Sıçangiller Kornea Nakli: Katı Organ Nakli En Yaygın Formu Eğitim için Bir Model

Özet

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Özet

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Giriş

Kornea nakli insanlarda yapılan transplantasyon en başarılı ve yaygın türlerinden biridir. Bu ameliyatı yapılır neden nedenleri yaralanma, bulaşıcı hastalık, ¹ ya da bulaşıcı olmayan kornea hastalığının ² diğer formları bir sonucudur. Amerika'nın Göz Bankası Derneği rakamlar 46.000 (: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html at web sitesine bakınız) 2011 yılında yapılmıştır göstermektedir. Başarısının bir göstergesi allojenik kornea greft için bir yıllık başarısızlık oranları 10 ila% 15 ve başarı% 70 ^3-8 aşan 5 yıl olarak değişir olmasıdır. Birçok araştırma göstermiştir ki gibi, kornea allograftlann başarısı doğrudan göz immünolojik olarak ayrıcalıklı bir site olduğunu gerçeği ile ilgilidir. Bir bağışıklık ayrıcalık site olarak kornea durumundan sorumlu faktörler suppres kornea tarafından üretilen korneada ikisi de kan ve lenf damarlarının eksikliği, antijen sağlayan hücreler bir nispi olmaması, faktörlerini içeririmmün efektör fonksiyonlar ^9-15 s, MHC düşük sentezleme ¹⁶ antijenleri ve FasL ^17-20 ifadesi.

Ancak, başarı için bu greft predispozan bu faktörlerin rağmen, onlar ret ^3-7 tabi yoktur. Sonuç olarak, bu ret arabuluculuk bu mekanizmaları anlamak yanı sıra reddini önlemek için çeşitli terapiler test kritik önem taşımaktadır. Bu amaçla, biz burada kontrollü bir deney ortamında kornea nakli incelemek için 20 yıldır kullanılmakta olan kornea naklinin bir fare modeli tarif. Transplantasyon tepkiler nihai nakledilen doku başarısız veya başarılı olup olmadığını belirleyecek uyum içinde çalışan birçok farklı faktörü içeren bu yana, herhangi bir in vitro modelde bu faktörlerin önemini anlamak mümkün değildir. Sonuç olarak, sağlam hayvanları ile yapılan çalışmalarda başarı veya failu ya önemli olan hangi faktörlerin belirlenmesi gerekmektedirnakledilen dokuların yeniden.

Diğer hayvan türlerinin kornea nakli incelemek için kullanılmış olsa da, diğer türler ile karşılaştırıldığında, sıçangil modeli birçok avantajı vardır. İlki, belli transjenleri veya fonksiyon nakli daha iyi ele alınabilir spesifik immünolojik faktörlerin ifadesini yoksun gen hedef alınmıştır farelerin birçok suşları varlığıdır. Buna ek olarak, hayvan bir çok diğer türler için mevcut olmayan fareler için spesifik olan ve bir çok tepkin madde (faktörlerini nötralize rekombinant faktörler ve antikorlar, hem de) vardır. Çünkü bu faktörlerin varlığı, bu model akut korneal allogreft cevapları ^{15, 17,18,20 -29} dahil ilgili faktörleri belirlemek için yaygın olarak kullanılır olmuştur. Ayrıca, kornea nakli yer faktörlerinin çoğu, diğer dokuların naklinden işlevsel olduğu da bilinmektedir.

Protokol

NOT: Bu prosedürde kullanılan tüm hayvanlar Vizyon Araştırma Derneği ve Göz açıklamada Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanımı yanı sıra Saint Louis Üniversitesi'nde hayvan gözetim komitesi tarafından belirlenen esaslara uygun olarak tedavi edilir.
NOT: Tüm cerrahi aletler ve çözümleri göz mikrobik enfeksiyonu sınırlamak için ameliyattan önce sterilize edilir. Bu hayvanların bu prosedürden bazı ağrı yaparken, biz analjezik istihdam yok unutulmamalıdır. Tüm analjezikler, anti-inflamatuar ve kornea nakli tepkiler iltihabı içeren bu yana, anti-inflamatuar ilaçların kullanılması kornea greft yetmezliği katılan hangi faktörlerin belirlemek için yeteneği taviz verecek çünkü bu nedeni.

1. Anestezi

1. Ketamin (86 İP enjeksiyonları, genel anestezi altında donör ve alıcı fareler yerleştirin.98 mg / kg) ve ksilazin (13.04 mg / kg).
2. Genellikle bir saat 30 dk sürer işlem boyunca anestezi altında alıcı fare tutun. Sonuç olarak, sürekli bilinç kazanmak herhangi bir işaret için fareyi izlemek.
3. Hayvan kuruluğunu önlemek için uyuşturulduktan sonra ameliyat olmaz göze puralube merhem sürün.

2. Kornea Tırnak

1. Donör kornea düğmesine elde edilmesi.
   1. Hayvan tamamıyla anestezi sonra,% 1 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin hidroklorid göz damlası, bir çift uygulama yoluyla yeterli midriasis elde eder.
   2. Yatay sağlam bir hareketli destek üzerine yerleştirilen bir gemide donör hayvanın başını yerleştirin. Göz tüm işlem boyunca yatay konumda olduğundan emin olmak için boyunda bant şeridi ile baş sabitleyin.
   3. Üzerinden, Ucu metil mavisi ile boyanmış, bir 2 mm çapında trepan kullanılarak,Santral kornea greft sıralanıyor.
   4. Keskin bir bıçak ile, kornea nüfuz ve donör endotel ve altta yatan merceğine zarar şansını azaltmak için bunu derinleştirmek için ön kamaraya Healon® enjekte.
   5. Vannas makas ile donör graft pulu ve kullanılana kadar Hanks dengeli tuz çözeltisi içeren bir kabın içine koyun.
   6. Donör greft çıkarılmamış sonra, CO ₂ inhalasyon yoluyla donör fare euthanize.
2. Greft yatağı hazırlamak.
   1. Alıcı için 2.1.2'de yoluyla 2.1.1 açıklandığı gibi aynı adımları tekrarlayın.
   2. 1.5 mm çaplı trefin kullanarak, alıcı greft özetlemektedir.
   3. Keskin bir bıçak ile, kornea nüfuz ve altta yatan merceğine zarar şansını azaltmak için bunu derinleştirmek için ön kamaraya Healon® enjekte.
   4. Vannas makas kullanılarak alıcıdan özetlenen santral kornea düğmesini çıkarın ve atın.
3. Sütüreaşı
   1. Alıcının kornea yatak greft üzerinde donör kornea yerleştirin. Yeterli Healon lens ile doğrudan temas yoluyla zararlardan donör endotel hücreleri korumak için donör kornea altında olduğundan emin olun.
   2. Süper ince uçlu microforceps kullanarak, daha sonra kapalı kravat, alıcının tarafında tam kalınlığının% 90 derinliğe sahip donör yoluyla, donör tarafına 11-0 naylon dikiş ilk ısırık yerleştirin.
   3. Kornea sabitlenebilir sonra, kornea 8-10 toplam dikiş sahiptir ve verici kornea güvenli dizilmiş ve alıcı korneal aşı yatağa bağlanmasına imkan verecek şekilde midcardinal sütürler gerçekleştirin.
4. Anteryor odacığını derinleştirme
   1. Ön kamaraya HBSS veya hava kabarcığı enjekte ederek ön kamara derinleştirmek ve yavaşça selüloz bir süngerle sızıntı kornea greft bütünlüğünü kontrol edin.
      NOT: Ön kamara reforme edilemez Eğer c yüksek bir olasılık varnakledilen korneanın gelecekteki değerlendirmeler çok zor hale getirecek ve aynı zamanda potansiyel donör kornea endotel disfonksiyonu ve böylece greft yetmezliğine yol açacaktır ataract.
5. Nihai değerlendirme
   1. Öğrenci yuvarlak ve ön kamara derinliği normal olduğunu belirlemek için göz gözlemleyin.
      NOT: Bu iris dikilmesi sırasında zarar görmüş olduğunu gösterir ve böylece greft teknik bir arıza olarak kabul edilir yuvarlak öğrenci değilse.
   2. Göze antibiyotik merhem sürün. İsteğe bağlı: 7-0 ipek sütür ile göz kapağını kapatın.
   3. Tamamen uyanık ve daha sonra tek tek ameliyat sonrası iki gün en az onları barındıracak kadar fareler gözlemleyin.

3. Dikiş Kaldırma

1. Kapak dikiş kullanılır Bu durumda, yukarıda tarif edildiği gibi fareler anestezi ve 48 saatte kapak dikiş çıkarın.
2. Postoperatif 7. günde fareler uyutmak. Sütür çıkarınes kornea grefti güvence. Dikişler ve hayvan tamamen uyanmış sonra, kendi kafesine geri.

4. Klinik Değerlendirme

1. (Ön kamarada kan) katarakt (lens bulanıklıklarına), hifemayı dahil komplikasyon endikasyonları göz, uygun derinlik, ya da kornea önemli donukluk değil bir ön kamara inceleyin. "Taviz" olarak bu komplikasyonların arttığını olanlar düşünün ve CO ₂ inhalasyon yoluyla onları euthanize.
   1. Unanesthetized fareler üzerinde tüm sınavları gerçekleştirmek. Öte yandan gözün daha iyi bir görünüm sağlamak için göz proptose böylece bir yandan böylece fareyi frenleyici ile fare tuşunu basılı tutun. Gözlemler tamamlandıktan sonra, kendi kafesine hayvan dönün.
2. Tedavi grupları ile yabancı bir gözlemci kornea greft belirtileri kornealar 2-3 kez bir hafta nakledilen değerlendirebilir mırejeksiyon atakları veya kornea greft yetmezliği. Cerrahi mikroskop veya bu gözlemler için bir yatay yarık-lamba biyomikroskop kullanın.
   1. Aşağıdaki gibi ölçek tanımlanır 5'e kadar 0 bir ölçek kullanılarak donukluk her korneayı değerlendirin:
      1. Donukluk emaresi var bu kornealar için 0 puan atayın.
      2. Minimal yüzeyel opaklık gösterir bu kornealara 1 puan atayın.
      3. Hafif ve derin donukluk görüntülemek ancak altta yatan öğrenci ve iris hala discernable kornealara 2 puan atayın.
      4. Iris öğrenci marjlarının haricinde detaylı olarak görülemez burada stromal donukluk görüntülemek korneaya 3 puan atayın.
      5. Yoğun stromal donukluk gösterilecek ve altta yatan yapılar görülebilir eğer kornea 4 puan atayın.
      6. Tamamen gizlenmiş öğrenci ve iris ile tam donukluk ve yoğun stromal ödem, görüntülemek korneaya 5 puan atayın.
   2. Aynı zamanda, damar infiltrasyon (neovaskülarizasyon) Bunun için 1 ile 8 arasında bir derecelendirme ölçeği kullanarak derecesi her kornea değerlendirilmesi 4 eşit kadranın oluşan olarak kornea görebilir ve bu kadranın her kan damarlarının miktarının belirlenmesi Bu kadranda geniş vaskularizasyonu 2 0 (gemiler) o irade aralığı puan. Son neovaskülarizasyon puanı hesaplamak için her kadrandan bireysel puanları ekleyin.
   3. Onlar 5 hafta kadar puan süre üst üste iki gözlem için 3 puan var sanki akut reddedilen kornealar sınıflandırır.
   4. Olan korneaları 5 hafta netti fareler sınıflandırmak ama tabi geç dönem kornea alograf sahip olarak,> 45 gün üst üste iki kez puan için 3 puan ile, engrafmanda sonrası zamanlarda donuklaşmalarını geliştirmek. Greft sağ kalımı analiz Kaplan-Meier sağkalım eğrileri kullanın.

Modelin 5. Manipülasyon

in sol: 40px; ">

Dalaktan tek hücre hazırlanması.

1. Tek hücre hazırlamak için, öncelikle donör fare euthanize. Sonra, dalak çıkarın.
2. Bir hücre süzgecinden dalak yerleştirin ve 3 ml şırınga bir şırınga pistonu ile bozabilir.
3. Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi, 10 ml hücreleri ve tekrar süspansiyon yıkayın.
4. Hücre süspansiyonu 10 ul çıkarın ve% 0.4 tripan 10 ul mavi ilave edilir ve karıştırılır. Merkezi ızgara hücreleri hemositometrede bu ekleyin ve saymak. Tüp içinde hücre sayısı ve hücre sayısı x 10 ⁴ x 2 (tripan mavi seyreltme faktörü) 10 (tüp içinde hacmi) X.

Ön kamaraya enjeksiyonu.

1. Daha önce tarif edildiği gibi fareler anestezi.
2. Bir mikroskop kullanarak enjeksiyonları gerçekleştirin. Her intrakameral enjeksiyon için, 10 ^6, 0.005 ml hacim içinde dalak hücreleri ve bir 33 G iğne ile donatılmış 0.25 mi mikrolitre şırınga kullanın.
   NOT: Diğer manipülasyonlarModelin, özel bir faktör ortotopik kornea alograft ameliyat sonrası oynayabilir rolü belirlemek için ya da antagonistleri ya da agonistleri olarak hareket eden reaktif olan hayvanların muamele etmek suretiyle gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Kornea naklinin fare modeli başarıyla kornea allogreft reddi ^19-23 ve kornea allogreft kabul ^{13, 15,16,18, 24-27} hem mekanizmasını karakterize etmek için 20 yılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Bu model FasL'yi eksikliği hayvanlarda, kornea allogreft kabul FasL ifade önemini kurmak için kullanılan kornea alograftlarını ¹⁵ kabul etmek mümkün değildi. Aynı zamanda, vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 1 morfolino tedavisi, korneal aşı sağkalımı...

Tartışmalar

Burada açıklanan kornea transplantasyonu mürin modeli faktörler en iyi, hem reddi ^{15,17,18,20, 26-30} ve kornea kabul ^21-25 ile ilişkili olduğunu prediktif olan bir modelinde insan kornea alograft reddini çalışma araştırmacı sağlar allogrefti. Hastalar tedavi etmek ya da önlemek ya da red ^{31 'e} ya da topikal veya sistemik steroid tedavisi verilmiş olup, burada insan kornea transplantasyonu, farklı olarak, bu model, tipik olarak böyle bir tedavinin yokluğunda ret alog...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Surgical Microscope	Zeiss	Rebuilt
1 ml Syringe	BD	305122
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309602
Vannus Scissors	Stortz	E-3387
11-0 Sutures	Alcon	717939M
Trephine 2.0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1.5 mm	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Forceps	FST	11251-20
7-0 Sutures	Alcon	8065
2.5% Phenylephrine HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% Tropicamide	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton Syringe	Hamilton	7654-01
33 gauge needle	Hamilton	90033
Cell Strainer (100 μm nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometer	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154