Erkundung der Barrier Gewebestörung mit einem organischen Transistor Elektro

Zusammenfassung

Die Organische elektrochemischen Transistor mit lebenden Zellen integriert und zur Ionenfluss über den Magen-Darm-Epithel-Barriere zu überwachen. In dieser Studie wurde eine Erhöhung des Ionenflusses, um eine Unterbrechung der tight junctions, die durch die Anwesenheit der Calcium-Chelatbildner EGTA (Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetra-Essigsäure induzierten verwandten Säure), wird gemessen.

Zusammenfassung

Der Gastrointestinaltrakt ist ein Beispiel eines Sperrgewebe, das eine physikalische Barriere gegen den Eintritt von Pathogenen und Toxinen liefert, während es den Durchgang von Ionen und Molekülen erforderlich. Eine Verletzung dieser Barriere kann durch eine Verringerung der extrazellulären Calcium-Konzentration verursacht werden. Diese Verringerung der Calcium-Konzentration bewirkt eine Konformationsänderung in Proteinen im Verschweißen der Sperr beteiligt, was zu einer Erhöhung der parazellulären Fluss. Um diesen Effekt zu imitieren, die Calcium-Chelatbildner Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetra-Essigsäure (EGTA) wurde auf einer Monoschicht von Zellen bekannt, repräsentativ für den Magen-Darm-Trakt verwendet werden. Verschiedene Methoden, um die Störung der Barriere Nachweis von Gewebe vorhanden ist, wie Immunfluoreszenz-Assays und Permeabilität. Jedoch sind diese Verfahren zeitaufwendig und teuer und nicht für dynamische oder Hochdurchsatz-Messungen geeignet. Elektronische Methoden zur Messung der Gewebe-SchrankeIntegrität auch zur Messung des transepithelialen Widerstandes (TER) vorhanden sind, aber diese sind oft teuer und komplex. Die Entwicklung von schnellen, billigen und empfindliche Verfahren ist dringend erforderlich, da die Integrität der Barriere Gewebe ist ein Schlüsselparameter in der Wirkstoffforschung und Krankheitserreger / Toxin Diagnostik. Die organische elektro Transistor (OECT) mit Barriere-Gewebe bildenden Zellen integriert wurde, als ein neues Gerät in der Lage, dynamisch Überwachung Barriere Gewebeintegrität gezeigt worden. Das Gerät ist in der Lage, kleine Veränderungen in der Ionenflusses mit beispiellosen zeitlichen Auflösung und Empfindlichkeit zu messen, in Echtzeit als Indikator der Sperrgewebeintegrität. Dieses neue Verfahren basiert auf einer einfachen Vorrichtung, die mit Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen kompatibel sind und zu niedrigen Kosten hergestellt werden kann, basiert.

Einleitung

Der Magen-Darm-Epithel ist ein Beispiel für Gewebebarriere, die den Durchgang von Molekülen zwischen verschiedenen Kompartimenten des Körpers steuert. Das Epithel besteht aus länglichen säulenförmigen Zellen Komplexe von Proteinen, die eine physikalische Barriere gegen Krankheitserreger ¹ und Toxinen miteinander verbunden, während die den Durchgang von Wasser und Nährstoffen erforderlich, um den Körper zu stützen. Diese Selektivität ist auf die Polarisation der Epithelzellen, die zwei verschiedene Membrandomänen erzeugt: die apikale Seite der Zellen in das Lumen und der basalen Seite der Zellen auf das darunter liegende Gewebe verankert ^2,3 ausgesetzt. Tight Junctions (TJ) sind Komplexe von Proteinen an der apikalen Teil der epithelialen Zellen vorhanden und sind Teil eines größeren Komplex der apikalen Ausfahrt ⁴ bekannt. Ionenfluss über die Barriere Gewebe kann entweder gehen über den transzellulären (durch die Zelle) oder über einen parazellulären (zwischen zwei benachbarten Zellen)-Weg. Die Summe derder Transport durch beide Wege als transepithelialen Widerstand bekannt. Der apikale Übergang ist für die Regulierung von Ionen und Molekülen durch die Barriere hindurch ^5,6 über eine bestimmte Öffnungs-und Schließfunktion verantwortlich. Eine Dysfunktion oder Störung dieser Proteinkomplexe wird oft Krankheit ^7-11 stehen. Darüber hinaus sind viele enterischen Pathogenen / Toxine bekannt, speziell auf diese komplexe, wodurch der Körper und die Eingabe, die zu Durchfall, wahrscheinlich als Folge einer massiven Fehlregulation der Ion / Wasserstrom über die Barriere ^12-14. Wandgewebes kann auch durch Veränderung der extrazellulären Mikroumgebung modifiziert werden. Cadherin ist ein kritischer Protein für Zell-Zell-Adhäsion und bei der Bildung des apikalen Übergang beteiligt. Calcium ist für die korrekte strukturelle Konformation Cadherin erforderlich, und eine Abnahme der extrazellulären Calcium wurde gezeigt, dass die Zerstörung der Zell-Zell-Übergang und einem anschließenden Öffnen des Ergebnissesparazellulären Weg zwischen den Zellen ^15. In dieser Studie, EGTA (Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetra Essigsäure), ein spezifischer Calcium-Chelator, wurde verwendet, um eine Verletzung der Barrieregewebe zu induzieren, wie es wurde gezeigt, dass eine schnelle und drastische Auswirkungen auf die parazellulären Ionen fließen ^16,17 zu haben. Diese Calcium-Chelator auf einer konfluenten Monoschicht von differenzierten Caco-2-Zelllinie verwendet. Kultiviert in Zellkultureinsätzen, ist diese Zelllinie bekannt, die Eigenschaften des Magen-Darm-Trakt zu entwickeln und wird von der pharmazeutischen Industrie verwendet, um die Absorption von Arzneimitteln ^18,19 testen.

Methoden zur Barriere Gewebeintegrität überwachen sind reichlich vorhanden. Diese Verfahren sind oft optische, sich auf Immunfluoreszenzfärbung von bestimmten Proteinen bekannt, am apikalen Übergang ²⁰ sein oder sich auf der Quantifizierung eines fluoreszierenden Tracermoleküls, die normalerweise undurchlässig für das Sperrgewebe21,22. Allerdings sind markierungsfreien Methoden (dh ohne Fluorophor / Chromophor) vorzuziehen, da die Verwendung eines Etiketts können Artefakte entstehen, und oft erhöht die Kosten-und Testzeit. Elektrische, markierungsfreie Überwachung der Barriere Gewebe wurde vor kurzem als eine dynamische Überwachungsmethode ²³ entstanden. Beispielsweise die jüngsten technologischen Fortschritte in der elektrischen Impedanz-Spektroskopie haben die Entwicklung eines kommerziell verfügbaren Scanvorrichtung, die ^24,25 transepithelialen Widerstandes (TER), eine Messung der Ionenleitfähigkeit in der Zellschicht messen erlaubt.

Organische Elektronik ist eine einzigartige Gelegenheit, die Welt der Elektronik und Biologie ^{26,27 28,29} durch Verwendung leitfähiger Polymere, die sowohl elektronische und ionische Träger leiten kann Schnittstelle erstellt. Eine neue Technik, um Verstöße bei der Verwendung der OECT ^30-32 Barriere Nachweis von Gewebe wurde erst kürzlich eingeführt. Dieses Gerät wurde gegen uns bestehenden Techniken validierted barriereGewebeIntegrität, einschließlich Immunfluoreszenz, Durchlässigkeit Tests unter Verwendung von Lucifer Gelb und Impedanzspektroskopie mit Hilfe der Cellzscope beurteilen. Im Fall aller toxischen Verbindungen getestet, die OECT wurde festgestellt, dass gleiche oder bessere Empfindlichkeit zu arbeiten, und mit erhöhter zeitlicher Auflösung, verglichen mit den oben genannten Techniken. In dieser Vorrichtung, PEDOT: PSS, ein leitendes Polymer, das gezeigt worden ist, stabil und biokompatibel ^33,34 wird, wird als das aktive Material in dem Transistorkanal verwendet. Die OECT aus Drain-und Source-Elektroden auf beiden Seiten einer leitenden Polymer-Kanal besteht. Diese wird dann in Kontakt mit einem Elektrolyten, der Bestandteil der Vorrichtung bildet platziert. Eine Gate-Elektrode in den Elektrolyten (1) eingetaucht ist, und wenn eine positive Gate-Spannung an das Gate angelegt wird, werden Kationen aus dem Elektrolyten in den Kanal gedrückt wird, so Entdotieren des leitenden Polymers und was zu einer Änderung in den Source-Drain Strom. Der device ist somit extrem empfindlich auf kleinste Veränderungen in der Ionenfluss durch Verstärkung durch den Transistor. Eine Zellschicht auf einem Zellkultureinsatz gewachsen wurde zwischen der Gateelektrode und dem leitenden Polymerkanal angeordnet. Das Vorhandensein eines intakten Zellschicht als Barriere für die Kationen der Eingabe in den leitenden Polymer daher in der Gegenwart eines intakten Monoschicht wirkt der Drain-Strom abnimmt (Fig. 2: Übergang vom Bereich a bis b). In Gegenwart einer toxischen Verbindung, wird das Sperrgewebe allmählich verlieren ihre Integrität und ließ die Kationen in die Polymerfolie ein und Erhöhung des Drain-Stroms (Fig. 2: C-Region). Mit dieser Technik wird die Verletzung der Barrieregewebe durch die Modulation des Drainstroms gesehen, entsprechend der Modulation der Fluß durch die Monoschicht. Dieses Gerät ist in der Lage, kleinste Schwankungen der Ionenfluss mit bisher unerreichten Zeitauflösung und Empfindlichkeit in Echtzeit zu messen. Diese Technologie will von Interesse im Bereich der Toxikologie für Drogentests, Krankheitsdiagnose oder Grundlagenforschung als die Barriere Modell kann leicht angepasst werden kann. Dieses Verfahren wird auch helfen, Tierversuche zu verringern, da es die Validierung der in vitro-Modelle in vivo-Tests zu ersetzen.

Protokoll

1. PEDOT: PSS Herstellung der Lösung

1. 50 ml von PEDOT: PSS, Äthylenglykol (erhöht Leitfähigkeit) in einem Volumenverhältnis von 1:4 (Ethylenglykol zu PEDOT: PSS), 0,5 &mgr; l / ml Dodecylbenzolsulfonsäure (DBSA) als Tensid und 10 mg / ml 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOPS) als Vernetzer, um die Haftung des leitenden Polymers auf dem Glasträger zu fördern.

2. OECT Fabrication (Fig. 3)

1. Definieren thermisch verdampft Gold Source-und Drain-Kontakte via Lift-off-Lithografie:
   1. Schleuderbeschichtung Photoresist auf einem normalen sauberen Glasobjektträger bei 3000 Upm für 30 Sekunden. Glasmaße sind in 3 x 1 Zoll
   2. Muster eingrenzen Photolithographie. Maße verändert werden, aber die hier aufgelisteten Maße wurde gezeigt, dass die optimale Empfindlichkeit führen. Dann mit einem Entwickler.
   3. Verdampfen 5 nm und 100 nm Chrom und Gold auf.
   4. Lift-off der Photoresist in einer WechselAzeton-Bad für 1 Stunde, so dass das Substrat mit der Source-und Drain-Kontaktbereich Au.
2. Die gewünschte Länge der PEDOT: PSS-Kanal ist 1 mm. Dies wird durch Strukturieren unter Verwendung eines Parylen-C (Pa-C) Abziehfolie Technik erzielt:
   1. Legen 3,5 g Pa-C in der Beschichtung Setup. Gleichmäßig verdampfen 2 um Parylene-C auf der Oberseite des Substrats mit Au-Kontakten.
   2. Muster der Kanal durch Photolithographie:
      1. Schleuderbeschichtung Photoresist bei 3000 Upm für 30 Sekunden.
      2. Eine Maske zu beleuchten Kanal und Goldkontakt 20 Sek. UV, wird der belichtete Fotolack löslich werden im Entwickler.
      3. Verwenden Entwickler die Kanalbereich auf dem Fotolack zu öffnen.
   3. Ätzen des Pa-C in der Kanalbereich durch eine 15 min Plasmaschritt (O ₂ (50 sccm) und CHF ₄ (3 sccm) Plasma bei 160 W), um den Kanal und die Goldkontakt zu öffnen.
3. Zahlen Sie die PEDOT: PSS Mischlösung durch Schleuderbeschichtung auf500 rpm für 45 sec. Backen für 30 sek bei 110 ° C.
4. Peel-off der Pa-C zeigen die PEDOT: PSS-Kanal des Substrats darunter. Dieser Kanal sollte etwas mit den Au-Kontakte im Protokoll Nr. 1 gemacht lappen.
5. Bake Proben für 1 Stunde bei 140 ° C unter atmosphärischen Bedingungen.

3. Geräte-Montage

1. Machen PDMS durch Mischen von zwei Lösungen (in der Regel in einem Kit zusammen geliefert) in einem Verhältnis 1:10 Härterlösung in der Basislösung. Backen für 1 h bei 120 ° C.
2. Entwerfen Sie gut durch die Verwendung eines Locher und schneiden ein Quadrat um den gewünschten Bereich.
3. Kleben Sie ein PDMS auch auf dem Kanal, in einem Kanal von ca. 6 mm ² führen. Stellen Sie sicher, dass die Source-und Drain-Kontakte nicht abgedeckt sind.
4. Machen Sie einen Kunststoffträger mit einem Loch drin (kann die Halterung für die Zellkultureinsatz zu verwenden) und kleben Sie es auf der Oberseite der PDMS dann. Lassen Sie es über Nacht trocknen.
5. Testen Sie das auch für die Weitergabe von Vorbefüllen mit watäh.
6. Löten elektrischen Leitungen auf der Source-und Drain-Kontakt mit Zinn.

4. Zellkultur

1. Zellkulturmedien herzustellen, wie folgt:
   1. In DMEM Fügen 1% Glutamine 10% Fetal Bovine Serum 0,5% Penicillin Streptomycin und 0,1% Gentamycin.
   2. Sterilisieren der Zellkulturmedien mit einer sterilen Filtervorrichtung.
2. Aufrechterhaltung Caco-2-Zellen zwischen Passage 49 und 68 bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ in Zellkulturmedien.
3. Teilen Sie die Zellen einmal in der Woche mit Trypsin und Samen bei 1,5 x 10 ⁴ Zellen / Insert.
4. Ändern Zellkulturmedien zweimal pro Woche über 3 Wochen.

5. Messungen mit OECT

1. Verbinden einer Ag / AgCl-Draht auf eine Source zur Verwendung als Gate-Elektrode. Tauchen Sie die Spitze in Zellkulturmedien, die als Elektrolyt verwendet wird, wie in Fig. 1a dargestellt.
2. Die Drähte von Source und Drain zu ter Source (Zweikanal-Setup).
3. Tragen Sie einen Rechteckimpuls positive Spannung (V _GS) zwischen dem Gate und Source (als Referenzelektrode verwendet: Erde). Eine negative Konstantspannung zwischen Drain und Source (V _DS) aufgebracht wird und die entsprechenden Strom (I _DS) wird gemessen.
4. Verwenden Sie einen PC laufenden Programm die Datenerfassung. In einer angepassten Erfassungsprogramm eingegeben OECT Parameter sollten wie folgt sein: V _DS = -0,2 V, V _GS = 0,3 V, V _GS auf Zeit = 2 Sek., Aus-Zeit = 28 sek.
5. Lesen Sie Source-Drain-Strom (I _DS) und Gate-Strom (I _GS). Führen Sie die Messung für mehrere Minuten bis eine stabile Basislinie Signals zu gewährleisten.

6. Die Integration von Zellen mit OECT für Mess-

Hinweis: Vor dem Experiment kann die Integrität der Zellschicht durch Messen TER mit einem Impedanzspektroskopievorrichtung verifiziert werden. TER von jeweils 3 Wochen alte Caco-2 Zell insert sollte oberhalb von 400 Ω cm ^{2 sein..}

1. In der Nebenzeit von OECT Messung: Entfernen Sie die Gate-Elektrode aus dem Elektrolyten, beinhalten die Zellkultureinsatz, und ersetzen Sie die Gate-Elektrode im Inneren der Zellkultureinsatz.
2. Führen Sie eine Baseline-Messung mit den Zellen für mehrere Minuten, um ein stabiles Signal zu gewährleisten. Diese Grundlinie wird für die Berechnung der normalisierten Wert entsprechend einer intakten Monoschicht (0) verwendet werden.

7. Vorbereitung und Einleitung der toxischen Verbindung

1. Vorbereitung einer 1 M Lösung von EGTA in DI-Wasser, zuerst den pH-Wert der Lösung auf 7,4 mit Tris-Base.
2. In EGTA-Lösung in das entsprechende Volumen, um die gewünschte Konzentration (zB zwischen 5 mM und 100 mM) unter Berücksichtigung der Volumen zu erhalten. Die EGTA sollte bei der Aus-Zeit in der basalen Kammer hinzugefügt werden.
3. Messen Sie kontinuierlich für 90 min in Protokoll 5. Wenn die Messung being durchgeführt bei Raumtemperatur wurde die Stabilität der Zellen nicht konstant nach 90 min bleiben.
4. Am Ende des Versuchs, kratzen die Zellschicht zu einer vollständigen Zerstörung der Sperrschicht und Messung für 15 min Ergebnis konnte dieser Punkt durch Entfernen des Filters und das Eintauchen der Gate-Elektrode in den Medien durchgeführt werden. Diese Grundlinie wird für die Berechnung der normalisierten Wert entsprechend einer Monoschicht zerstört werden.

Ergebnisse

Während des ersten Schritts der Messung kann der Drainstrom etwas variieren, aber in den meisten Fällen sollte stabil bleiben (Fig. 2, Abschnitt a). Wenn das Signal nicht stabil ist, ist der Transistor entsorgt und ersetzt werden. Diese Stabilitätsprüfung gewährleistet auch, dass alle Anfangsverluste in der Leitfähigkeit des Gerätes beeinträchtigen nicht die Folgebewertung. Nach mehreren Minuten der Messung ist der Einsatz mit Zellen bilden Gewebe Barriere auf der Oberseite des Kanals angeordnet...

Diskussion

Diese Technik stellt ein neues Verfahren, um eine organische elektrochemischen Transistor mit lebenden Zellen zu integrieren, um Sperrgewebeintegrität zu messen. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind die Schnelligkeit und Empfindlichkeit, sondern auch die geringen Kosten der Vorrichtung zur dynamischen Überwachung eines Wandgewebes.

Da diese Methode lebende Zellen verwendet, ist ein kritischer Punkt, um sicher sein, eine Monoschicht, die eine intakte Barriereschicht darstellt verwenden....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clevios pH 1000	Heraus Clevios
AZ9260 resin	Cipec Specialties
Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA)	Acros Organic
3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS)	Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Culture insert Millicell  PET 0.4 μm Millipore	Dominique Dutscher	51705
24-well Cell culture plate BD Falcon	Dominique Dutscher	51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM	Dominique Dutscher	51246
Advanced DMEM Marque GIBCO	Fisher Scientific	E3434T
FBS Heat Inact.	Fisher Scientific	E3387M
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific	E3470C
GlutaMAX	Fisher Scientific	E3524T
Trypsin 0.05% EDTA	Fisher Scientific	E3513N
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma Aldrich	E4378
Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%,	Sigma Aldrich
Caco-2 cells	ATCC
PDMS	Dow Corning	SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER
Au (99.99%)	NEYCO	AU3X6
Chromium (99.95%)	NEYCO
Parylene C	Specialty Coating Systems
Ag/AgCl wire	Harvard Apparatus
Photoresist	Cipec Specialties