Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

Resumo

O transistor Electrochemical orgânica é integrado com células vivas e utilizado para monitorizar o fluxo de iões através da barreira epitelial gastrointestinal. Neste estudo, um aumento no fluxo de iões, relacionada com a ruptura das junções apertadas, induzida pela presença de EGTA quelante de cálcio (ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N ', N'-tetra-acético ácido), é medida.

Resumo

O tracto gastrointestinal é um exemplo do tecido de barreira, que proporciona uma barreira física contra o ingresso de agentes patogénicos e toxinas, enquanto permitindo a passagem de iões e moléculas necessárias. A quebra neste barreira pode ser causada por uma redução na concentração de cálcio extracelular. Esta redução na concentração de cálcio provoca uma alteração conformacional nas proteínas envolvidas na vedação da barreira, o que leva a um aumento do fluxo paracelular. Para imitar o efeito do cálcio nos quelantes ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N ', N'-ácido acético tetra (EGTA) foi usado em uma monocamada de células que se sabe ser representativa do tracto gastrointestinal. Já existem métodos para detectar o rompimento do tecido de barreira, tais como os ensaios de imunofluorescência e de permeabilidade. No entanto, estes métodos são demorados e dispendiosos e não é adequado para as medições dinâmicas ou de alto rendimento. Métodos eletrônicos para medir o tecido barreiraintegridade existem também para a medição da resistência transepitelial (TER), no entanto, estes são muitas vezes dispendioso e complexo. O desenvolvimento de métodos rápidos, baratos e sensíveis é urgentemente necessário, pois a integridade do tecido barreira é um parâmetro fundamental na descoberta de medicamentos e diagnósticos patógeno / toxina. O transístor eletroquímico orgânico (OECT) integrado com tecido barreira células formadoras tem sido mostrado como um novo dispositivo capaz de monitorar de forma dinâmica a integridade do tecido de barreira. O dispositivo é capaz de medir pequenas variações no fluxo iónico com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade, em tempo real, como um indicador da integridade do tecido de barreira. Este novo método é baseado num dispositivo simples que pode ser compatível com aplicações de rastreio de elevada capacidade e fabricada a baixo custo.

Introdução

O epitélio gastrintestinal é um exemplo do tecido de barreira, a qual controla a passagem das moléculas entre os diferentes compartimentos do corpo. O epitélio constituído por células colunares alongadas unidas por complexos de proteínas que proporcionem uma barreira física ¹ contra agentes patogénicos e toxinas, enquanto permitindo a passagem de água e os nutrientes necessários para sustentar o organismo. Esta selectividade é devido à polarização das células epiteliais, o que cria dois domínios de membrana diferentes: o lado apical das células expostas à luz, e o lado basal das células ancoradas nos tecidos subjacentes ^2,3. Tight junctions (TJ) são complexos de proteínas presentes na porção apical das células epiteliais e são parte de um complexo maior conhecida como a junção apical ^4. O fluxo de íons através do tecido de barreira pode ou ir através do transcelular (através do celular) ou via um paracelular (entre duas células adjacentes) via. A somao transporte através de ambas as vias é conhecida como a resistência transepitelial. A junção apical é responsável pela regulação de íons e moléculas que passam através da barreira ^{de 5,6} por meio de uma abertura específica e função de fechamento. Uma disfunção ou perturbação destes complexos de proteína é muitas vezes relacionados com a doença ^7-11. Além disso, muitos patógenos entéricos / toxinas são conhecidos por atingir especificamente esse complexo, entrando assim o corpo e levando a diarréia, provavelmente como consequência da desregulação maciça de fluxo de íons / água através da barreira ^12-14. Tecido de barreira pode também ser modificado, alterando o microambiente extracelular. Caderina é uma proteína crítica para a adesão célula-célula, e está envolvido na formação da junção apical. O cálcio é necessário para a conformação estrutural correcta da caderina, e uma diminuição no cálcio extracelular foi mostrado para provocar a destruição da junção célula-célula e uma abertura subsequente dovia paracelular entre as células ^15. Neste estudo, EGTA (etileno-glicol-bis (beta-amino-etil éter)-N, N, N ', N' ácido acético, tetra-), um quelante de cálcio específico, foi utilizada para induzir a quebra da barreira de tecido, uma vez que possui mostrado ter um efeito drástico sobre a rápida e paracelular de iões fluem ^16,17. Esse quelante de cálcio foi utilizado em uma monocamada confluente e diferenciado da linha celular Caco-2. Cultivados em inserções de cultura de células, é conhecido nesta linha de células para o desenvolvimento das características do tracto gastrointestinal e é amplamente utilizado na indústria farmacêutica para testar a absorção de fármacos ^18,19.

Métodos para monitorar a integridade do tecido barreira são abundantes. Estes métodos são muitas vezes óptico, baseando-se coloração por imunofluorescência de proteínas particulares conhecidos como sendo na junção apical ^20, ou baseando-se na quantificação de uma molécula de marcador fluorescente que é normalmente impermeável ao tecido de barreira21,22. No entanto, os métodos de livre-etiqueta (isto é, sem um fluoróforo / cromóforo) são preferíveis, como o uso de um rótulo pode incorrer artefactos, e frequentemente aumenta o custo e tempo de ensaio. Elétrica, monitoramento sem etiqueta de tecido barreira surgiu recentemente como um método de monitoramento dinâmico ^23. Por exemplo, os recentes avanços tecnológicos na espectroscopia de impedância eléctrica têm permitido o desenvolvimento de um aparelho de digitalização comercialmente disponíveis ^24,25 que pode medir a resistência transepitelial (TER), uma medição da condutância de iões através da camada de células.

A eletrônica orgânica criou uma oportunidade única para interagir no mundo da eletrônica e biologia ^{26,27 28,29} usando polímeros condutores que podem conduzir ambas as companhias eletrônicas e iônicas. Uma nova técnica para detectar falhas no tecido barreira usando o OECT ^30-32 foi recentemente introduzido. Este dispositivo foi validado contra as técnicas existentes nosed para avaliar a integridade da barreira de tecido, inclusive de imunofluorescência, ensaios de permeabilidade utilizando Lúcifer amarelo, e espectroscopia de impedância usando o Cellzscope. No caso de todos os componentes tóxicos testados, o OECT foi encontrado a operar com uma sensibilidade igual ou melhor, e com o aumento da resolução temporal, em comparação com as técnicas anteriores. Neste dispositivo, PEDOT: PSS, um polímero condutor que tem sido mostrado para ser estável e biocompatível ^33,34, é usado como o material activo no canal de transístor. O OECT é composto por eléctrodos de dreno e fonte de cada lado de um canal de polímero condutor. Este é, então, colocada em contacto com um electrólito, o qual constitui parte integrante do dispositivo. Um eléctrodo de porta é imerso no electrólito (Figura 1), e, quando uma tensão de porta positiva é aplicada à porta, catiões de electrólito é forçado para dentro do canal, dedoping assim o polímero condutor, resultando numa alteração na fonte-dreno corrente. O device é, portanto, extremamente sensível a pequenas mudanças no fluxo iónico devido à amplificação do transistor. A camada de células cultivadas em uma inserção de cultura de células foi colocada entre o eléctrodo de porta e o canal de polímero condutor. A presença de uma camada de células intactas actua como barreira para os catiões de entrar no polímero condutor, por conseguinte, na presença de uma monocamada intacta, as quedas de corrente de drenagem (Figura 2: transição da região A para B). Na presença de um composto tóxico, o tecido de barreira vai perder gradualmente a sua integridade, deixando os catiões introduzir na película de polímero e aumentar a corrente de drenagem (Figura 2: região c). Com esta técnica, a ruptura do tecido de barreira é visto pela modulação da corrente de escoamento, correspondente à modulação do fluxo através da monocamada. Este dispositivo é capaz de medir pequenas variações no fluxo iônico com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade em tempo real. Este wil tecnologial ser de interesse no domínio da toxicologia para o teste de drogas, diagnóstico de doenças ou pesquisa básica como o modelo de barreira pode ser facilmente adaptado. Este método também ajudará a reduzir a experimentação animal, uma vez que permite a validação de modelos in vitro para substituir os ensaios in vivo.

Protocolo

1. PEDOT: PSS Solução Preparação

1. Para 50 ml de PEDOT: PSS, adicionar etileno glicol (aumenta a condutividade) numa proporção em volume de 1:4 (etileno-glicol para PEDOT: PSS), 0,5 mL / mL de ácido dodecilbenzenossulfónico (DBSA) como um surfactante, e de 10 mg / ml de 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano (GOPS) como um agente de reticulação para melhorar a adesão do polímero condutor para a lâmina de vidro.

2. OECT Fabrication (Figura 3)

1. Definir evaporado termicamente contatos de fonte e dreno de ouro via decolagem litografia:
   1. Gire casaco photoresist em uma lâmina de vidro limpa normal, a 3.000 rpm por 30 seg. Dimensões de vidro são 3 em x 1 pol
   2. Definir padrões por fotolitografia. As dimensões podem ser alteradas, porém as dimensões listadas aqui foram mostrados para causar a sensibilidade ideal. Em seguida, use um desenvolvedor.
   3. Evaporar 5 nm e 100 nm de cromo e ouro, respectivamente.
   4. Levante-off o fotorresiste em um acbanho Etone por 1 hora, deixando o substrato com a fonte e dreno só Au área de contatos.
2. O comprimento desejado do PEDOT: PSS canal é de 1 mm. Isto é conseguido pela padronização usando um parylene-C (Pa-C) técnica peel-off:
   1. Coloque 3,5 g de Pa-C na configuração de revestimento. Uniformemente evaporar 2 mM de parileno-C na parte superior do substrato com Au contactos.
   2. Padrão do canal por fotolitografia:
      1. Gire casaco photoresist a 3.000 rpm por 30 seg.
      2. Use uma máscara para iluminar canal e contato de ouro 20 seg a UV, o fotorresiste exposto vai se tornar solúvel no desenvolvedor.
      3. Use desenvolvedor para abrir a área de canal no fotorresiste.
   3. Etch do Pa-C na área do canal por um passo de plasma de 15 min (O ₂ (50 sccm) e CHF ₄ (3 sccm) de plasma a 160 W), a fim de abrir o canal e o contacto de ouro.
3. Depositar o PEDOT: PSS solução de mistura por spin coating em500 rpm durante 45 segundos. Asse por 30 segundos a 110 ° C.
4. Peel-off do Pa-C para revelar o PEDOT: PSS canal do substrato por baixo. Este canal deve sobrepor-se ligeiramente com a UA contatos feitos no protocolo 1.
5. Amostras Asse por 1 hora a 140 ° C, sob condições atmosféricas.

3. Montagem de dispositivo

1. Adicione PDMS pela mistura de duas soluções (geralmente fornecidos em conjunto num kit) a uma razão 1:10 de solução numa solução de base de cura. Asse durante 1 hora a 120 ° C.
2. Projete bem usando um furador e cortar um quadrado em volta da área desejada.
3. Cole um PDMS bem na parte superior do canal, para resultar numa zona do canal de cerca de 6 mm ^2. Certifique-se de que os contatos de fonte e dreno não são cobertos.
4. Faça um suporte de plástico com um buraco no meio (pode usar o suporte para a inserção de cultura de células) e depois cole-o em cima do PDMS. Deixe-o secar durante a noite.
5. Teste o bem para vazando por prefilling com water.
6. Solde fios elétricos na fonte e dreno contato com estanho.

4. Cultura de Células

1. Preparar meios de cultura de células como se segue:
   1. Em DMEM, adicionar 1% de glutamina, 10% de soro fetal bovino, 0,5% de penicilina-estreptomicina, e 0,1% de gentamicina.
   2. Esteriliza-se o meio de cultura de células utilizando um dispositivo de filtração estéril.
2. Manter a células Caco-2 entre a passagem 49 e 68 a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO _2, em meios de cultura de células.
3. Divida as células uma vez por semana usando tripsina e semente de 1,5 x 10 ⁴ células / inserção.
4. Alterar os meios de cultura de células, duas vezes por semana durante 3 semanas.

5. Medidas com OECT

1. Ligar um fio de Ag / AgCl a uma SourceMeter para utilização como o eléctrodo de porta. Imergir a ponta em meios de cultura de células, que é usado como electrólito, tal como ilustrado na figura 1a.
2. Conecte os fios da fonte e dreno para tele SourceMeter (configuração dual channel).
3. Aplicar um pulso de tensão quadrada positiva (V _GS) entre o portão ea fonte (usado como eletrodo de referência: terra). Uma tensão constante negativa entre dreno e fonte (V _DS) é aplicado e que corresponde corrente (I _DS) é medido.
4. Use um conjunto de dados do programa em execução PC. Parâmetros OECT inseridos em um programa de aquisição personalizado deve ser a seguinte: V _DS = -0,2 V, V _GS = 0,3 V, V _GS no tempo = 2 s, fora do tempo = 28 seg.
5. Leia a corrente fonte-dreno (I _DS) e corrente de gate (I _GS). Efectuar a medição por alguns minutos para garantir um sinal de linha de base estável.

6. Integrando Células com OECT para Medição

Nota: Antes do experimento, a integridade da camada de células pode ser verificada por medição de TER com um dispositivo de espectroscopia de impedância. TER de cada 3 semanas de idade Caco-2 inse celularrt deve ser acima de 400 ^Ω. cm ^2.

1. Durante o tempo fora de medida OECT: Retire o eletrodo de porta do eletrólito, incorporar a inserção de cultura de células, e substituir o eletrodo de porta dentro da inserção de cultura de células.
2. Realizar uma medição de linha de base com as células durante vários minutos, para garantir um sinal estável. Esta linha de base será usada para o cálculo do que o valor normalizado que corresponde a uma monocamada intacta (0).

7. Preparação e Apresentação de composto tóxico

1. Prepara-se uma solução de EGTA a 1 M em água desionizada, ajustando primeiro o pH da solução para 7,4 com Tris base.
2. Adicionar solução de EGTA no volume apropriado para se obter a concentração desejada (por exemplo, entre 5 mM e 100 mM), tendo em conta o volume. O EGTA deve ser adicionado na câmara basal durante o tempo de desligado.
3. Medir continuamente por 90 min como no Protocolo no 5. Se a medida for being realizada à temperatura ambiente, a estabilidade das células não permanecerá constante, após 90 min.
4. No final da corrida, arranhar a camada de células para resultar numa destruição completa da camada de barreira e medida durante 15 minutos, este ponto pode ser feito através da remoção do filtro e a imersão do eléctrodo de porta de meios de comunicação. Esta linha de base será usada para o cálculo de como o valor normalizado que corresponde a uma monocamada destruído.

Resultados

Durante a primeira etapa de medição, a corrente de escoamento pode variar um pouco, mas na maioria dos casos, deve manter-se estável (Figura 2, parte a). Se o sinal não é estável, o transistor deve ser descartado e substituído. Esta verificação de estabilidade também garante que quaisquer perdas iniciais na condutividade do dispositivo não afetam a medição subseqüente. Depois de vários minutos de medição, a inserção com células formadoras de tecido de barreira é colocada na parte su...

Discussão

Esta técnica proporciona um novo método para integrar um transistor eletroquímico orgânica com células vivas para medir a integridade do tecido de barreira. As principais vantagens desta técnica são a rapidez e sensibilidade, mas também do baixo custo do dispositivo de monitorização dinâmica de tecido de barreira.

Como este método usa células vivas, um ponto crítico é ter a certeza de usar uma monocamada, o que representa uma camada de barreira intacta. Os parâmetros da barre...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clevios pH 1000	Heraus Clevios
AZ9260 resin	Cipec Specialties
Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA)	Acros Organic
3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS)	Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Culture insert Millicell  PET 0.4 μm Millipore	Dominique Dutscher	51705
24-well Cell culture plate BD Falcon	Dominique Dutscher	51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM	Dominique Dutscher	51246
Advanced DMEM Marque GIBCO	Fisher Scientific	E3434T
FBS Heat Inact.	Fisher Scientific	E3387M
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific	E3470C
GlutaMAX	Fisher Scientific	E3524T
Trypsin 0.05% EDTA	Fisher Scientific	E3513N
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma Aldrich	E4378
Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%,	Sigma Aldrich
Caco-2 cells	ATCC
PDMS	Dow Corning	SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER
Au (99.99%)	NEYCO	AU3X6
Chromium (99.95%)	NEYCO
Parylene C	Specialty Coating Systems
Ag/AgCl wire	Harvard Apparatus
Photoresist	Cipec Specialties