Murine Hornhauttransplantation: Ein Modell, das die häufigste Form der Organtransplantation Studieren

Zusammenfassung

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Zusammenfassung

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Einleitung

Hornhauttransplantation ist eine der erfolgreichsten und häufigsten Arten der Transplantation in Menschen durchgeführt. Die Gründe, warum diese Operation wird durchgeführt, sind das Ergebnis einer Verletzung, Infektionskrankheit, ^1, oder andere Formen von nicht-infektiösen Erkrankung der Hornhaut ^2. Zahlen aus dem Eye Bank Association of America zeigen, dass mehr als 46.000 wurden im Jahr 2011 durchgeführt (siehe Website unter: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Ein Hinweis auf seinen Erfolg ist, dass ein Jahr Ausfallraten für allogene Hornhauttransplantate reichen von 10 bis 15% und nach 5 Jahren ist der Erfolg von über 70% ^3-8. Wie viele Studien gezeigt haben, wird der Erfolg der Hornhauttransplantaten direkt auf der Tatsache, daß das Auge eine immunologisch privilegierte Stelle stehen. Faktoren für die Hornhäute Status als Immunprivileg Website verantwortlich sind das Fehlen beider Blut- und Lymphgefäße in der Hornhaut, eine relative Abwesenheit von Antigen-präsentierenden Zellen, Faktoren, die von der Hornhaut, die Entstörung produzierts Immuneffektorzelle funtions ^9-15, niedrige Expression von MHC-Antigenen ^16, und die Expression von FasL ^17-20.

Trotz dieser Faktoren prädisponierenden diese Transplantate für den Erfolg, sie durchlaufen die Ablehnung ^3-7. Folglich Verständnis dieser Mechanismen, die diese Ablehnung zu vermitteln sowie das Testen verschiedener Therapien, um eine Abstoßung zu verhindern, ist von entscheidender Bedeutung. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier ein murines Modell der Hornhauttransplantation, die seit mehr als 20 Jahren wurde die Hornhauttransplantation, in einer kontrollierten experimentellen Umgebung zu studieren. Da Transplantationsreaktionen beinhalten viele verschiedene Faktoren die im Konzert, die ultimative bestimmen, ob das transplantierte Gewebe ausfällt oder erfolgreich ist, ist es nicht möglich, die Wichtigkeit dieser Faktoren in jedem in vitro Modell zu verstehen. Infolgedessen werden Studien mit intakten Tieren erforderlich, um festzustellen, welche Faktoren wichtig, entweder Erfolg oder failu sindre des transplantierten Gewebes.

Während andere Tierarten wurden verwendet, um die Hornhauttransplantation zu untersuchen, wurde die Maus-Modell im Vergleich zu der Verwendung anderer Arten mehrere Vorteile. Die erste ist die Existenz vieler Stämme von Mäusen, die bestimmte Transgene exprimieren oder wurden Gen-Targeting, um die Expression von spezifischen immunologischen Faktoren, deren Funktion in der Transplantations besser untersucht werden fehlt. Darüber hinaus gibt es viele Reagenzien (sowohl rekombinante Faktoren und Antikörper, die Faktoren zu neutralisieren), die spezifisch für Mäuse sind, und die nicht für viele andere Arten von Tieren vorhanden sind. Aufgrund der Existenz dieser Faktoren ist dieses Modell wurde ausgiebig genutzt, um relevante Faktoren bei akuten Hornhauttransplantatreaktionen ^{15, 17,18,20 -29} beteiligt sind. Außerdem sind viele der Faktoren in die Hornhauttransplantation beteiligt sind auch bekannt Funktions in der Transplantation von anderen Geweben zu sein.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tiere in diesem Verfahren verwendet werden, in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Rechnung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research sowie den von der Tieraufsichtsgremium in Saint Louis University Leitlinien behandelt.
HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumenten und Lösungen werden vor der Operation sterilisiert, um mikrobielle Infektionen des Auges zu begrenzen. Es sei darauf hingewiesen, dass, während die Tiere tun erleben einige Schmerzen von diesem Verfahren, wissen wir nicht Analgetika beschäftigen werden. Der Grund dafür ist, dass alle Analgetika sind entzündungshemmende und da die Hornhauttransplantation Reaktionen beinhalten Entzündung, wäre die Verwendung von entzündungshemmenden Medikamenten unsere Fähigkeit zu bestimmen, welche Faktoren in Hornhauttransplantatversagen beteiligt beeinträchtigen.

1. Anästhesie

1. Zeigen Spender und Empfänger-Mäuse unter Vollnarkose durch IP-Injektionen von Ketamin (86.98 mg / kg) und Xylazin (13,04 mg / kg).
2. Halten Sie die Empfängermaus unter Narkose während des gesamten Verfahrens die in der Regel dauert 30 min zu einer Stunde. Folglich ständig die Maus auf Anzeichen von Bewusstsein wiedererlangt zu überwachen.
3. Bewerben Puralube Salbe für die Augen, die nicht operiert werden, nachdem das Tier narkotisiert, um Trockenheit zu verhindern.

2. Hornhauttransplantation

1. Erhalt der Spenderhornhaut-Taste.
   1. Sobald das Tier vollständig betäubt wird, erreichen eine ausreichende Mydriasis durch Verabreichung von einem Paar von Augentropfen, von 1% und 2,5% Tropicamid Phenylephrin-Hydrochlorid.
   2. Positionieren Sie den Kopf des Spendertieres horizontal auf einem Brett auf einem stabilen beweglichen Gestell montiert. Fixieren den Kopf mit einem Streifen Klebeband über den Hals, um sicherzustellen, dass das Auge in einer horizontalen Position während des gesamten Betriebs.
   3. Mit einem Durchmesser von 2 mm Trepan, dessen Spitze wurde mit Methylenblau gefärbt, aussäumen den zentralen Hornhaut Transplantatstelle.
   4. Mit einer scharfen Klinge, die Hornhaut zu durchdringen und zu injizieren Healon in die vordere Kammer zu vertiefen, um die Wahrscheinlichkeit einer Beschädigung des Spenders Endothels und des darunterliegenden Linsen reduzieren.
   5. Verbrauchsteuern Das Spendertransplantat mit Vannas Schere aufnehmen und in eine Schale mit Hanks 'ausgewogener Salzlösung bis zur Verwendung.
   6. Nachdem das Spendertransplantat hat die entfernt worden, einschläfern die Spendermaus über CO ₂ Einatmen.
2. Vorbereiten des Transplantatbett.
   1. Wiederholen Sie die gleichen Schritte wie in 2.1.1 bis 2.1.2 für den Empfänger beschrieben.
   2. Mit einem Durchmesser von 1,5 mm Trepan, skizzieren den Empfänger Transplantatstelle.
   3. Mit einer scharfen Klinge, die Hornhaut zu durchdringen und zu injizieren Healon in die vordere Kammer zu vertiefen, um die Möglichkeit einer Beschädigung der darunter liegenden Linse zu verringern.
   4. Entfernen Sie die skizzierten zentralen Hornhaut Taste vom Empfänger mit Vannas Schere und entsorgen.
3. Naht derTransplantat
   1. Legen Sie die Spenderhornhaut über das Transplantat in der Hornhaut des Empfängers Bett. Seien Sie sicher, dass eine angemessene Healon ist unter der Spenderhornhaut, um die Spender endothelialen Zellen vor Schäden durch direkten Kontakt mit Objektiv zu schützen.
   2. Bei Verwendung von feiner Spitze microforceps, platzieren Sie den ersten Bissen von 11-0 Nylonnaht in die Geberseite, durch den Spender mit 90% Tiefe der gesamten Dicke der Seiten Empfängers, dann binden Sie.
   3. Sobald die Hornhaut an Stelle verankert, führen midcardinal Nähten, so dass die Hornhaut hat 8 bis 10 insgesamt Nähte und die Spenderhornhaut fest mit gefüttert und an den Empfänger Hornhauttransplantatbett befestigt.
4. Vertiefung der Vorderkammer
   1. Vertiefung der Vorderkammer durch Einspritzen von HBSS oder Luftblase in die Vorderkammer und sanft überprüfen die Integrität der Hornhaut-Transplantat zur Leckage mit einem Celluloseschwamm.
      HINWEIS: Wenn die Vorderkammer nicht reformiert werden kann, dann gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit von cataract die machen künftige Bewertungen der transplantierten Hornhaut sehr schwierig und wird möglicherweise auch auf Spender Hornhautendothels Dysfunktion und damit Transplantatversagen führen.
5. Abschließende Bewertung
   1. Beobachten des Auges zu bestimmen, dass die Pupille ist rund und die Tiefe der vorderen Augenkammer ist normal.
      HINWEIS: Wenn die Schüler nicht rund bedeutet dies, dass während der Naht die Iris beschädigt wurde und damit das Transplantat wird als technisches Versagen.
   2. Gelten antibiotische Salbe ins Auge. Optional: Schließen Sie das Augenlid mit einem 7-0 Seidennaht.
   3. Mäusen zu beobachten, bis sie vollständig wach und dann einzeln beherbergen sie für mindestens zwei Tage nach der Operation.

3. Nahtentfernung

1. In jenen Fällen, in denen Deckel Naht verwendet wird, betäuben Mäusen, wie oben beschrieben, und entfernen Sie den Deckel Naht bei 48 h.
2. Anesthetize Mäusen an Tag 7 nach der Operation. Entfernen Sie die SuturES Sicherung der Hornhauttransplantat. Sobald die Nähte entfernt und das Tier voll erwacht ist, bringen Sie es in seinen Käfig.

4. Klinische Bewertung

1. Untersuchen Sie das Auge für Hinweise auf Verfahrens Komplikationen, die zählen, Katarakt (Trübung der Linse), hyphema (Blut in der vorderen Augenkammer), eine vordere Kammer, die nicht der richtige Tiefe, oder erhebliche Trübung der Hornhaut. Betrachten Sie jene, die diese Komplikationen als "gefährdet" zu demonstrieren und einschläfern ihnen von CO ₂ Einatmen.
   1. Führen Sie alle Untersuchungen an narkotisierten Mäusen. Halten Sie die Maus mit einer Hand so Zurückhalten der Maus, so dass die andere Hand das Auge proptose um eine bessere Sicht des Auges zu ermöglichen. Sobald Beobachtungen abgeschlossen sind, senden Sie das Tier in seinen Käfig.
2. Haben ein Beobachter nicht mit den Behandlungsgruppen bewerten 2 bis 3 mal pro Woche transplantierten Hornhäute auf Anzeichen von HornhauttransplantatAbstoßungsreaktionen oder Hornhauttransplantatversagen. Verwenden Sie entweder das Operationsmikroskop oder eine horizontale Spaltlampen Biomikroskop für diese Beobachtungen.
   1. Evaluierung jedes Horn Opazität unter Verwendung einer Skala von 0 bis 5. Die Skala ist wie folgt definiert:
      1. Weisen Sie eine Punktzahl von 0 bis diesen Hornhäuten, die keine Anzeichen von Trübung haben.
      2. Weisen Sie eine Punktzahl von 1 bis diesen Hornhäuten, die minimale oberflächliche Trübung zeigen.
      3. Vergeben Sie einen Score von 2 bis Hornhäute, die mild und tiefer Opazität anzeigen, sondern die zugrunde liegende Pupille und Iris sind noch erkennbar.
      4. Vergeben Sie einen Score von 3 bis Hornhaut, die Stromazellen Opazität anzuzeigen, wobei die Iris kann nicht im Detail mit Ausnahme der Pupillenränder zu sehen.
      5. Weisen Sie eine Punktzahl von 4 bis Hornhaut, die dichten Stroma Opazität anzuzeigen und wenn keine zugrunde liegenden Strukturen können eingesehen werden.
      6. Weisen Sie eine Punktzahl von 5 bis Hornhaut, die vollständige Opazität und intensive Stromaödems mit Pupille und Iris anzuzeigen völlig verdunkelt.
   2. Auch bewerten jede Hornhaut für den Grad der Blutgefäßinfiltration (Neovaskularisation) unter Verwendung einer Bewertungsskala von 1 bis 8. Um dies zu erreichen, sehen die Hornhaut als bestehend aus 4 gleiche Quadranten und legt die Höhe der Blutgefäße in jedem dieser Quadranten mit einem Partitur, die die Reichweite von 0 (keine Schiffe) bis 2 für umfangreiche Vaskularisierung diesem Quadranten. Fügen Sie die einzelnen Punkte jedem Quadranten, um die endgültige Neovaskularisation Score berechnen.
   3. Bewerte Hornhäute als akut abgelehnt, wenn sie einen Wert von 3 für zwei aufeinander folgende Beobachtungen für Zeitpunkten bis zu 5 Wochen.
   4. Bewerte Mäusen, deren Hornhäute waren klar in 5 Wochen, aber entwickeln Trübung zu Zeiten> 45 Tage nach der Transplantation, mit einem Score von 3 für zwei aufeinander folgende Zeitpunkte, als unterzogen wurden spät-Begriff Hornhauttransplantatabstoßung. Verwenden Kaplan-Meier-Überlebenskurven zu Transplantatüberleben zu analysieren.

5. Manipulation des Modells

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Herstellung einzelner Zellen aus der Milz.

1. Um einzelne Zellen herzustellen, zunächst einschläfern die Spendermaus. Dann entfernen Sie die Milz.
2. Legen Sie die Milz in einer Zelle Sieb und stören sie mit einem Spritzenkolben aus einem 3-ml-Spritze.
3. Waschen Zellen und Resuspendieren in 10 ml Hanks Balanced Salt Solution.
4. Entfernen Sie 10 ul Zellsuspension und fügen 10 ul 0,4% Trypanblau und mischen. Hinzufügen, dass Hämozytometers und zählen Sie die Zellen in das zentrale Netz. Die Anzahl der Zellen in Rohr ist die Zellzahl x 10 ⁴ x 2 (Verdünnungsfaktor in Trypanblau) x 10 (Volumen im Röhrchen).

Injektion in die vordere Kammer.

1. Betäuben Mäusen, wie zuvor beschrieben.
2. Führen Injektionen mit einem Binokular. Für jede intrakamerale Injektion, verwenden 10 ⁶ Milzzellen in einem 0.005 ml Volumen und eine 0,25 ml Mikroliterspritze mit einer 33 G-Nadel ausgestattet.
   HINWEIS: Andere Manipulationendes Modells kann durch die Behandlung von Tieren mit Reagenzien, die entweder als Antagonisten oder Agonisten, die Rolle, die einen bestimmten Faktor kann folgende orthotope Hornhauttransplantatchirurgie spielen Bestimmung handeln geführt werden.

Ergebnisse

Das Mausmodell der Hornhauttransplantation ist seit über 20 Jahren verwendet worden, um erfolgreich zu charakterisieren Mechanismen sowohl Hornhauttransplantatabstoßung, ^19-23 und Hornhauttransplantatannahme ^{13, 15,16,18, 24-27.} Dieses Modell wurde verwendet, um die Bedeutung des FasL-Expression in Hornhauttransplantatakzeptanz zu schaffen, dass Tiere, die FasL fehlen nicht in der Lage, Hornhauttransplantate ¹⁵ zu akzeptieren. Es wurde auch verwendet, um zu zeigen, dass vaskuläre endo...

Diskussion

Das Mausmodell der hier beschriebenen Hornhauttransplantation ermöglicht die Ermittler für die menschliche Hornhauttransplantatabstoßung in einem Modell, das Vorhersage, welche Faktoren am besten mit beiden Ablehnung ^{15,17,18,20, 26-30} und Akzeptanz ^21-25 von Hornhaut assoziiert ist studieren Allografts. Im Gegensatz zu menschlichen Hornhauttransplantation, in denen die Patienten entweder topische oder systemische Behandlung mit Steroiden, entweder zu behandeln oder zu verhindern Ablehnung ^...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Surgical Microscope	Zeiss	Rebuilt
1 ml Syringe	BD	305122
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309602
Vannus Scissors	Stortz	E-3387
11-0 Sutures	Alcon	717939M
Trephine 2.0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1.5 mm	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Forceps	FST	11251-20
7-0 Sutures	Alcon	8065
2.5% Phenylephrine HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% Tropicamide	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton Syringe	Hamilton	7654-01
33 gauge needle	Hamilton	90033
Cell Strainer (100 μm nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometer	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154