Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Özet

Burada bir prosedür, Escherichia coli K1 kültürleri ile neonatal sıçanda sistemik enfeksiyon kurulması için tarif edilmiştir. Bu non-invazif prosedür da koroid pleksusa de mide-bağırsak yolunun kolonizasyonu, sistemik dolaşıma patojenin translokasyonu ve merkezi sinir sisteminin istilası izin verir.

Özet

Istihdam enfeksiyon modeli doğal enfeksiyon temel özelliklerini çoğaltır eğer hayvan sahibi ve bakteriyel patojen arasındaki etkileşimlerin incelenmesi anlamlıdır. Bu protokolünün neonatal sıçanda neuropathogenic Escherichia coli K1 sistemik enfeksiyon oluşturulması ve değerlendirme usulleri tarif etmektedir. Mide-bağırsak yolunun kolonizasyonu enfeksiyonun bağırsak lenf kan-beyin istikameti boyunca patojenin yayılmasına yol açar ve model güçlü bir yaş bağımlılığını gösterir. E. A suşu coli Ø18: yenidoğan sıçan için geliştirilmiş virülansa K1 kolonizasyon derece yüksek oranları, kan bölmesi ve koroid pleksus üzerinden transit aşağıdaki menenjlerin işgaline translokasyonu üretir. Insan vücudunda gibi, merkezi sinir sistemi penetrasyon iltihaptan ve değişmez ölümcül sonucu ile eşlik eder. Model mekanizmasının çalışmalar için kanıtlanmış bir tedavi yaklaşımıdırpatogenezi, terapötik müdahalelerin değerlendirilmesi ve bakteriyel virulans değerlendirilmesi için.

Giriş

Sistemik bakteriyel enfeksiyonlar refahı ve yenidoğanın hayatta kalması için büyük bir tehdittir; Erken bebekler özellikle hassastır. Sık sık bakteriyel sepsis ile ilişkili neonatal bakteriyel menenjit (NBM), yaşamın ilk birkaç haftasında mortalite ve morbidite önemli bir kaynak olmaya devam ediyor ve sorun cephe antibakteriyel ilaçlara ^1,2 direnç sürekli evrim ile şiddetlenir. NBM olgusu yüksek, tıbbi, sosyal ve ekonomik yükü ³ taşıyan acil bir tıbbi durumdur; Sonuç olarak, enfeksiyonun yükünü azaltmak için, yeni tedavi ve, özellikle de, bu yeni profilaktik stratejileri için acil bir ihtiyaç vardır. NBM bazı özellikleri sıradışı: gelişmiş ülkelerde, Escherichia coli ve B grubu streptokok hemen hemen her zaman koruyucu bir polisakarit ca varlığı ile ilişkili vakaların büyük çoğunluğunda ve NBM ortaya çıkarmak için bu soyların kapasitesinden sorumlubağışıklık tanıma kaçmasına patojeni sağlayan psule ⁴ işler. Neuroinvasive E. - (85% 80) çok yüksek bir oranı coli K1 kapsülü ^5,6, nöronal plastisite ⁷ modülatörlerini ev sahipliği yapısal özdeş olan bir α-2,8-bağlı polysialic asit polimeri ifade eder.

Yeni tedavi ve NBM yönelik profilaktiklerde ve ilgili bakteriyemi ve sepsis değerlendirilmesi açık bir şekilde, özellikle güçlü bir yaş-bağımlılık ve enfeksiyonunun doğal yolu, insan yenidoğanlarda hastalığın başlıca özelliklerini taklit eden enfeksiyonun sağlam bir hayvan modelinde yararlanacak . Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriyel menenjit modelleri geniş bir yelpazede ^8,9 mevcuttur ve bu ölçüde, bu enfeksiyonların patogenezi, patofizyolojisi ve tedavi seçenekleri hakkındaki bilgimizi genişletilmiş var. Bu durumda, fare, sıçan, tavşan ve maymun deneysel enfeksiyonları n menenjit incelemek için kullanılmıştıreonate ve yetişkin. Ancak, bu modellerin birçoğu kolonizasyon sitesinden yayılması doğal süreçlerini atlayarak bir yapay patogenezi yaratarak, enfeksiyon başlaması için bakterilerin direkt intrasisteraal veya deri altı enjeksiyon kullanır. Bazı durumlarda inokülasyon Bu yöntemler patolojisinde önemli değişikliklere yol açtı; Örneğin, E. deri altına coli K1 suşları yenidoğan ve yetişkinlerde ¹⁰ hem de bakteriyemi ve merkezi sinir sistemi (MSS) işgali üreten, doğal enfeksiyon ile ilişkili yaş bağımlılık ortadan kaldırmıştır. E. yatkınlık coli NBM de bebeğin anneden etkenin dikey geçiş kritik bağımlı veya doğumdan hemen ¹¹ sonradır. E. maternal türetilmiş coli K1 bakteriler doğumda steril ama hızla karmaşık bir mikrobiyotasını ¹⁴ kazanır Yenidoğan gastrointestinal (GI) yolu ^11-13, kolonize. Kolonize yenidoğanlarda, E. coliK1 bakterilerin kan-beyin ya da kan-beyin-omurilik sıvısı engellerin ^9,15 arasında merkezi sinir sistemini girmeden önce sistemik dolaşıma bağırsak lümeninden translokasyonunda kapasitesine sahiptir. Deneysel enfeksiyon sağlam modellerinin tasarımı dikkate bu ayrıntıları almalıdır.

Farenin yaygın bakteriyel menenjit ⁸ bazı şekillerinin çalışma için kullanılmış olmasına rağmen, bunlar, neonatal enfeksiyon çalışmalar için uygun değildir: bunlar, sistemik enfeksiyon ile aşırı insan bebeklerin ¹⁶ güçlü bir yaş bağımlılık özelliği göstermezler. Bundan başka, α-defensinler, E. tarafından sistemik işgaline karşı koruma sağlayan GI bölgesinin önemli peptidler E. coli K1 ^17, yüksek insanlarda ve farelerde, Paneth hücreleri ve nötrofillerde ama farelerde ¹⁸ olarak ifade edilmiştir. Bir diğer bulunmayan çoğaltma, yedekleme ve fare defensin heterojenlikten ve ilgili cryptidin genlerin dikkate değer bir derecede olduğunu¹⁹ imals. Yenidoğan sıçan başlangıçta Moxon tarafından kullanılan ve coworkers ²⁰ intranazal inokülasyon aşağıdaki Hemofilus influenza menenjiti patogenezi araştırmak için, insanda bu yenidoğan patojenin kolonizasyonu doğal siteyi kopyalayan ve sonra yaşa bağlı E. için uyarlandı coli K1 bakteriyemi ve menenjit. BORTOLUSSI ve diğ., Bakteriyel inokulum ²¹ çalışan intraperitoneal enjeksiyon enfeksiyon başlatmak için, ancak önemli Glöde çalışma ve Gl kolonizasyonundan sonra enfeksiyonunun doğal yolu ile paralel ²² kullanılan oral gastrik besleme coworkers. Gastrik tüp mukozal yüzeylere zarar verebilir gibi, prosedür yenidoğanlarda ²³ inokulum beslenmedir için rafine oldu. Burada, gastrointestinal sistem kolonizasyonu ve açıklanan duyarlı sıçan yavrularında enfeksiyonu izleme prosedürleri için yöntem; ayrıca, modelin terapötik ve önleyici uygulamalar tartışılmaktadır.

Protokol

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan deneyleri, ulusal ve Avrupa mevzuatına uyduğu ve Eczacılık UCL Okulu Etik Komitesi ve İngiltere Home Office (HO) tarafından onaylanmıştır. HO projesi kapsamında yürütüldüğü bütün hayvan çalışmaları PPL 80/2243 ve PPL 70/7773 lisanslar.

1. Fare Hazırlama

1. Patojen-free Wistar neonatal sıçan kullanarak tüm in vivo deneyler yürütmek.
2. 21 ° C, 45 - -% 55 nem, 15-20 hava değişikliği / saat ve optimum koşullarda (19 altında, - (11 haftalık kadın 9) kendi emzikli anneler ile bireysel kafeslere tüm sıçan ibrelerin (koloni başına 12 yenidoğan) saklayın 12 st ışık / karanlık döngüsü).

2. Bakteriyel hücrelerin hazırlanması

1. Mağaza E. -80 ° C'de% 20 (h / h) gliserol, E. coli K 1 stokları. Her deney için, agar plakaları Mueller-Hinton (MH) üzerine stok bakterileri plaka ve 37 ° CO / N inkübe.
2. Beslenme, inocu gün önceBir tek E ile MH suyu geç 10 mi E. coli K1 koloni ve kültür O / 37 ° C, 200 rpm'de K. Orta kontaminasyonu için bir kontrol olarak, aşılanmamış MH suyu 10 ml hazırlamak ve 200 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin.
3. Aktarım MH suyu 9,9 ml 'si içerisine göre O / N bakteri süspansiyonu, 100 ul (1: 100 hacim / hacim), ve orta üslü faz 0.6' lik bir optik yoğunluğa karşı gelen, ulaşana kadar, 37 ° C, 200 rpm'de inkübe 600 nm (OD _600), bir dalga boyunda ölçülmüştür.

E. ile Yenidoğan Sıçan 3. Besleme coli K1

1. Yavaşça ağız açmak için izin, ensesinden tek elle dikey hayvan tutun. Yavaşça hayvanın ağzına Steril bir pipet ucu yerleştirin ve 30 saniyelik bir süre boyunca hayvanın ağzına aşı (~ 37 ° C) pipet 20 ul. Hemen beslendikten sonra annesine hayvan dönün.
2. 8 x 10 ⁶ bakteri t beslenmiş - 4 doğrulayıno seri PBS inokulum seyreltme ve MH agar plakaları üzerine tespit ederek, her yavru.

E. tarafından Kolonizasyon 4. Değerlendirme coli K1

1. Yavaşça ensesinden itibaren bir yandan hayvan tutun. Steril PBS içinde steril pamuk uçlu çubukla ıslatın ve sonra yavaşça perianal bölgeyi çubukla. Hemen swabbing sonra anne hayvan dönün.
2. Steril PBS içinde 300 ul ihtiva eden bir tüp içine pamuklu çubuk ucu ile ve buz üzerinde muhafaza edin.
3. PBS içinde seri seyreltme ile canlı bakteri sayısını belirlemek MacConkey agar plakaları üzerine kaplama.
4. Canlı E. belirleyin bakteriyofaj duyarlılık testleri ile coli K1. Steril bir mikrobiyolojik döngü kullanarak bireysel bir koloni almak, girdap karıştırma sonra tabi steril PBS, 200 ul içine batırılmış.
5. Düz bir çizgi MH agar üzerine steril bir mikrobiyolojik döngü, alt-kültür kullanarak. Plaka 30 saniye süreyle kurumaya, ve sonra bac 10 ul pipet izin verteriophage K1E çizgisinin merkezi üzerine (10 ⁹ plak birim / ml (pfu / mL) oluşturulması). 37 ° C'de plaka O / N inkübe edin.
6. Bir sonraki gün, bakteriyofaj aracılı liziz için plaka inceleyin.

Hastalık Şiddeti 5. Değerlendirme

1. Tablo 1'de özetlenen yedi nokta skorlama sistemi kullanılarak 5 kez günlük - 4 her bir hayvanın hastalık şiddetini değerlendirmek.
2. Bir hayvan puanları 7 takım ≥3, hemen acıyı en aza indirmek için hayvan itlaf. Ölü hayvan kaydedin.

Yenidoğan Sıçanlar ve Kan Toplama 6. Euthanization

1. Yavaşça başını ve boynunu açığa bir yandan hayvan tutun. Alkollü bir bezle silerek hayvanın boynunu dezenfekte edin. Iz etanolü çıkarmak için steril PBS içinde yıkamadan önce,% 70 etanol kullanılarak makas büyük bir çift dezenfekte.
2. Yavaşça bir Petri kabı üzerinde doğrudan hayvan tutun. Keskin Surgi kullanarak yenidoğan işten çıkarmakKan Petri kabı içine damlalar sağlamak cal makas. Cilt florası ile kan bulaşmasını önlemek için kafa temastan kaçının.
3. Hemen bir steril pipet kullanılarak, kan toplamak ve 20 arasında bir konsantrasyonda, heparin, sodyum tuzu ile karıştırmak - 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 50 birim / ml.
4. PBS içinde seri seyreltme ile canlı bakteri sayısını belirlemek MacConkey agar plakaları üzerine kaplama. Canlı E. numaraların belirlenmesidir bakteriyofaj K1E için canlı bakteri duyarlılığını test ederek coli K1.

7. Diseksiyon

1. Neonatal sıçan Dekapitasyon takiben, tüketim ve ilgi dokuları toplamak için aseptik koşullarda kullanın. % 70 etanol ve steril PBS içinde (Şekil 1 'de gösterildiği gibi) tüm araçları yıkayın.
2. Diseksiyon kurulu temizleyin ve% 70 etanol ile tamamen karın ıslak. Sol arka bacak çivileme sırtında cesedi yerleştirin ve (i) diseksiyon kurulu düzeltmeksteril bir iğne ile operasyon masası, (ii) cesedi germe ve işlem tablosuna doğru ön bacağını bağlantılarını, (iii) işlem tablosuna, sağ arka bacak, sol ön bacağını çivileme.
3. Forseps kullanarak alt karın sol tarafında deri çekin, sonra küçük diseksiyon makas kullanılarak sternum alt karın cesedin sol tarafında kesti.
4. Sternum eksizyonu uzatın ve ardından altta yatan yapıların hiçbirinin hasar sağlanması forseps ve küçük diseksiyon makas kullanarak alt karın sternum cesedin sağ tarafında, aşağı.
5. Son olarak, yavaşça periton maruz İris kavisli diseksiyon forseps kullanarak alt karın sternum flep aşağı çekin.
6. Temel organlarının hiçbirinin hasar sağlanması, forseps ile yavaşça periton yükseltmek ve iç organları açığa dikey kesilmiş.

8. ToplamaGI Yolu

1. Mide, ince bağırsak, çekum, kolon ve mezenterik lenf sistemi tanımlamak.
2. Yavaşça iki tarafında transecting tarafından mide kaldırmak, daha sonra steril forseps kullanarak steril PBS 1.6 ml içeren bir bijou içine koyun.
3. Rektum kolon transect. Dikkatlice steril Petri kabındaki diseksiyon forseps ve yer kullanarak cesedinden tüm bağırsak kitle çekin. Bağırsak yapısı ve mezenterik lenf yapıları ayrı kalmamanız bu nazikçe yapılır emin olun.

GI sistemi ve mezenterik lenf Sistemin 9. Ayırma (Şekil 2)

1. Gastrointestinal sistem tamamen daldırılır sağlanması, bir Petri kabı içine steril PBS, 30 ml dökün.
2. Mezenterik lenf sisteminin merkezi kitle tespit ve ince diseksiyon forseps kullanarak çimdik. Ince bağırsağın proksimal kısmına tespit ve ince diseksiyon forseps kullanarak çimdik.
3. Yavaşça Centra çekinmezenterik lenf sistemi ve iki doku kadar bunları karşıt istikametlerde distal ince bağırsağın L kütle bütünüyle birbirinden ayrılır. Bu proksimal, orta ve distal bölgelerde tekrarlanabilir toplanmasını engeller olarak, ince bağırsak gergin değil emin olmak için dikkatle bu işlemi gerçekleştirmek. 300 mezenterik lenf sistemi yerleştirin - steril PBS içinde 500 ul ve buz üzerine yerleştirin.

GI Yolu 10. Kesit

1. Kolondan gelen ince bağırsağa ayırmak için çekum de gastrointestinal sistem transeksiyonu.
2. 300 kolon yerleştirin - 500 ul steril PBS ve buz üzerine yerleştirin.
3. İnce bağırsak, yakın orta ve uzak bölgelerden gelen temsilcisi dokuları toplayın. Orta noktasından ince bağırsak hizalayın.
4. Daha sonra, (i) distal ince bağırsak gibi çekuma önce doku son 2 cm toplanması, (ii) 5 den doku toplamak - yakınsal ince bağırsak gibi orta noktasının üzerinde 7 cm, veOrta ince bağırsak gibi orta noktasının altında 5 cm -, (iii) 3 'den gelen doku toplanır.

11. Karaciğer Toplama

1. Mide çıkarılmasından sonra sıçan karaciğer üç lobu belirlenmesi.
2. Uzakta ince diseksiyon forseps kullanılarak karın boşluğundan lobları çekin.
3. Ince makas kullanarak herhangi takılarak ligament kesilerek karaciğer çıkarın. Buz üzerinde 500 ul steril PBS ve yer - 300 karaciğer yerleştirin.

12. Dalak Toplama

1. Dalak tanımlayın.
2. Uzakta mide dalak çekin ve gastrosplenic ligament kesmek için ince makas kullanın.
3. Buz üzerinde 500 ul steril PBS ve yer - 300 dalak yerleştirin.

13. Böbrekler Toplama

1. Gastrointestinal sistem ve diğer organ çıkarılmasından sonra karın boşluğunun arka görülebilir hale gelecektir böbrekleri belirlenmesi.
2. Kesim üreter ve herhangi takılarak ligament uince diseksiyon makas şarkı ve ince forseps kullanılarak böbrekleri kaldırın. Adrenal bezleri ve ince forseps ve diseksiyon makas kullanılarak (hala bağlıysa) herhangi bir yağ malzemelerini çıkarın.
3. 300-500 ul steril PBS içinde her iki böbreği koyun ve buz üzerine yerleştirin.

14. Beyin Toplama

1. Başlarının kesilmesi işleminden sonra, kıvrık forsepsler kullanılarak dik bir konumda kafa tutun. Uzunlamasına kavisli bir forseps başka bir dizi kullanarak başınızın üstüne cilt Pinch, ve ince diseksiyon makas kullanarak bir kesi yapmak. Boyun yakın kalan cilt, yine uzunlamasına ince diseksiyon makas kesti.
2. Ince diseksiyon makas kullanılarak deri kanatlar kafatası ortaya ve ortadan kaldırmak her iki tarafta ince forseps kullanarak dışa doğru cilt çekin. Spinal açılış ince diseksiyon makas yerleştirin ve kürsüden doğru kafatası boyunca bir kesi yapmak.
3. Ince forseps kullanarak dışarıya doğru bir yönde kafatası iki bölümünü de çekin. Kafatası parçalarını kaldırmak için kesti.
4. kürsüsünden doğru spinal açıklıktan yukarı doğru bir scooping hareket kullanan, geniş forseps kullanarak beyin çıkarın. Decapitation prosedürden herhangi bir kan çıkarmak için iki kez PBS içinde beyin yıkayın.

15. Doku İşleme ve Homojenizasyon

1. Steril PBS içeren tüpler içine canlılığı sayım veya DNA çıkarma, yer dokuları gerektiren deneyler için. Hemen kısa dönem için% 20 gliserol ile, -20 ° C'de PBS içinde seri seyreltme ve MacConkey agar plakaları üzerine kaplama veya deposu tarafından canlı bakteri sayısını belirler. DNA ekstraksiyonu, -20 ° C'de mağaza dokular için.
2. RNA ekstraksiyonu, RNAlater çözeltisinin uygun hacim içine bir yer dokular (1 mg doku başına 10 ul) gerektiren deneyleri için, daha sonra, kısa süreli ya da -80 ° C'de uzun süreli depolama -20 ° C 'de hemen saklayın.
3. 10 mi metakarn çözeltisi içinde görüntüleme gerektiren deneyler, bir yer dokularda (% 60 metanol,% 30 kloroform ve% 10 asetik asit), daha sonra da bir mağazat RT - 3 haftaya kadar (20 25 ° C).
4. Önce ve dokulara ilave edildikten sonra tüpler ağırlıkça karşılaştırılmasıyla doku ağırlığı hesaplayın. Bir homojenleştirici kullanılarak dokular homojenize edilir. Her numunenin homojenleştirilmesi arasında, steril PBS içinde bir kez% 70 etanol ile iki kez homojenize edici yıkayın.
   NOT: metakarn sabitleme müsin ilgili mukozal savunma yapılarını korumak amacıyla bağırsak örneklerinin tespiti için arzu edilir; Formalin sabitleme sistemik dokular için kullanılabilir.

Sonuçlar

E. Burada anlatılan coli K1 sistemik enfeksiyon modeli insanlarda doğal enfeksiyon özellikleri birçok çoğaltır. Bakterileri, gastrointestinal sistem kolonize beynin ²⁴ bağlantılı iltihap ile organa özgü hastalığı sağlamadan önce mezenterik lenf düğümleri üzerinden kan bölmesine transloke, sindirilen. Önemlisi, model, güçlü bir yaş bağımlılık görüntüler; Şekil 3'te görüldüğü gibi, iki gün yaşlı (P2) sıçan yavruları invaziv hastalığa son derece duyarlı olan, ancak yedi günlük bir süre içinde hayvanlar enfeksiyon giderek daha dirençli olur, ama sistem kolonizasyonu ¹⁷ GI değil. Kan bölmesine GI kolonizasyon sitesinden geçiş sonra, bakteriler koroid pleksus ²⁵ ağırlıklı olarak merkezi sinir sistemini girmeden önce floresan mikroskobu (Şekil 4) tarafından alınan kan örneklerinde görülebilir. Bazı hayvanlarda, bu gibi diğer ana organların yaygın invazyonakciğer, dalak ve böbrek ^25.

Dokulardaki bakteri sayısı tek yavruların ²⁵ arasında ama esas olarak değişebilir biyolojik yük mevcut olan ya da organ tutulumuna konusunda tekrarlanabilirliği yüksek olduğu için mevcut olarak skorlanmıştır zaman. Tek bir test kohort olarak 12 yavrular bir çöp ile, G * Güç Yazılımı kullanarak güç hesapları bu örneklem büyüklüğü altı kohortundan hayvanları ve eğer tüm>% 99 olasılık kullanarak hayatta dayalı bir etkisi bulma% 98.6 olasılık eşittir tespit oniki dikkate alınır. Bu model, özellikle yeni doğan bakteriyel enfeksiyonların tedavisi için uygun yeni maddelerin değerlendirilmesi için elverişlidir ve selektif bir şekilde bakteriyel yüzey ^24-26 den K1 kapsül kaldırır EndoE depolimeraz kapsülün terapotik potansiyelini değerlendirmek üzere prosedüründe kullanılmıştır. Ayrıca konak-bakteri etkileşimlerini pat üzerinde etkisi araştırmak için kullanılan olabilirE. patogenezinde immün sisteme E. coli neuropathogens; Bu bağlamda o, E. çalışmalar için istihdam edilmiştir coli A192PP kolonizasyon ve yaygınlaştırma. Bu ispat edilmiştir, E. E. coli A192PP hücreleri, çok sayıda P2, P5 ve P9 yavruların GI bölgesinde devam; Bu üç grupta kolonizasyon zamansal yönleri (Şekil 5) çok benzer ve çoğaltmak ve bağırsak içinde nüfus yoğunluğunu korumak için bakterilerin kapasitesini yansıtır.

Klinik izolat A192 ve hastalık oluşturma hayvan kullanımı için çok küçük bir fazlalık sağlamak amacıyla, yeni doğmuş sıçanlarda bir seri pasaj olarak geliştirilmiştir. E. coli A192,% 100 verimle P2 yenidoğan sıçanlar hayvanların kolonize% 35 bakteriyemi ortaya çıkardı ve% 25 ²⁷ öldürücü etkisi yarattı. Pasajlamaya türevi A192PP, gastrointestinal sistem kolonize bakteriyemi üretir ve tüm P2 yavrular ölüme neden olmaktadır. Bu sistem, di ölümcüllüğünü araştırmak için kullanılabilecektirfferent K1 kolonizasyon sitesinden CNS ve diğer organ sistemlerini işgal etme kapasitesine göre suşları. Bu bağlamda, Plüschke ve arkadaşları ²³ 95 E. kapasitesini belirlemek için bir yenidoğan sıçan enfeksiyon modeli kullanılır coli K1 gut kolonizasyon sonrası bakteriyemi neden insan kaynaklı suşları; ve E. klonal doğasını destekleyen, kolonizasyon ve invazif yeteneği hem de etkinliği geniş varyasyonlar gözlemlenmiştir coli K1 neuropathogens.

Şekil doku toplama 1. Malzemeler: (A) terazi, (B) gerekli ortamı içeren önceden tartılmış tüpler, (C) operasyon masası, cetvel ve hayvan aşağı pin iğneler, (D)% 70 (v / v) etanol ve PBS, doku toplama ekipmanı sterilize etmek (E) dokuları korumak için hayvanın başı kesildikten için makas ve makas ve cımbız ve çeşitli boyut ve şekillerde, (F), buz içinde bıçakları büyük bir çift de dahil olmak üzere doku toplama takımı (G)% 70 (h / h) etanol operasyon masa ve çevreler. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. GI bölgesinin ayrılması ve mezenterik lenf sistemi. (A) Kavrama ince diseksiyon forseps ile mezenterik lenf sisteminin merkezi kitle. (B) Kavrama ince bağırsağın proksimal ve zıt yönlerde çekin. (C) GI ve mezenterik lenf sistemi tamamen separat olacake. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

E. oral uygulaması sonraki dokuz gün (sayfa 9) iki gün (P2) arasında değişen yenidoğan sıçan yavrularından Şekil 3. Yaşam coli A192PP, sistemik enfeksiyon güçlü bir yaş bağımlılık gösteren. Her grup 24 yenidoğanlar temsil eder.

E. Şekil 4. Floresan görüntüleri P2 yavru bir kan yaymasında coli A192PP hücreleri bakteri oral uygulanmasından sonra enfekte. bakteri yüzeyinde lipopolisakkaritin O antijeni st oldutavşan anti-Ø18 poliklonal antikoru ve Alexa546-konjuge keçi-anti-tavşan ikinci antikoruyla ained. K1 kapsül EndoE-GFP reaktif ile görüntülendi. Hemen hemen kan örneklerinde saptanan tüm bakteriler koruyucu K1 kapsülü görüntülenir. Görüntüler Dr Andrea ZELMER tarafından esir edildi. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. E. bakteriyel inokulum. DNA coli A192PP bağırsak kolonizasyonu aşağıdaki İdarenin tüm bağırsak ve E. çıkarılmıştır polysialyltransferase (neus) genini hedef kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile tespit E. coli K 1 koloni oluşturan birim / gr (CFU / g), doku başka bir yerde ¹⁷ tarif edildiği gibi . LOD: algılama sınırı.

Özellik	Sağlıklı	Sağlıksız
Derinin rengi	Pembe	Sarı / Soluk
Çeviklik (doğrulma refleksi)	Pup hemen geri yerleştirme tersine	Geriye yerleştirme (> 3 sn) tersine çevirmede zorluk veya elde edemez
Karın üzerinde hafif bir basınç	Ses yok	Ajitasyon Ses
Mide / süt hattı	Görünür ve beyaz	Görünür değil
Sıcaklık	Sıcak	Nispeten soğuk *
Ağırlık	Günde 1.5-2 g Kazanç	Hiçbir kilo alma veya kilo kaybı
Kafese yerleştirildi Davranış	Annesine karşı hamle ve f başlareeding	Annesine karşı hareket ve beslenme zorluklar gösterir olamaz

Tablo 1. Yedi-noktalı puanlama sistemi: Listelenen ilk üç puanları genellikle gözlenen ilk işaretleridir. * Sistemik enfeksiyon deneyim yükselmiş vücut sıcaklığında (> 2 ° C) ile Yenidoğanlar. Ancak nedeniyle hayvanların çeviklik eksikliği vücut ısısını korumak için annelerini ulaşmak için, sağlıksız hayvanların çöp ayrı düşebilirler ve çıplak elle soğuk hissedebilirsiniz.

Tartışmalar

Burada açıklanan hayvan modeli doğal olarak insanlarda enfeksiyonlara meydana gelen belirgin özellikleri yeniden amaçlanmıştır önceki çalışmaları üzerine inşa edilmiştir. Yenidoğan rat başlangıçta H. nedeniyle bebek menenjit çalışmaya istihdam edildi tür enfeksiyon sağlam bir model için önemli kriterleri yerine b influenza tip. Böylece, ilgili patojenin giriş portal doğal insan enfeksiyonu bunu yansıtmalıdır ve tekrarlanabilir bir terapötik müdahale için izin vermek için yeterli bir süre benzer patolojiye neden olmaktadır. Teknikler işleminin uygulanabilirliğinin sınırlandırmamalıdır kullanılmış ve hastalık sonucu ²⁰ yol açmamalıdırlar. H. modeli Moxon ve arkadaşları tarafından geliştirilen bebek farelerde influenza menenjit bu kriterleri ²⁰ karşılamaktadır; üst solunum yolları ve bu önemli özelliği mukoza zarlarının kolonizasyonu olmayan travmasının sıçan yavrularından çoğaltılmış sonra doğal enfeksiyon meydanaBurun geçişlerinin zarları üzerine bakterilerin tik uygulanmasını kapsamaktadır. Önemli olarak, enfeksiyonun yaşa bağlı doğası modelinde tekrarlanmıştır.

Aynı grup, aynı zamanda E. non-invaziv bir model geliştirmek için ilk idi Yenidoğan sıçan ²² coli K1 NBM. Patojen-free Sprague-Dawley yavrular oral gastrik tüp aracılığıyla ¹⁰ Ağustos - 10 Ekim bakterileri besleyerek kolonize edildi; aşı bu nedenle bize göre istihdam bundan çok daha yüksekti. Üç K1 suşları incelenmiş olan kolonizasyon, C94 (O7: K1: H-), EC3'ün (O1: K1: H-) ve LH (O75: K1: H 3), nispeten yüksek bir oranda (48-74%) arasında meydana gelen hayvanlar K1-beslenen, ancak bakteriyemi, menenjit ve mortalite insidansı değişken ve kolonizasyon oranlarının anlamlı olarak daha düşüktü. E. klonal doğası coli K1 deneysel enfeksiyon geç ²³ kurulmuş ve sadece Ø18 olduğu açıktır: K1 ve, bir dereceye kadar, O7: K1 serotipi edebiliyoruzsürekli sistemik enfeksiyona neden. Bu nedenle, neuropathogenic E. patojenez için bu araştırmalar için K1 soyu A192PP: E. coli K1 hastalık oluşturma geliştirilmiş Ø18 kullanımına dayanmaktadır. E. karşılaştırılması tarafından mukoza yüzeylerine zararlardan dolayı kesinlikle eski yöntem kullanılarak ölüm aşırı sayılarını Achtman grubunun ²³ tarafından kullanıldığı gibi Glöde ve arkadaşları ^22, ve bir damla besleme kullanılan metod ile kullanılabilir ortaya çıktığı gibi bir mide tüpü aracılığıyla yenidoğan sıçanlarda, coli K1 beslenmesi gastrik tüp. Kolonizasyon oranları, bu iki yöntem ile benzer olduğu için, bu iletişim de tarif edildiği gibi, bu, steril bir ucu ile bir pipet kullanılarak, bakterilerin besleme az invaziv yöntemi kullanmak tavsiye edilir.

Çalışmalarımızda kullanılan E. coli A192PP Ø18 olduğu: K1. Bu klinik suş E. daha öldürücü türevidir Başlangıçta septisemi ²⁷ olan bir hastadan elde edildi Coli A192 sup. Soyunun artan hastalık oluşturma yeni doğmuş sıçanlarda ²⁶ boyunca bir seri pasaj olarak elde edildi. 2 gün eski hayvanlara ²⁸ uygulandığında gerilme% 100 bakteriyemi ve mortalite ile, yaşa bağlı bir hastalık şiddetini ortaya çıkarmaktadır. Buna karşılık, 9 gün eski hayvanlar hastalığa karşı dirençlidir. K1 spesifik litik bakteriyofaj, E. ayırt etmek için kullanılabilir Diğer E. Coli K1 coli ²⁹ suşları. Bu çalışmada, bakteriyofaj K1E için canlı bakterilerin duyarlılık E. saflığını kontrol (i) için kullanılmalıdır E. coli K1 süspansiyonlar hayvanlara yem olarak hazırlanmıştır, ve (ii) E. ayırt etmek için perianal sürüntü, kan ve doku örneklerinde canlılığını hesaplamak için diğer koliform gelen coli K1. Koloni E. ise E. coli K1, bu bakteriyofaj K1E lize duyarlı olacaktır ve bakteri üremesi bakteriyofaj inokülasyon yerinde önlenir. Koloni E. değilse coli K1, o b olacakKİE bakteriyofaj liziz dirençli, e ve bakteriyofaj inokülasyon yerinde bakteri büyümesinin bir alan olmalıdır. Bu hayvan modelleri doğal olarak oluşan hastalığın tüm özelliklerini yansıtmıyor olabileceği akılda tutulmalıdır. Mevcut model E dışındaki neuropathogenic bakterilerin hastalık oluşturma özelliklerini incelemek üzere değiştirilebilir E. coli A192PP ve kolonize aşı boyutunda farklılıklar yerleştirilebilir. Tekniğinin gelecek uygulamaları çok ihtiyaç duyulan ilaçların değerlendirilmesi durumu tedavi etmek ve kolonizasyon ve doku işgali konak yanıtının ayrıntılarını ortaya çıkarmak için içerebilir.

Burada açıklanan yöntem basit ama etkili. 10 Tek yavrular - 12 yavruların test veya kontrol grubu olarak istihdam edildi ve bu kapsamda-çöp yaklaşım tekrarlanabilirlik ve istatistiksel geçerlilik yüksek derecede sağlar. Bu yavrular herhangi bir prosedüründe sonra en kısa sürede kendi doğal annelerine iade edilir zorunludurE ve yavrular bu nedenle farklı müdahaleler geçiren hayvanlar ihtiva etmemelidir. Bu beslenen aşı aksi yavrular sunulan kültürünü reddetmek olacaktır ısındı olması önemlidir. Yavrular hızlı bir şekilde karmaşık Mikrobiyota geliştirmek ve doğum iki gün içinde GI bebek ve yetişkin bağırsağında en bol bulunan mikroplar olarak kurulan filum bakterilerin geniş bir yelpazesi ile kolonize olur. E. beslenen değil yavrular coli A192PP E. taşımak yok kolonizasyon oranlarının coli K1 GI bölgesinde ¹⁷ ve bu nedenle saptanması nispeten basittir. Bununla birlikte, neus E. kolonize tespiti için QPCR yöntem tabanlı coli K1 geleneksel kültür yöntemleri olduğunu çok daha hassas ve şiddetle ¹⁷ tavsiye edilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)	Harlan, UK
E. coli K1 A192PP	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Glycerol	Sigma, UK	G5516
Mueller-Hinton Agar	Oxoid, UK	CM0037
Mueller-Hinton Broth	Oxoid, UK	CM0405
MacConkey Agar	Oxoid, UK	CM0007
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma, UK	P4417
Ethanol 100%	Sigma, UK	E7023
Heparin Sodium Salt	Sigma, UK	84020	Prepare 20 - 50 units/ml
RNAlater Solution	Sigma, UK	R0901	10 μl/mg tissue
Acetic Acid	Sigma, UK	320099
Chloroform	Sigma, UK	C2432
Methanol	Sigma, UK	322415
Cotton-tipped swabs	Fisher Scientific, UK	11542483
Alcotip Swabs	Scientific Laboratory Supplies, UK	SWA1000
Petri dishes	Sigma, UK	P5856
30 ml Universal Tube	AlphaLaboratories, UK	CW3890
0.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1405-1500
1.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1415-1000
0.1 μl calibrated loops	StarLab, UK	E1412-0112
L-shaped spreaders	StarLab, UK	E1412-1005
Cuvettes	Fisher Scientific, UK	10594175
Forceps straight with fine points	Fisher Scientific, UK	12780036
Forceps straight with blunt tips	Fisher Scientific, UK	12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points	Fisher Scientific, UK	12740926
Scissors straight with very fine points	Fisher Scientific, UK	12972055
Laboratory Scissors	VWR, UK	USBE4251
25 G Syringe Needles	Greiner Bio-One Ltd	N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers	PerkinElmer, UK	L60000BB
Unitemp Incubator	B&T, UK	OP958
Multitron shaking incubator	INFORS HT, UK	AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer	IKA Werke	0003737000