gidebilir. ToplamıHer iki yol izleri üzerinden taşıma transepitelyal direnç olarak da bilinir. Apikal birleşme iyonları ve belirli bir açma ve kapama fonksiyonu ile bariyer ^5,6 geçerken moleküllerin düzenlenmesinden sorumludur. Bu protein komplekslerinin bir fonksiyon bozukluğu ya da rahatsızlığın çoğunlukla hastalık ^7-11 ile ilgilidir. Buna ek olarak, çok sayıda enterik patojenler / toksinler bariyer ^12-14 arasında iyon / su akışının büyük bozukluğunun bir sonucu olarak, büyük olasılıkla bu şekilde vücuda giren ve ishale yol açan, özellikle bu kompleks hedef bilinmektedir. Bariyer dokusu, aynı zamanda, hücre dışı mikro-değiştirilerek değiştirilebilir. Kaderin hücre-hücre yapışması için önemli bir protein olduğunu ve apikal birleşme oluşumunda yer almaktadır. Kalsiyum Cadherin doğru yapısal uyum için gereklidir, ve hücre dışı kalsiyum olarak bir azalma, hücre-hücre birleşme yıkılması ve takip eden bir açılış ile sonuçlandığı gösterilmiştirHücrelerin ¹⁵ arasında paraselüler yolu. O olduğu gibi, bu çalışmada, EGTA (etilen glikol-bis (beta-aminoetil eter)-N, N, N ', N'-tetra asetik asit), spesifik bir kalsiyum kenetleme maddesi, bariyer dokuda ihlali indüklemek için kullanılmıştır iyon ^16,17 akış paraselüler üzerinde hızlı ve şiddetli bir etkisi olduğu gösterilmiştir. Bu, kalsiyum kenetleyici Caco-2 hücre hattının bir belirsiz ve farklı tek tabaka kullanılmıştır. Hücre kültürü içinde uçlar kültürlü, bu hücre çizgisi, gastrointestinal sistemin özelliklerini geliştirmek için yaygın olarak bilinen ve ilaç ^18,19 emilimini test etmek için, farmasötik endüstrisinde kullanılır.

Bariyer doku bütünlüğünü izlemek için yöntemler bol vardır. Bu yöntemler, apikal birleşme ^{20 °} olduğu bilinen belirli proteinlerin immünofloresan boyama dayanarak ya da bariyer dokuya normal geçirimsiz olan, bir floresanlı işaretleyici molekülün miktarının dayanarak, genellikle optik vardır21,22. Bir etiketin kullanımı eserler tabi ve genellikle maliyet ve deney süresi artar gibi Ancak, (örneğin bir florofor / kromofor olmayan) bir etiket içermeyen yöntemleri tercih edilir. Bariyer doku Elektrikli, etiketi içermeyen son izleme dinamik bir izleme yöntemi ²³ olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, elektrik empedansı spektroskopisi son zamanlardaki teknolojik ilerlemeler transepitelyal direnci (TER), hücre tabakası boyunca iyon iletkenliği bir ölçüm ölçebilen bir ticari olarak temin edilebilir bir tarama cihazının ^24,25 gelişimini sağladı.

Organik elektronik, elektronik ve iyonik taşıyıcılar hem de gerçekleştirebilirsiniz iletken polimerler kullanarak elektronik ve biyoloji ^{26,27 28,29} dünyasını arayüzü için eşsiz bir fırsat yarattı. OECT ^30-32 kullanarak bariyer dokusunda ihlallerini tespit etmek için yeni bir yöntem son zamanlarda kullanılmaya başlandı. Bu cihaz, mevcut tekniklerin bize karşı valide edildiCellzscope kullanarak Lucifer sarı kullanarak immünofloresan, geçirgenlik deneyleri de dahil olmak üzere doku bariyer bütünlüğünü ve empedans spektroskopisi değerlendirmek ed. Test edilen tüm toksik bileşiklerin durumunda, OECT eşit ya da daha iyi bir hassasiyetle çalıştığı bulunan ve yukarıdaki yöntemlere göre artan zamansal çözünürlüğe sahip oldu. Bu cihazda, PEDOT: PSS, kararlı ve biyolojik olarak uyumlu ^33,34 olduğu gösterilen bir iletken polimer, transistörün kanalı içinde aktif madde olarak kullanılır. OECT bir iletken polimer kanalın her iki tarafındaki boşaltma ve kaynak elektrotları oluşmaktadır. Bu da, cihazın bir parçasını oluşturan bir elektrolit ile temas halinde yerleştirilir. Bir kapı elektrot, elektrolit (Şekil 1) içine daldırılır ve bir pozitif kapı voltajı kapısında uygulandığında, elektrolitten katyonları ve böylece iletken polimer dedoping ve kaynak-drenaj bir değişiklik ile ortaya çıkan, kanal içine zorlanır akımı. Device böylece nedeniyle transistör amplifikasyon iyonik akı dakika değişiklikleri son derece duyarlıdır. , Bir hücre kültürü eki üzerinde büyümüş bir hücre tabakası kapı elektrodu ile iletken polimer kanal arasında yerleştirilmiştir. Bozulmamış bir hücre tabakasının varlığı, boşaltma akımı azalır (: bölge A'dan b geçiş Şekil 2) katyonları sağlam bir tek tabaka mevcudiyetinde, bu nedenle, iletken polimer içine girmek için bir bariyer görevi görür. Zehirli bir bileşiğin varlığında, bariyer doku aşamalı katyonları polimer filmin içine girmek sağlayarak ve (: c bölge Şekil 2), boşaltma akımını artırarak, bütünlüğünü kaybeder. Bu teknik ile, bariyer dokuda ihlal tek tabaka üzerinde akısının modülasyonu karşılık gelen, boşaltma akımının modülasyonu tarafından görülür. Bu cihaz, gerçek zamanlı olarak görülmemiş zamansal çözünürlük ve hassasiyet ile iyonik flux dakika varyasyonları ölçmek mümkün değildir. Bu teknoloji, Will uyuşturucu testi, hastalığın teşhis veya bariyer modeli kolayca adapte edilebilir gibi temel araştırma için toksikoloji alanında ilgi. Bu yöntem, aynı zamanda in vitro modellerin doğrulama vivo test yerine sağlar olarak, deney hayvan azaltmaya yardımcı olacaktır.

Protokol

1.. PEDOT: PSS Çözüm Hazırlığı

1. PEDOT, 50 ml ile (PEDOT etilen glikol: PSS) PSS, etilen glikol (iletkenliğini artırır) 1:4 bir hacim oranında eklemek, 0.5 ul / yüzey aktif madde olarak dodesil asit (DBSA) ml ve 10 mg / ml cam slayt için iletken polimerin yapışmasını geliştirmek için bir çapraz bağlayıcı olarak 3-glisidoksipropiltrimetoksisilan (GOPS).

2. OECT Fabrikasyon (Şekil 3)

1. Lift-off litografi yoluyla termal buharlaştırılarak altın kaynak ve drenaj kişileri tanımlayın:
   1. 30 saniye boyunca 3,000 rpm'de normal temiz bir cam slayt üzerinde kat photoresist'i Spin. Cam boyutlar inç x in 1 3 olan
   2. Vaziyeti ile desenleri tanımlamak. Boyutlar Ancak burada listelenen boyutlar uygun duyarlılık yol gösterildi, değişmiş olabilir. Sonra geliştirici kullanabilirsiniz.
   3. Sırasıyla 5 nm ve krom ve altın 100 nm buharlaşır.
   4. Lift-off photoresist'i bir ac içindekaynak ve drenaj sadece Au temas alanı ile alt-tabakanın bırakarak 1 saat boyunca etone banyosu.
2. PEDOT istenen uzunluğu: PSS Kanal 1 mm'dir. Bu, parilen-C (Pa-C) soyulan tekniği kullanılarak desenlendirme ile elde edilir:
   1. Kaplama kurulumunda Pa-C 3.5 g yükleyin. Düzgün Au kontaklı substratın üzerine parylene,-C 2 um buharlaşır.
   2. Pattern vaziyeti ile kanal:
      1. 30 saniye boyunca 3,000 rpm'de kat photoresist'i Spin.
      2. UV kanalı ve altın temas 20 saniye aydınlatmak için bir maske kullanın, maruz fotorezist geliştirici çözünür hale gelecektir.
      3. Fotorezist üzerinde kanal alanını açmak için geliştirici kullanın.
   3. Kanal ve altın temas açmak için bir 15 dakika plazma aşama (O ₂ (50 sccm) ve CHF ₄ 160 W (3 sccm) plazma) ile kanal alanında Pa-C Etch.
3. Spin kaplamada tarafından PSS karışımı çözüm: PEDOT yatırınız45 saniye boyunca 500 rpm. 110 ° C'de 30 saniye boyunca fırında
4. Peel-off Pa-C PEDOT ortaya çıkarmak için: altında substratın PSS kanalı. Bu kanal biraz Protokol 1'de yapılan Au kişiler ile üst üste gelmelidir.
5. Atmosferik şartlar altında 140 ° C'de 1 saat boyunca fırında örnekleri.

3. Montaj Cihazı

1. Baz çözelti içinde çözelti işlenmesi için bir oran 01:10 (genellikle bir kit içinde bir araya verilir) iki çözeltinin karıştırılması ile PDMS yapın. 120 ° C'de 1 saat boyunca fırında
2. Bir delik yumruk kullanarak iyi tasarım ve istenilen alanı çevresinde bir kare kesti.
3. Yaklaşık 6 mm ^'2 bir kanal alanı sonuçlanması, kanalın üstünde iyi bir PDMS yapıştırın. Kaynak ve drenaj kişiler kapalı olmadığından emin olun.
4. Bunu bir delik (hücre kültürü insert için tutucu kullanabilirsiniz) bir plastik destek olun ve sonra PDMS üstüne tutkal. Kuru gecede edelim.
5. Wat ile doldurulmasına tarafından sızıntı için iyi tester.
6. Kalay ile kaynak ve drenaj temas elektrik telleri lehimleyin.

4. Hücre Kültürü

1. , Aşağıdaki gibi hücre kültür ortamını hazırlayın:
   1. DMEM içinde,% 1 glutamin,% 10 fetal büyükbaş hayvan serumu,% 0.5 'lik Penisilin-Streptomisin, ve% 0.1 gentamisin ekleyin.
   2. Steril bir filtre cihazı kullanılarak hücre kültürü ortamı sterilize edin.
2. Hücre kültür ortamı içinde,% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C 'de 49 ve 68 geçiş arasında Caco-2 hücreleri koruyun.
3. X 10 ⁴ hücre / insert 1.5 tripsin ve tohum kullanarak haftada bir kez hücreleri bölün.
4. 3 hafta boyunca haftada iki kez hücre kültür ortamı değiştirin.

5. OECT ile Ölçümler

1. Geçit elektrotu olarak kullanım için bir SOURCEMETER bir Ag / AgCl bağlayın. Grafik 1a'da gösterildiği gibi, elektrolit olarak kullanılan hücre kültür ortamı, en uç bırakın.
2. T kaynak ve drenaj teller bağlayıno (çift kanal kurulumu) SOURCEMETER.
3. Bir kare darbe pozitif gerilim (: toprak referans elektrot olarak kullanılır) kapısı ve kaynağı arasındaki (V _GS) uygulayın. Drenaj ve kaynak (V _DS) arasında negatif bir sabit gerilim uygulanır ve ilgili akım (I _DS) ölçülür.
4. Çalışan bir PC programı veri toplama kullanın. Aşağıdaki gibi özelleştirilmiş bir satın alma programı girilen OECT parametreler olmalıdır: V _DS = -0.2 V, V _GS = 0.3 V, V _GS zamanında = 2 sn, zaman kapalı = 28 sn.
5. Kaynak drenaj akımı (I _DS) ve kapı akımı (I _GS) okuyunuz. Istikrarlı bir temel sinyal sağlamak için birkaç dakika için ölçüm yapacak.

6. Ölçümü için OECT ile Hücreleri entegre

Not: Deneyden önce, hücre tabakasının bütünlüğünün bir empedans Spektroskopisi cihazla TER ölçülmesi ile doğrulanabilir. Her 3 haftalık Caco-2 hücre INSE TERrt 400 Ω üstünde ^olmalıdır. cm ^2.

1. OECT ölçüm kapalı süre boyunca: elektrolitten kapı elektrodu çıkarın hücre kültürü eki birleştirmek, ve hücre kültür kabı içinde kapı elektrodu değiştirin.
2. Sabit bir sinyal sağlamak için bir kaç dakika için hücreler ile bir temel değer ölçümü yapın. Bu başlangıç ​​sağlam bir tek tabaka (0) 'e tekabül normalize değerinin hesaplanması için olarak kullanılacaktır.

7. Hazırlanması ve Toksik Bileşik Giriş

1. İlk Tris baz ile 7.4 çözeltinin pH değerinin ayarlanması, DI su içinde EGTA, 1 M çözelti hazırlayın.
2. Dikkate alınarak hacmi (örneğin, 5 mM ve 100 mM arasında), istenen konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacimde EGTA çözeltisi ekleyin. EGTA kapalı süre boyunca bazal odası içinde ilave edilmelidir.
3. Protokol 5'de olduğu gibi, 90 dakika boyunca sürekli olarak ölçün. Bei ölçüm ise,ng, oda sıcaklığında, hücrelerin stabilitesi, 90 dakika sonra sabit kalır olmaz gerçekleştirilir.
4. Seferin sonunda, bu nokta, filtre kaldırılması ve medya kapı elektrodu daldırılmasıyla yapılabilir, 15 dakika boyunca, bariyer tabakası ve bir ölçü tam yok edilmesi ile sonuçlanabilir hücre katmanı çizik. Bu taban, bir tek tabaka yok tekabül normalize değerinin hesaplanması için olarak kullanılacaktır.

Sonuçlar

Ölçüm, ilk aşama esnasında, boşaltma akımı biraz farklılık gösterebilir, ama çoğu durumda (Şekil 2, bölüm a) sabit kalacaktır. Sinyal kararlı değilse, transistor atılır ve değiştirilmesi gerekir. Bu istikrar kontrol de cihazın iletkenliği başlangıçta herhangi bir kayıp sonradan ölçümünü etkilemez yok olmasını sağlar. Ölçüm birkaç dakika sonra, hücreler, doku bariyeri oluşturan uç kanalın üzerine yerleştirilir. Drenaj akımı derhal (Şekil 2,

Tartışmalar

Bu teknik engel doku bütünlüğünü ölçmek için, canlı hücreler ile bir organik elektrokimyasal transistör entegre etmek için yeni bir yöntem sağlamaktadır. Bu tekniğin başlıca avantajları hızlılığı ve hassasiyet değil, aynı zamanda dinamik bariyer doku izlenmesi için, cihazın düşük maliyetli vardır.

Bu yöntem, canlı hücreleri kullanır gibi, kritik bir noktaya sağlam bir bariyer katmanı temsil eden bir tek tabaka, kullandığınızdan emin olmaktır. Bariy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clevios pH 1000	Heraus Clevios
AZ9260 resin	Cipec Specialties
Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA)	Acros Organic
3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS)	Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Culture insert Millicell  PET 0.4 μm Millipore	Dominique Dutscher	51705
24-well Cell culture plate BD Falcon	Dominique Dutscher	51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM	Dominique Dutscher	51246
Advanced DMEM Marque GIBCO	Fisher Scientific	E3434T
FBS Heat Inact.	Fisher Scientific	E3387M
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific	E3470C
GlutaMAX	Fisher Scientific	E3524T
Trypsin 0.05% EDTA	Fisher Scientific	E3513N
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma Aldrich	E4378
Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%,	Sigma Aldrich
Caco-2 cells	ATCC
PDMS	Dow Corning	SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER
Au (99.99%)	NEYCO	AU3X6
Chromium (99.95%)	NEYCO
Parylene C	Specialty Coating Systems
Ag/AgCl wire	Harvard Apparatus
Photoresist	Cipec Specialties