Murino transplante de córnea: Um modelo para estudar a forma mais comum de Transplante de Órgãos Sólidos

Resumo

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Resumo

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Introdução

O transplante de córnea é um dos tipos comuns e mais bem sucedidas do transplante realizados em seres humanos. As razões pelas quais esta cirurgia é realizada são resultado de uma lesão, ^uma doença infecciosa, ou outras formas de doença não infecciosa de córnea ^2. Números da Associação Eye Bank of America indicam que mais de 46 mil foram realizados em 2011 (veja o site em: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Uma indicação do seu sucesso é que as taxas de falha de um ano por córneas alogênicos variam de 10 a 15% e em 5 anos o sucesso é superior a 70% ^3-8. Como vários estudos têm demonstrado, o sucesso de aloenxertos da córnea está directamente relacionada com o facto de o olho é um local imunologicamente privilegiado. Os factores responsáveis ​​para o status de córneas como um sítio imunologicamente privilegiado incluem a falta de ambos os vasos sanguíneos e linfáticos na córnea, uma ausência relativa de células apresentadoras de antigénios, factores produzidos pela córnea que suppress Funtions efetoras imunes ^9-15, baixa expressão de antigénios MHC ^16, e a expressão de FasL ^17-20.

No entanto, apesar destes fatores predisponentes desses enxertos para o sucesso, eles passam por rejeição ^3-7. Consequentemente, a compreensão desses mecanismos que mediam essa rejeição, assim como testar várias terapias para prevenir a rejeição é de fundamental importância. Para esse fim, nós descrevemos aqui um modelo murino de transplante de córnea, que tem sido usado por mais de 20 anos para estudar o transplante de córnea em um ambiente experimental controlado. Como as respostas de transplante envolve muitos fatores diferentes que trabalham em conjunto que irá final determinam se o tecido transplantado falhar ou for bem-sucedido, não é possível compreender a importância desses fatores em qualquer modelo in vitro. Consequentemente, estudos utilizando animais intactos são necessários para determinar quais fatores são importantes para o sucesso ou failure de tecido transplantado.

Enquanto outras espécies de animais têm sido utilizados para estudar o transplante de córnea, o modelo murino tem diversas vantagens quando comparado com a utilização de outras espécies. A primeira é a existência de muitas cepas de camundongos que expressam certos transgenes ou foram gene-alvo que falta expressão de fatores imunológicos específicos, cuja função no transplante podem ser melhor estudados. Além disso, existem muitos factores de ambos os reagentes (recombinantes e anticorpos que neutralizam factores) que são específicos para os ratos, e que não existem para muitas outras espécies de animais. Por causa da existência desses fatores, este modelo tem sido amplamente utilizado para identificar os fatores relevantes envolvidos em respostas de córnea aguda de aloenxerto ^{15, 17,18,20 -29.} Além disso, muitos dos factores envolvidos no transplante de córnea são também conhecidos para serem funcionais no transplante de outros tecidos.

Protocolo

NOTA: Todos os animais utilizados neste procedimento são tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia declaração para o Uso de Animais em Oftálmica e Vision Research, bem como as diretrizes estabelecidas pelo animal comitê de supervisão em Saint Louis University.
Nota: Todos os instrumentos cirúrgicos e soluções são esterilizadas antes da cirurgia para limitar a infecção microbiana do olho. Deve notar-se que, enquanto os animais experimentam alguma dor com este procedimento, não empregamos analgésicos. A razão para isto é porque todos são analgésicos e anti-inflamatórios vez que as respostas de transplante de córnea envolvem a inflamação, a utilização de drogas anti-inflamatórias iria comprometer a nossa capacidade para determinar quais os factores que estão envolvidos na falha de enxerto da córnea.

1. Anestesia

1. Coloque ratos doadores e receptores sob anestesia geral por meio de injeções IP de cetamina (86.98 mg / kg) e xilazina (13,04 mg / kg).
2. Mantenha o mouse destinatário sob anestesia durante todo o processo, que normalmente leva 30 minutos a uma hora. Consequentemente, monitorar constantemente o mouse para detectar quaisquer sinais de recuperar a consciência.
3. Aplicar puralube pomada para o olho que não vai passar por cirurgia depois que o animal é anestesiado para prevenir o ressecamento.

2. Alongamento de córnea

1. Obtenção do botão da córnea do doador.
   1. Uma vez que o animal é completamente anestesiados, atingir midríase por administração adequada de um par de gotas oculares de tropicamida a 1% e 2,5% de cloridrato de fenilefrina.
   2. Posicione a cabeça do animal doador horizontalmente em uma placa colocada em um suporte móvel resistente. Fixar a cabeça com uma tira de fita adesiva em volta do pescoço para assegurar que o olho está em uma posição horizontal ao longo de toda a operação.
   3. Usando um trephine 2 mm de diâmetro, cuja ponta foi tingida com azul de metileno, para foraforrar o local do enxerto da córnea central.
   4. Com uma lâmina afiada, penetrar na córnea e injectar Healon dentro da câmara anterior para a aprofundar a reduzir a possibilidade de danos no endotélio dador e lente subjacente.
   5. Extirpar o enxerto doador com Vannas tesoura e coloque em um prato contendo solução salina equilibrada de Hanks até o uso.
   6. Após o enxerto de doadores tem sido removido, eutanásia do camundongo doador através de inalação de _CO2.
2. Preparando o leito do enxerto.
   1. Repita os mesmos passos como descrito em 2.1.1 através 2.1.2 para o destinatário.
   2. Usando uma trefina de diâmetro 1,5 mm, delinear local do enxerto destinatário.
   3. Com uma lâmina afiada, penetrar na córnea e injectar Healon dentro da câmara anterior para a aprofundar a reduzir a possibilidade de danos para a lente subjacente.
   4. Remova o botão central da córnea delineado a partir do destinatário usando Vannas tesoura e descarte.
3. Suturar oenxerto
   1. Coloque a córnea do doador sobre o enxerto cama na córnea do destinatário. Certifique-se de que Healon adequado está sob a córnea do doador para proteger as células endoteliais do doador de dano pelo contato direto com a lente.
   2. Usando micropinças derrubadas super fino, coloque a primeira mordida de nylon 11-0 sutura no lado do doador, por meio do doador com 90% de profundidade de espessura total para o lado do destinatário, em seguida, amarrar.
   3. Uma vez que a córnea está ancorada no lugar, realizar suturas interrompidas midcardinal de tal forma que a córnea tem de 8 a 10 pontos totais e da córnea do doador está firmemente alinhados com e anexados ao leito do enxerto corneano destinatário.
4. O aprofundamento da câmara anterior
   1. Aprofundar a câmara anterior através da injecção de HBSS ou bolha de ar para dentro da câmara anterior e verificar cuidadosamente a integridade do enxerto da córnea para detecção de fugas com uma esponja de celulose.
      NOTA: Se a câmara anterior não pode ser reformado, então há uma alta probabilidade de cataract que fará com que as futuras avaliações da córnea transplantada muito difícil e também irá levar à disfunção endotélio corneano doador e falha assim enxerto.
5. Avaliação final
   1. Observar o olho para determinar que a pupila é redonda e a profundidade da câmara anterior é normal.
      NOTA: Se o aluno não é redondo, isso indica que, durante a sutura da íris foi danificado e, assim, o enxerto é considerada uma falha técnica.
   2. Aplicar pomada antibiótica ao olho. Opcional: Feche a tampa do olho com uma sutura de seda 7-0.
   3. Observe ratos até que estejam totalmente acordado e depois individualmente abrigá-los por um período mínimo de dois dias após a cirurgia.

Remoção 3. Sutura

1. Naqueles casos em que a tampa de sutura é usado, anestesiar os ratos, tal como descrito acima e remover o fio de sutura na tampa 48 h.
2. Anestesie camundongos no dia 7 pós-operatório. Remover o sutures fixar o enxerto da córnea. Uma vez que as suturas são removidas eo animal está totalmente desperto, coloque-o na gaiola.

4. Avaliação Clínica

1. Examinar o olho para indicações de complicações processuais que incluem, catarata (opacificação do cristalino), hifema (sangue na câmara anterior), uma câmara anterior, que não é da profundidade adequada, ou opacidade significativa da córnea. Considere aqueles que demonstram estas complicações como "comprometida" e sacrificá-los por inalação de _CO2.
   1. Realizar todos os exames em ratos não anestesiados. Segure o mouse com restringindo um lado, portanto, o mouse para que o outro lado pode proptose do olho para permitir uma melhor visão do olho. Uma vez que as observações são concluídas, devolver o animal para sua gaiola.
2. Já um observador familiarizado com os grupos de tratamento avaliam córneas transplantadas 2-3 vezes por semana para os sinais de transplante de córneaepisódios de rejeição ou falência do transplante. Use o microscópio cirúrgico ou um biomicroscópio de lâmpada de fenda horizontal para estas observações.
   1. Avaliar cada córnea para a opacidade utilizando uma escala de 0 a 5. A escala é definida como se segue:
      1. Atribuir uma pontuação de 0 a essas córneas que não têm sinais de opacidade.
      2. Atribuir uma pontuação de 1 a essas córneas que mostram opacidade superficial mínima.
      3. Atribuir uma pontuação de 2 a córneas que exibem opacidade leve e profundo, mas o aluno subjacente e íris são ainda perceptíveis.
      4. Atribuir uma pontuação de 3 a córnea que são apresentados opacidade do estroma da íris, em que não pode ser visto em pormenor, com a excepção de as margens da pupila.
      5. Atribuir uma pontuação de 4 a córnea que exibir densa opacidade estromal e se há estruturas subjacentes podem ser vistos.
      6. Atribuir uma pontuação de 5 a córnea que exibir completa opacidade e edema estromal intensivo, com a pupila e íris totalmente obscurecido.
   2. Também avaliar cada córnea para o grau de infiltração de vasos sanguíneos (neovascularização), utilizando uma escala de classificação de 1 a 8. Para realizar isto, ver a córnea como consistindo em quatro quadrantes iguais e determinar a quantidade de vasos sanguíneos em cada um destes quadrantes, com um marcar essa gama vontade de 0 (sem vasos) a 2 de extensa vascularização do que quadrante. Adicione as pontuações individuais de cada quadrante para calcular a pontuação final neovascularização.
   3. Classifique córneas como agudamente rejeitados se eles têm uma pontuação de 3 para duas observações consecutivas para o tempo aponta até 5 semanas.
   4. Classifique camundongos cuja córneas foram claros em 5 semanas, mas desenvolver opacificação às vezes> 45 dias após o enxerto, com uma pontuação de 3 para dois momentos consecutivos, como tendo sofrido rejeições de fim de prazo. Use curvas de sobrevida de Kaplan-Meier para analisar a sobrevida do enxerto.

5. A manipulação do Modelo

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Preparação das células individuais do baço.

1. Para preparar células individuais, primeira eutanásia do rato doador. Em seguida, remover o baço.
2. Inserir o baço em um filtro de células e rompê-la com um êmbolo da seringa a partir de uma seringa de 3 ml.
3. Lavar as células e ressuspender em 10 ml de Solução Salina Equilibrada de Hanks.
4. Retirar 10 jul de suspensão de células e adicionar 10 ul de 0,4% de azul tripano e misturar. Acrescentar que a hemocitômetro e contar as células na grade central. O número de células na câmara de ar é a contagem de células de 10 x ⁴ x 2 (factor de diluição em azul tripano) x 10 (volume no tubo).

Injecção para a câmara anterior.

1. Anestesiar ratos, tal como descrito anteriormente.
2. Realizar injecções usando um microscópio de dissecação. Para cada injecção intracameral, usar 10 ⁶ células do baço em um volume de 0.005 ml e uma seringa de microlitro 0,25 ml, equipado com uma agulha 33 G.
   NOTA: Outras manipulaçõesdo modelo pode ser realizada pelo tratamento dos animais com os reagentes que actuam como antagonistas ou agonistas para determinar o papel que um factor particular pode desempenhar após a cirurgia do enxerto corneano ortotópico.

Resultados

O modelo murino de transplante de córnea tem sido usado por mais de 20 anos com sucesso para caracterizar os mecanismos de rejeição do enxerto corneano tanto ^19-23 e aceitação da córnea do enxerto ^{13, 15,16,18, 24-27.} Este modelo foi utilizado para determinar a importância da expressão de FasL na aceitação do enxerto corneano, em que os animais que não possuem FasL não foram capazes de aceitar enxertos da córnea ^15. Também tem sido usado para demonstrar que factor de cresci...

Discussão

O modelo murino de transplante de córnea aqui descrito permite ao investigador para estudar rejeições humano em um modelo que é preditiva de quais fatores são mais associada tanto rejeição ^{15,17,18,20, 26-30} e ^21-25 aceitação de córnea aloenxertos. Ao contrário do transplante de córnea humana, no qual os pacientes recebem tratamento com esteróides ou tópica ou sistêmica, quer tratar ou prevenir a rejeição ^{de 31,} este modelo é normalmente usado para determinar os fatores...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Surgical Microscope	Zeiss	Rebuilt
1 ml Syringe	BD	305122
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309602
Vannus Scissors	Stortz	E-3387
11-0 Sutures	Alcon	717939M
Trephine 2.0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1.5 mm	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Forceps	FST	11251-20
7-0 Sutures	Alcon	8065
2.5% Phenylephrine HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% Tropicamide	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton Syringe	Hamilton	7654-01
33 gauge needle	Hamilton	90033
Cell Strainer (100 μm nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometer	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154