Modelo não-invasiva da neuropatogênicos<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infecção no Rato Neonatal

Resumo

Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide.

Resumo

A investigação das interações entre hospedeiro animal e patógeno bacteriano só faz sentido se o modelo de infecção empregada replica as principais características da infecção natural. Este protocolo descreve os procedimentos de elaboração e avaliação de infecção sistêmica devido a neuropatogénico K1 Escherichia coli no rato neonatal. A colonização do tracto gastrointestinal leva à difusão do agente patogénico ao longo do curso da linfa-intestino-sangue-cérebro de infecção e o modelo exibe forte dependência da idade. A cepa de E. coli O18: K1 com maior virulência para o rato neonatal produz excepcionalmente altas taxas de colonização, a translocação para o compartimento de sangue e invasão das meninges após o trânsito através do plexo coróide. Tal como no hospedeiro humano, a penetração do sistema nervoso central é acompanhada por uma inflamação local e um resultado invariavelmente letal. O modelo de utilidade é comprovada por estudos do mecanismoda patogênese, para a avaliação de intervenções terapêuticas e para avaliar a virulência bacteriana.

Introdução

Infecções bacterianas sistémicas são uma grande ameaça para o bem-estar ea sobrevivência do recém-nascido; prematuros são particularmente vulneráveis. Meningite bacteriana neonatal (NBM), freqüentemente associada a sepse bacteriana, continua a ser uma fonte significativa de mortalidade e morbidade durante as primeiras semanas de vida e que o problema é agravado pela contínua evolução da resistência a drogas antibacterianas linha de frente ^1,2. Um caso de NBM é uma emergência médica que carrega um fardo médico, social e económico elevado ^3; conseqüentemente, há uma necessidade urgente de novas terapêuticas e, sobretudo, novas estratégias profiláticas para reduzir a carga da infecção. Algumas características de NBM são incomuns: no mundo desenvolvido, Escherichia coli e estreptococos do Grupo B são responsáveis ​​pela grande maioria dos casos e a capacidade destas estirpes para provocar NBM está quase sempre associada com a presença de um polissacarídeo de protecção cApsule que permite que o agente patogénico para fugir reconhecimento imunológico processa ^4. Uma proporção muito elevada (80-85%) de E. neuroinvasive coli expressar a cápsula K1 ^5,6, um polímero de ácido polissiálico α-2,8-ligadas que é estruturalmente idêntico ao acolher moduladores da plasticidade neuronal ^7.

A avaliação de novas terapêuticas e profiláticas para NBM e bacteremia e septicemia associada beneficiariam claramente de um modelo animal robusto de infecção que imita as principais características da doença no recém-nascido humano, em particular o forte de dependência da idade e da via natural de infecção . Uma vasta gama de modelos para a meningite bacteriana Gram-positivas e Gram-negativas estão disponíveis ^8,9 e estes têm alargado consideravelmente o nosso conhecimento das opções de patogénese, a patofisiologia e tratamento dessas infecções. Assim, as infecções experimentais em ratos, ratinhos, coelhos e macacos foram usadas para estudar a meningite em ambos os neonate e do adulto. No entanto, muitos destes modelos empregam injecção directa intracisternal ou subcutânea de bactérias para a iniciação da infecção, criando uma patogénese artificial, ignorando os processos naturais de difusão a partir do local de colonização. Em alguns casos, estes métodos de inoculação conduziu a alterações significativas na patologia; por exemplo, a administração subcutânea de E. estirpes de E. coli K1 revogada a dependência da idade associada com a infecção natural, produzindo bacteremia e invasão do sistema nervoso central (SNC) em ambos os recém-nascidos e adultos ^10. Predisposição a E. coli NBM é criticamente dependente da transmissão vertical do agente causador da mãe para o bebê no momento ou logo após o nascimento ^11. Maternalmente-derivado E. bactérias coli K1 colonizar o gastrointestinal neonatal (GI) ^13/11, que é estéril ao nascimento, mas rapidamente adquire uma microbiota complexa ^14. Em recém-nascidos colonizados, E. coliK1 bactérias têm a capacidade de translocar a partir do lúmen intestinal para a circulação sistémica antes de entrar no SNC através do sangue ou cérebro-cefalorraquidiano de sangue barreiras de fluido ^9,15. O design de modelos robustos de infecção experimental deve levar esses detalhes em conta.

Embora os ratos têm sido amplamente utilizados para o estudo de algumas formas de meningite bacteriana ^8, eles não são adequados para estudos de infecção neonatal: eles são esmagados por uma infecção sistémica e não mostram a forte dependência da característica idade de ¹⁶ bebés humanos. Além disso, α-defensinas, péptidos-chave do tracto GI, proporcionando protecção contra a invasão por E. sistémica coli K1 ^17, são altamente expresso em células de Paneth e neutrófilos nos seres humanos e de ratos, mas não em ratos ^18. Há um notável grau de duplicação, redundância e heterogeneidade no rato defensin e genes relacionados cryptidin não encontrada em outro umanimais produtores ^19. O rato neonatal foi inicialmente usado por Moxon e colegas de trabalho ^{de 20} para investigar a patogênese da meningite por Haemophilus influenzae após inoculação intranasal, replicando o local natural da colonização deste patógeno neonatal no ser humano, e posteriormente adaptado para a idade-dependente E. coli K1 bacteremia e meningite. Bortolussi et al. ²¹ empregada injeção intraperitoneal do inóculo bacteriano para iniciar a infecção, mas o estudo fundamental de Glode e colaboradores ^{22 utilizaram} alimentação gástrica por via oral para paralela a via natural de infecção após colonização GI. Como o tubo gástrico pode danificar superfícies mucosas, o procedimento foi aperfeiçoada para incluir a alimentação do inóculo para os recém-nascidos ^23. Aqui, o método de colonização e procedimentos para a detecção da infecção em filhotes de ratos suscetíveis são descritos trato GI; adicionalmente, são discutidas aplicações terapêuticas e preventivas do modelo.

Protocolo

Todos os experimentos com animais realizados neste estudo conformados com a legislação nacional e europeia e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Farmácia da UCL e do Reino Unido Home Office (HO). Todo o trabalho animal foi conduzido sob projeto HO licencia PPL 80/2243 e 70/7773 PPL.

1. Rat Preparação

1. Realizar todos os experimentos in vivo utilizando ratos Wistar neonatais isentos de agentes patogénicos.
2. Guarde todas as ninhadas de ratos neonatos (12 por colônia) em gaiolas individuais com as mães que amamentam (9 - 11 semanas de idade) do sexo feminino, sob condições ideais (19-21 ° C, 45-55% de umidade, 15-20 trocas de ar / hora e 12 h ciclo claro / escuro).

2. Preparação celular bacteriana

1. Loja E. existências coli K1 em 20% (v / v) de glicerol a -80 ° C. Para cada experiência, as bactérias placa pasta sobre Mueller-Hinton (MH) placas de agar, e incubar a 37 ° CO / N.
2. O dia antes da alimentação, inocufinal 10 ml de caldo MH, com um único E. coli K1 colónia e cultura O / N a 37 ° C, 200 rpm. Como um controlo para a contaminação forma, preparar 10 ml de caldo MH não inoculado e incubar a 37 ° C a 200 rpm.
3. Transferir 100 uL de suspensão bacteriana S / N em 9,9 ml de caldo MH (1: 100 v / v), e incubar a 37 ° C, 200 rpm, até o meio-exponencial de fase é atingida, o que corresponde a uma densidade óptica de 0,6 medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD _600).

3. A alimentação de ratos recém-nascidos com E. coli K1

1. Suavemente segurar o animal verticalmente em um lado da nuca do pescoço, permitindo que a boca se abra. Lentamente inserir a ponta de pipeta estéril para dentro da boca do animal, e pipeta de 20 uL do inoculo (~ 37 ° C) para dentro da boca do animal ao longo de um período de tempo de 30 seg. Retorne o animal para sua mãe imediatamente após a alimentação.
2. Verificar se 4-8 x 10 ⁶ bactérias foram alimentados to cada filhote por diluição em série do inóculo em PBS e manchas em ágar MH.

4. Avaliação de colonização por E. coli K1

1. Suavemente segurar o animal em um lado da nuca do pescoço. Umedeça um cotonete estéril em PBS estéril, e, em seguida, esfregue suavemente a área perianal. Retorne o animal para sua mãe imediatamente após o esfregaço.
2. Colocar a ponta de mecha para um tubo contendo 300 ul de PBS estéril e armazenar em gelo.
3. Determinar o número de bactérias viáveis ​​por diluição em série em PBS e plaqueamento em placas de agar MacConkey.
4. Determine viável E. coli K1 por testes de susceptibilidade bacteriófago. Escolha uma colónia individual usando um loop microbiológica estéril, mergulhado em 200 mL de PBS estéril, então sujeitas a agitação no vórtex.
5. Usando um loop microbiológica estéril, sub-cultura em ágar MH em uma linha reta. Permitir que a placa secar durante 30 segundos, e, em seguida, pipeta 10 ul de bacK1E teriophage (10 ⁹ unidades formadoras de placas / ml (PFU / ml)) para o centro da linha. Incubar a placa de O / N a 37 ° C.
6. No dia seguinte, examinar a placa para a lise mediada por bacteriófago.

5. Avaliação da Gravidade da doença

1. Avaliar a gravidade da doença de cada animal 4 - 5 vezes por dia utilizando o sistema de pontuação de sete pontos descrito na Tabela 1.
2. Se uma pontuação animais ≥3 de 7, abater o animal imediatamente para minimizar o sofrimento. Grave o animal morto.

6. eutanásia de ratos recém-nascidos e coleta de sangue

1. Suavemente segurar o animal em um lado, expondo a cabeça e pescoço. Desinfetar o pescoço do animal, limpando com uma compressa com álcool. Desinfetar um grande par de tesouras, usando etanol 70%, antes de enxaguar em PBS estéril para remover o etanol traço.
2. Gentilmente segurar o animal diretamente acima de uma placa de Petri. Decapitar o recém-nascido utilizando Surgi afiadatesoura cal, garantindo que o sangue escorre na placa de Petri. Evitar o contacto com a cabeça para evitar a contaminação do sangue com flora da pele.
3. Imediatamente recolher o sangue utilizando uma pipeta estéril e misturar com o sal de sódio de heparina a uma concentração de 20-50 unidades / ml num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
4. Determinar o número de bactérias viáveis ​​por diluição em série em PBS e plaqueamento em placas de agar MacConkey. Determinar os números de viável E. coli K1, testando a susceptibilidade das bactérias viáveis ​​para K1E bacteriófago.

7. Dissecção

1. Após a decapitação do rato neonatal, utilize condições assépticas para extirpar e coletar tecidos de interesse. Lave todos os instrumentos (mostrados na Figura 1) em etanol a 70% e PBS estéril.
2. Limpe o tabuleiro de dissecação e molhar as abdômen completamente com etanol 70%. Posicione o cadáver em suas costas e fixar a placa dissecção por (i) fixar a perna esquerda paraa mesa de operação com uma agulha estéril, (ii) que se estende do cadáver e fixando a pata dianteira direita para a mesa de operação, (iii) fixar a perna traseira direita e pata dianteira esquerda para a mesa de operação.
3. Retire a pele ao longo do lado esquerdo da parte inferior do abdome, usando uma pinça, em seguida, corte ao longo do lado esquerdo do cadáver do abdômen inferior ao esterno utilizando pequenas tesouras de dissecação.
4. Estender a excisão em todo o esterno, e depois para baixo do lado direito do corpo do esterno para o abdome inferior, utilizando uma pinça e uma tesoura pequena de dissecação, garantindo que nenhuma das estruturas subjacentes estão danificados.
5. Finalmente, puxe para baixo a aba de pele do esterno para parte inferior do abdome utilizando íris fórceps de dissecação curvas para expor o peritônio.
6. Suavemente elevar o peritoneu com uma pinça e cortado verticalmente para expor os órgãos internos, assegurando que nenhum dos órgãos subjacentes sejam danificados.

8. Coletao trato GI

1. Identificar o estômago, intestino delgado, ceco, cólon e do sistema linfático mesentérico.
2. Retire o estômago delicadamente transecting em ambos os lados, em seguida, coloque em um bijou contendo 1,6 ml de PBS estéril usando uma pinça estéril.
3. Transecto do cólon no reto. Com cuidado, puxe toda a massa intestinal do cadáver usando uma pinça de dissecação e coloque em uma placa de Petri estéril. Certifique-se de que isso seja feito com cuidado para que a estrutura intestinal e estruturas linfáticas mesentérica não se separam.

9. Separação do trato GI e do sistema linfático mesentérica (Figura 2)

1. Verter 30 ml de PBS estéril para a placa de Petri, assegurar o tracto GI está completamente submerso.
2. Identificar a massa central do sistema linfático mesentérica, e beliscar usando uma pinça de dissecação multa. Identifique a parte mais proximal do intestino delgado, e beliscar usando uma pinça de dissecação multa.
3. Puxe lentamente o Central massa do sistema linfático mesentérico e do intestino delgado distal em sentidos opostos até que os dois tecidos são completamente separadas umas das outras. Realizar esse processo com cuidado para garantir que o intestino delgado não estão esticados, pois isso impede a recolha de reprodutível proximal, médio e distal. Coloque o sistema linfático mesentérica em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo.

10. Seccionamento do trato GI

1. Transect do tracto GI no ceco para separar o intestino delgado a partir do cólon.
2. Inserir o cólon em 300-500 ul de PBS estéril e colocar em gelo.
3. Recolha de tecidos representativas de regiões proximais, médio e distal do intestino delgado. Alinhe o intestino delgado a partir do ponto médio.
4. Então, (i) recolher os últimos 2 cm do tecido antes do ceco como o intestino delgado distal, (ii) recolher o tecido 5-7 cm acima do ponto médio como o intestino delgado proximal, e(Iii) recolher o tecido 3-5 cm abaixo do ponto médio do intestino delgado como do meio.

11. Coleta do Fígado

1. Identificar os três lóbulos do fígado de rato após a remoção do estômago.
2. Puxe lobos longe da cavidade abdominal com a pinça de dissecação multa.
3. Retire o fígado, cortando qualquer ligamentos inerentes usando uma tesoura fina. Coloque fígado em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo.

12. Coleta o Baço

1. Identificar o baço.
2. Puxar baço de distância a partir do estômago e utilize uma tesoura para cortar finas do ligamento gastroesplênico.
3. Coloque baço em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo.

13. Recolha os Rins

1. Identificar os rins que se tornarão visíveis na parte de trás da cavidade abdominal após a remoção do tracto gastrointestinal e de outros órgãos.
2. Ureteres corte e quaisquer ligamentos associados ucantar tesouras de dissecação multa e retirar rins usando uma pinça fina. Remover glândulas supra-renais e qualquer material gorduroso (se ainda ligado), usando uma pinça fina e tesouras de dissecação.
3. Coloque os dois rins em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo.

14. Coleta o Cérebro

1. Após a decapitação, manter a cabeça na posição vertical usando uma pinça curva. Aperte a pele em cima da cabeça longitudinalmente usando um outro conjunto de pinças curvas, e fazer uma incisão com uma tesoura de dissecção finas. Corte pele restante perto do pescoço, mais uma vez longitudinalmente com tesouras de dissecação multa.
2. Retire a pele em uma direção para fora usando uma pinça fina em ambos os lados para revelar o crânio e remover retalhos de pele usando tesouras de dissecação multa. Coloque tesouras de dissecação multa na abertura da coluna vertebral e fazer uma incisão ao longo do crânio em direção à tribuna.
3. Puxe as duas seções do crânio em uma direção para fora usando uma pinça fina. Corta para remover segmentos do crânio.
4. Retirar cérebro usando uma pinça largos, usando um movimento para cima escavando a partir da abertura da coluna vertebral para a tribuna. Lavar o cérebro em PBS duas vezes para remover todo o sangue do procedimento de decapitação.

15. Processamento de Tecidos e homogeneização

1. Para experiências que requerem a contagem de viabilidade ou de extração de DNA, tecidos lugar em tubos contendo PBS estéril. Imediatamente determinar o número de bactérias viáveis ​​por diluição em série em PBS e plaqueamento em placas de agar MacConkey, ou armazenar a -20 ° C com 20% de glicerol para a curto prazo. Para a extração de DNA, armazenar tecidos a -20 ° C.
2. Para as experiências que requerem a extracção de RNA, local tecidos em volumes apropriados da solução RNAlater (10 ul por cada 1 mg de tecido), em seguida, imediatamente armazenar a -20 ° C durante a curto prazo ou a -80 ° C armazenamento a longo prazo.
3. Para as experiências de imagiologia, os tecidos que requerem lugar em 10 ml Methacarn (60% de metanol, 30% de clorofórmio e de ácido acético a 10%), em seguida, armazenar umt RT (20 - 25 ° C) durante até 3 semanas.
4. Calcule o peso do tecido por comparação do peso dos tubos antes e depois da adição de tecidos. Homogeneizar tecidos utilizando um homogeneizador. Lavar o homogeneizador uma vez em etanol a 70% e duas vezes em PBS estéril entre a homogeneização de cada amostra.
   NOTA: Methacarn fixação é desejável para a fixação das amostras intestinais, a fim de preservar as estruturas de defesa da mucosa relacionada com mucina; fixação em formalina pode ser utilizado para tecidos sistémicos.

Resultados

A E. coli K1 modelo de infecção sistémica descrito aqui replica muitas das características da infecção natural em seres humanos. As bactérias são ingeridos, colonizar o tracto GI, se translocam para o compartimento do sangue através dos nódulos linfáticos mesentéricos antes de estabelecer a doença específica do órgão associada à inflamação do cérebro ^24. É importante ressaltar que o modelo apresenta forte dependência dos idosos; como mostrado na Figura 3, de dois dias de idade (P2) crias de ratos são altamente susceptíveis à doença invasiva, mas ao longo de um período de sete dias, os animais tornam-se progressivamente mais refractários à infecção, mas não para a colonização do tracto GI ^17. Depois de trânsito a partir do local de colonização GI para o compartimento do sangue, as bactérias podem ser visualizados em amostras de sangue por microscopia de fluorescência (Figura 4) antes de entrar no SNC predominantemente no plexo coróide ^25. Em alguns animais, existe extensa invasão de outros órgãos importantes, tais comopulmão, baço e rins ^25.

Os números bacterianos em tecidos pode variar entre substancialmente ²⁵ crias individuais, mas quando a carga microbiana é pontuado como presente ou ausente existe um elevado grau de reprodutibilidade em relação à invasão de órgãos. Com uma ninhada de 12 filhotes de cachorro como um único grupo de teste, cálculos de potência, usando G * Power Software determinou que este tamanho de amostra equivale a uma probabilidade de 98,6% de encontrar um efeito baseado na sobrevivência utilizando seis animais da coorte e> 99% de probabilidade, se tudo doze são levados em consideração. O modelo é, portanto, adequado para a avaliação de novos agentes, concebidas especificamente para o tratamento de infecções bacterianas neonatais e foi usado no procedimento para avaliar o potencial terapêutico da cápsula depolimerase EndoE que remove selectivamente a cápsula K1 a partir da superfície bacteriana ^24-26. Ele também pode ser usado para investigar interacções hospedeiro-bactérias que têm impacto sobre o pathogenesis de E. neuropathogens coli; dentro deste contexto, tem sido utilizada para estudos de E. colonização coli A192PP e divulgação. Foi demonstrado que a E. coli A192PP persistem no tracto GI de P2, P5 e P9 filhotes em grande número; aspectos temporais da colonização nestes três grupos foram muito semelhantes (Figura 5) e reflecte a capacidade das bactérias para replicar e manter a densidade de população no intestino.

A virulência do isolado clínico A192 foi melhorada por passagem em série em ratos recém-nascidos, a fim de assegurar pouca ou nenhuma redundância do uso de animais. E. coli A192 colonizado ratos neonatais P2 com 100% de eficiência, provocada bacteremia em 35% dos animais e produziram um efeito letal em 25% ^27. O A192PP derivado passadas coloniza o trato gastrointestinal, produz bacteremia e provoca letalidade em todas as crias P2. Assim, o modelo pode ser utilizado para investigar a virulência de different K1 estirpes no que diz respeito à sua capacidade de invadir o sistema nervoso central e outros sistemas de órgãos a partir do local de colonização. Neste contexto, Pluschke e co-trabalhadores ²³ utilizado um modelo de infecção de rato neonatal para determinar a capacidade de 95 E. coli K1 cepas de origem humana para causar bacteremia após a colonização do intestino; eles observaram grandes variações na eficiência de ambos colonização e capacidade invasiva, sustentando a natureza clonal de E. coli K1 neuropathogens.

Figura 1. Materiais para coleta de tecido: (A) balança, (B) tubos pré-pesados ​​contendo mídia necessárias, (C) operação de mesa, régua e agulhas de definir o animal, (D) 70% (v / v) etanol e PBS para esterilizar o equipamento de recolha de tecidos, (E) kit de recolha de tecido incluindo uma grande par de tesouras para a decapitação e tesouras e pinças e lâminas de vários tamanhos e formas, (F) de gelo para preservar os tecidos, (G) 70% (v / v) de etanol para esterilizar mesa de operação e circunda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Separação do trato GI e sistema linfático mesentérico. (A) Segure a massa central do sistema linfático mesentérica com uma pinça de dissecação multa. (B) Segure a parte proximal do intestino delgado, e puxar em direções opostas. (C) O trato gastrointestinal e sistema linfático mesentérica será totalmente separate. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Sobrevivência de filhotes de ratos recém-nascidos com idade a partir de dois dias (P2) a nove dias (P9), após a administração oral de E. coli A192PP, ilustrando a forte dependência idade de infecção sistêmica. Cada grupo representa 24 recém-nascidos.

Figura 4. As imagens de fluorescência de E. coli em células A192PP um esfregaço de sangue a partir de um cachorro P2 infectada, após a administração oral de bactérias. O antigénio de lipopolissacárido ó na superfície bacteriana foi rained elevação com anticorpo policlonal de coelho anti-O18 e segundo anticorpo conjugado Alexa546 de cabra anti-coelho. A cápsula K1 foi visualizado com reagente EndoE-GFP. Virtualmente todas as bactérias detectados em amostras de sangue exibida a cápsula de protecção K1. As imagens foram capturadas pelo Dr. Andrea Zelmer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. E. coli A192PP colonização intestinal a seguir à administração do inoculo bacteriano. O DNA foi extraído a partir de todo intestino e E. unidades formadoras de colónias / g (CFU / g) de tecido coli K1 determinado pela reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) gene alvo polysialyltransferase (NEUS) tal como descrito noutro local ¹⁷ . LOD: limite de detecção.

Característica	Saudável	Insalubre
Cor da pele	Rosa	Pálido / Amarelo
Agilidade (reflexo de endireitamento)	Pup reverte imediatamente em colocação para trás	Dificuldade em reverter colocação para trás (> 3 seg) ou não pode alcançar
Uma leve pressão no abdômen	Não há som	Som da agitação
Estômago line / leite	Visível e branco	Não visível
Temperatura	Quente	Relativamente frio *
Peso	Ganho de 1,5-2 g por dia	Nenhum ganho ou perda de peso
Comportamento quando colocado na gaiola	Move-se para a mãe e começa feeding	Não é possível mover em direção a mãe e mostra dificuldade para se alimentar

Tabela 1. sete pontos sistema de pontuação: As três primeiras contagens listados são geralmente os primeiros sinais observados. * Recém-nascidos com infecção sistêmica experiência temperatura corporal elevada (> 2 ° C). No entanto, devido à falta de agilidade dos animais para chegar a sua mãe para manter a temperatura corporal, os animais não saudáveis ​​pode separar-se da maca e sentir frio à mão nua.

Discussão

O modelo animal aqui descrito baseia-se em trabalho anterior que teve como objetivo reproduzir as principais características de infecções que ocorrem naturalmente no organismo humano. Ratos recém-nascidos foram inicialmente utilizados para estudar a meningite infantil por H. influenzae tipo b, como a espécie satisfeito os critérios-chave para um modelo robusto de infecção. Assim, o portal de entrada do agente patogénico deve reflectir a da infecção humana natural e de forma reprodutível dar origem a patologia semelhante a duração suficiente para permitir a intervenção terapêutica. As técnicas utilizadas não deve limitar a aplicabilidade do procedimento e não deve contribuir para a evolução da doença ^20. O modelo de H. influenzae meningite em ratos infantis desenvolvidos por Moxon e seus colegas satisfaz estes critérios ^20; a infecção natural ocorre após a colonização das membranas mucosas do tracto respiratório superior e esta característica importante foi replicado nas crias de rato por não-traumainstilação tic das bactérias sobre as membranas das passagens nasais. É importante ressaltar que a natureza dependente da idade da infecção foi replicada no modelo.

O mesmo grupo também foram os primeiros a desenvolver um modelo não-invasivo de E. coli K1 NBM no rato neonatal ^22. Isentos de agentes patogénicos filhotes Sprague-Dawley foram colonizados pela alimentação ¹⁰ agosto - 10 outubro bactérias através de um tubo gástrico oral; o inoculo era, portanto, consideravelmente maior do que a empregue por nós. Colonização com as três cepas K1 examinados, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) e LH (O75: K1: H3), ocorreu em uma proporção relativamente alta (48-74%) de animais K1-alimentados, mas a incidência de bacteremia, meningite e mortalidade foram variáveis ​​e significativamente menor do que as taxas de colonização. A natureza clonal da E. coli K1 infecção experimental foi estabelecido posteriormente ²³ e é agora evidente que somente O18: K1 e, em menor grau, O7: K1 serotipos são capazespara causar consistentemente infecção sistémica. Por esta razão, estas investigações da patogênese da neuropatogénico E. coli K1 foram baseados na utilização do O18-enhanced virulência: K1 estirpe A192PP. Uma comparação dos E. coli K1 alimentação de ratos recém-nascidos por meio de uma sonda gástrica, usada por Glode e colegas ^22, e um método de alimentação de gotículas como empregada pelo grupo de Achtman ²³ reveladas número excessivo de mortes utilizando o método antigo, quase certamente devido aos danos a superfícies mucosas pelo tubo gástrico. Como as taxas de colonização são comparáveis ​​com estes dois métodos, recomenda-se usar o método menos invasivo de alimentar as bactérias usando uma pipeta esterilizada com uma ponta, tal como descrito na presente comunicação.

E. coli A192PP utilizado em nossos estudos é O18: K1. É um derivado mais virulenta da estirpe de E. clínica coli A192 que foi originalmente recuperados a partir de um paciente com septicemia ²⁷ . O aumento da virulência da cepa foi obtida pela passagem de série através de ratos recém-nascidos ^26. A tensão provoca uma severidade da doença idade-dependente, com 100% de bacteremia e mortalidade quando administrado a dois dias de idade os animais ^28. Em contraste, 9 dias de idade os animais são completamente resistentes à doença. -K1 específica de bacteriófago lítico pode ser utilizado para diferenciar E. coli K1 de E. outra coli ^29. Neste estudo, a sensibilidade das bactérias viáveis ​​para K1E bacteriófago deve ser utilizado para (i) verificar a pureza da E. As suspensões coli K1 preparado para ser alimentado para os animais, e (ii) para diferenciar E. coli K1 de outros coliformes, a fim de calcular a viabilidade em esfregaços perianais, sangue e amostras de tecidos. Se a colônia é E. coli K1, será susceptível a lise bacteriófago K1E, e crescimento bacteriano será inibida no local da inoculação bacteriófago. Se a colônia não é E. coli K1, que vai bresistentes à lise KIE bacteriófago e, e não deve haver uma área de crescimento de bactérias no local da inoculação bacteriófago. Deve-se ter em mente que os modelos animais não pode refletir todas as características da doença que ocorre naturalmente. O modelo actual pode ser modificado para examinar as características de virulência de outras bactérias do que E. neuropatogênicos coli A192PP e variações no tamanho do inoculo colonizar podem ser acomodados. Futuras aplicações da técnica poderia incluir a avaliação de medicamentos tão necessários para tratar a doença e para descobrir detalhes da resposta do hospedeiro à colonização e invasão dos tecidos.

O método descrito aqui é simples, mas eficaz. Ninhadas individuais de 10 - 12 crias foram empregados como grupos de teste ou de controlo e esta abordagem dentro-maca garante um elevado grau de reprodutibilidade e validade estatística. É imperativo que os filhotes são devolvidos às suas mães naturais o mais rapidamente possível após qualquer procedure ninhadas e não deve, portanto, compreendem animais submetidos a diferentes intervenções. É importante que o inoculo alimentados ser aquecida de outro modo os filhotes irão rejeitar a cultura oferecido. Os filhotes rapidamente desenvolver uma microbiota complexa e dentro de dois dias após o nascimento do trato gastrointestinal é colonizado com uma vasta gama de bactérias do filo estabelecido como os micróbios mais abundantes no intestino infantil e adulto. Os filhotes que não foram alimentados com E. coli A192PP não carregam E. coli K1 no tracto GI ¹⁷ e assim a determinação das taxas de colonização é relativamente simples. No entanto, o método NEUS baseados qPCR para a detecção de colonizar E. coli K1 é muito mais sensível que os métodos tradicionais de cultivo e é fortemente recomendado ^17.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)	Harlan, UK
E. coli K1 A192PP	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Glycerol	Sigma, UK	G5516
Mueller-Hinton Agar	Oxoid, UK	CM0037
Mueller-Hinton Broth	Oxoid, UK	CM0405
MacConkey Agar	Oxoid, UK	CM0007
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma, UK	P4417
Ethanol 100%	Sigma, UK	E7023
Heparin Sodium Salt	Sigma, UK	84020	Prepare 20 - 50 units/ml
RNAlater Solution	Sigma, UK	R0901	10 μl/mg tissue
Acetic Acid	Sigma, UK	320099
Chloroform	Sigma, UK	C2432
Methanol	Sigma, UK	322415
Cotton-tipped swabs	Fisher Scientific, UK	11542483
Alcotip Swabs	Scientific Laboratory Supplies, UK	SWA1000
Petri dishes	Sigma, UK	P5856
30 ml Universal Tube	AlphaLaboratories, UK	CW3890
0.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1405-1500
1.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1415-1000
0.1 μl calibrated loops	StarLab, UK	E1412-0112
L-shaped spreaders	StarLab, UK	E1412-1005
Cuvettes	Fisher Scientific, UK	10594175
Forceps straight with fine points	Fisher Scientific, UK	12780036
Forceps straight with blunt tips	Fisher Scientific, UK	12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points	Fisher Scientific, UK	12740926
Scissors straight with very fine points	Fisher Scientific, UK	12972055
Laboratory Scissors	VWR, UK	USBE4251
25 G Syringe Needles	Greiner Bio-One Ltd	N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers	PerkinElmer, UK	L60000BB
Unitemp Incubator	B&T, UK	OP958
Multitron shaking incubator	INFORS HT, UK	AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer	IKA Werke	0003737000