Modèle non-invasive de neuropathogènes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Maladies infectieuses chez le rat nouveau-né

Résumé

Ici, un procédé est décrit pour la mise en place d'une infection systémique chez le rat nouveau-né avec des cultures d'Escherichia coli K1. Cette procédure non invasive permettant la colonisation du tractus gastro-intestinal, de la translocation de l'agent pathogène dans la circulation systémique, et l'invasion du système nerveux central chez le plexus choroïde.

Résumé

Enquête sur les interactions entre l'hôte et des produits animaux bactérie pathogène n'a de sens que si le modèle d'infection employée reprend les principales caractéristiques de l'infection naturelle. Ce protocole décrit les procédures pour la mise en place et l'évaluation de l'infection systémique en raison de neuropathogène K1 Escherichia coli chez le rat nouveau-né. La colonisation du tractus gastro-intestinal conduit à la diffusion de l'agent pathogène le long du parcours gut-lymphe-sang-cerveau de l'infection et le modèle affiche une forte dépendance des personnes âgées. Une souche de E. coli O18: K1 avec virulence accrue pour le rat nouveau-né produit des taux exceptionnellement élevés de colonisation, une translocation vers le compartiment de sang et de l'invasion des méninges suivant transit à travers le plexus choroïde. Comme dans l'hôte humain, la pénétration du système nerveux central est accompagnée d'une inflammation locale et un résultat invariablement mortelle. Le modèle est d'une utilité avérée pour les études du mécanismede la pathogenèse, pour l'évaluation des interventions thérapeutiques et pour l'évaluation de la virulence bactérienne.

Introduction

Infections bactériennes systémiques sont une menace majeure pour le bien-être et la survie du nouveau-né; nouveau-nés prématurés sont particulièrement vulnérables. Méningite bactérienne néonatale (NBM), souvent associée à une septicémie bactérienne, continue d'être une source importante de mortalité et de morbidité au cours des premières semaines de vie et le problème est aggravé par l'évolution continue de la résistance aux médicaments de première ligne antibactériennes ^1,2. Un cas de NBM est une urgence médicale qui porte un fardeau médical, social et économique élevé ^3; par conséquent, il ya un besoin urgent de nouvelles thérapies et, en particulier, de nouvelles stratégies prophylactiques pour réduire le fardeau de l'infection. Certaines fonctionnalités de NBM sont rares: dans le monde développé, Escherichia coli et streptocoques du groupe B sont responsables de la grande majorité des cas et la capacité de ces souches à obtenir NBM est presque toujours associée à la présence d'un polysaccharide de protection capsule qui permet à l'agent pathogène de se soustraire à la reconnaissance immunitaire traite ^4. Une très forte proportion (80 - 85%) de neuroinvasive E. coli exprimer la capsule K1 ^5,6, un polymère d'acide sialique α-2,8-lié qui est structurellement identique à accueillir des modulateurs de la plasticité neuronale ^7.

L'évaluation de nouvelles thérapeutiques et prophylactiques pour NBM et bactériémie associée et la septicémie en tirerait un avantage d'un modèle animal robuste de l'infection qui imite les caractéristiques principales de la maladie dans le nouveau-né humain, en particulier l'âge-dépendance et une voie naturelle de l'infection . Une large gamme de modèles pour la méningite bactériennes Gram-positives et Gram-négatives sont disponibles ^8,9 et ceux-ci ont considérablement élargi nos connaissances sur la pathogenèse, la physiopathologie et les options de traitement de ces infections. Ainsi, des infections expérimentales chez le rat, la souris, le lapin et le singe ont été utilisées pour étudier à la fois dans la méningite neonate et l'adulte. Cependant, nombre de ces modèles utilisent l'injection directe intracisternale ou sous-cutanée de bactéries pour l'initiation de l'infection, ce qui crée une pathogenèse artificiel en court-circuitant les processus naturels de diffusion à partir du site de colonisation. Dans certains cas, ces méthodes d'inoculation ont conduit à des changements importants dans la pathologie; par exemple, l'administration sous-cutanée de E. souches coli K1 abrogés l'âge-dépendance associée à l'infection naturelle, la production de la bactériémie et l'invasion du système nerveux central (SNC) dans les deux nouveau-nés et les adultes ^10. Prédisposition à E. coli NBM dépend essentiellement de la transmission verticale de l'agent causal de la mère à l'enfant à ou peu après la naissance ^11. D'origine maternelle E. bactérie E. coli K1 colonisent le tractus gastro-néonatale (GI) ^11-13, qui est stérile à la naissance, mais acquiert un microbiote complexe ¹⁴ rapidement. Dans les nouveau-nés colonisés, E. coliK1 bactéries ont la capacité de translocation de la lumière intestinale dans la circulation systémique avant de pénétrer dans le SNC à travers la barrière sang-cerveau ou de barrières de liquide céphalo-rachidien, le sang ^9,15. La conception des modèles robustes de l'infection expérimentale devrait prendre ces détails en compte.

Bien que les souris ont été largement utilisés pour l'étude de certaines formes de méningite bactérienne ^8, ils ne sont pas adaptés pour les études de l'infection néonatale: ils sont submergés par une infection systémique et ne montrent pas la caractéristique forte de dépendance des personnes âgées de ¹⁶ nouveau-nés humains. En outre, α-défensines, des peptides clés du tractus gastro-intestinal assurant une protection contre l'invasion systémique par E. coli K1 ^17, sont fortement exprimés dans les cellules de Paneth et des neutrophiles chez les humains et les rats mais pas chez les souris ^18. Il est un remarquable degré de duplication, de redondance et de l'hétérogénéité dans défensines de la souris et les gènes cryptidin connexes ne trouve pas dans d'autres uneimals ^19. Le rat nouveau-né a été initialement utilisée par Moxon et ses collègues ²⁰ pour étudier la pathogenèse de la méningite à Haemophilus influenzae après inoculation intranasale, reproduisant le site naturel de la colonisation de ce pathogène néonatal chez l'homme, et par la suite adapté pour fonction de l'âge E. coli K1 bactériémie et la méningite. Bortolussi et al. ²¹ salarié injection intrapéritonéale de l'inoculum bactérien pour déclencher l'infection mais l'étude clé de Glode et ses collaborateurs ²² utilisé alimentation gastrique orale parallèle la voie naturelle d'infection après GI colonisation. Comme le tube gastrique peut endommager les surfaces muqueuses, la procédure a été affinée afin d'inclure l'alimentation de l'inoculum pour les nouveau-nés ^23. Ici, la méthode de GI colonisation et les procédures de suivi de l'infection chez les bébés rats sensibles sont décrits voies; en outre, les applications thérapeutiques et préventifs du modèle sont discutées.

Protocole

Toutes les expériences pratiquées sur les animaux dans cette étude étaient conformes à la législation nationale et européenne et ont été approuvés par le comité d'éthique de l'École de pharmacie de l'UCL et de l'Intérieur du Royaume-Uni (HO). Tous les travaux des animaux a été réalisée sous projet HO licences PPL 80/2243 et 70/7773 PPL.

1. Préparation Rat

1. Effectuer toutes les expériences in vivo sur des rats nouveau-nés Wistar exempts d'agents pathogènes.
2. Conservez toutes les portées de rats (12 nouveau-nés par colonie) dans des cages individuelles avec leurs mères allaitantes (9 - 11 semaine vieilles femelles), dans des conditions optimales (19 à 21 ° C, 45 - 55% d'humidité, 15 - 20 changements d'air / h et 12 h cycle lumière / obscurité).

2. Préparation cellules bactériennes

1. Magasin E. coli K1 dans les stocks de 20% (v / v) de glycerol à -80 ° C. Pour chaque expérience, étaler actions bactéries SUR DES Mueller-Hinton (MH) des plaques d'agar, et incuber à 37 ° CO / N.
2. La veille de l'alimentation, inocufin 10 ml de bouillon MH avec un seul E. coli K1 colonie et culture O / N à 37 ° C, 200 rpm. Comme un contrôle de contamination moyen, préparer 10 ml de bouillon MH non inoculé et incuber à 37 ° C à 200 rpm.
3. Transférer 100 pl de O / N suspension bactérienne dans 9,9 ml de bouillon MH (1: 100 v / v), et on incube à 37 ° C, 200 tours par minute, jusqu'à la mi-exponentielle de phase est atteinte, ce qui correspond à une densité optique de 0,6 mesurée à une longueur d'onde de 600 nm (DO _600).

3. L'alimentation de rats nouveau-nés avec E. coli K1

1. Tirez doucement l'animal verticalement dans une main de la peau du cou, permettant la bouche pour l'ouvrir. Introduire lentement la pointe de pipette stérile dans la bouche de l'animal, et la pipette 20 ul de l'inoculum (~ 37 ° C) dans la bouche de l'animal sur une période de temps de 30 sec. Retour à l'animal de sa mère immédiatement après le repas.
2. Vérifiez que de 4 - 8 x 10 ⁶ bactéries ont été nourris to chaque chiot par dilution en série de l'inoculum dans PBS et repérer sur gélose MH.

4. Évaluation de la colonisation par E. coli K1

1. Tirez doucement l'animal dans une main de la peau du cou. Humidifiez un tampon de coton-tige stérile dans du PBS stérile, puis essuyez-la délicatement la zone péri-anale. Retour à l'animal de sa mère immédiatement après badigeonnage.
2. Placez la pointe de l'écouvillon dans un tube contenant 300 pi de PBS stérile et stocker sur la glace.
3. Déterminer le nombre de bactéries viables par dilution en série dans du PBS et placage sur des plaques d'agar de MacConkey.
4. Déterminer E. viable coli K1 par des tests de sensibilité bactériophage. Choisissez une colonie individuelle en utilisant une boucle microbiologique stérile, trempé dans 200 ul de PBS stérile, puis soumis à un agitateur vortex.
5. En utilisant une boucle microbiologique stérile, sous-culture sur gélose MH en ligne droite. Laissez sécher la plaque pendant 30 secondes, puis pipette de 10 pi de bacteriophage K1E (10 ⁹ unités formant des plages / ml (PFU / ml)) sur le centre de la ligne. Incuber la plaque O / N à 37 ° C.
6. Le lendemain, examiner la plaque de lyse intermédiaire de bactériophages.

5. Évaluation de la gravité de la maladie

1. Évaluer la gravité de la maladie de chaque animal 4 - 5 fois par jour en utilisant le système de notation en sept points présenté dans le tableau 1.
2. Si un score de animales ≥3 sur 7, abattre immédiatement l'animal à minimiser la souffrance. Notez l'animal mort.

6. Euthanasie de rats nouveau-nés et la collecte de sang

1. Tirez doucement l'animal dans une main, l'exposition de la tête et du cou. Désinfecter le cou de l'animal en l'essuyant avec un tampon imbibé d'alcool. Désinfecter une grande paire de ciseaux en utilisant 70% d'éthanol, avant de rincer dans du PBS stérile pour éliminer les traces de l'éthanol.
2. Tirez doucement l'animal directement au-dessus d'une boîte de Pétri. Décapiter le nouveau-né à l'aide Surgi forteciseaux ques, assurant que le sang coule dans la boîte de Pétri. Eviter le contact avec la tête pour éviter la contamination du sang avec la flore de la peau.
3. Immédiatement recueillir le sang à l'aide d'une pipette stérile et mélanger avec le sel de sodium de l'héparine à une concentration de 20 à 50 unités / ml dans un tube à centrifuger de 0,5 ml.
4. Déterminer le nombre de bactéries viables par dilution en série dans du PBS et placage sur des plaques d'agar de MacConkey. Déterminer le nombre de E. viable coli K1 en testant la sensibilité des bactéries viables à K1E bactériophage.

7. Dissection

1. Après la décapitation du rat nouveau-né, dans des conditions aseptiques pour exciser et de recueillir des tissus d'intérêt. Laver tous les instruments (voir figure 1) à 70% d'éthanol et PBS stérile.
2. Nettoyez le bord de dissection et mouiller l'abdomen complètement avec 70% d'éthanol. Placez le cadavre sur son dos et fixer à la carte de dissection par (i) épinglant la patte arrière gauche dela table d'opération avec une aiguille stérile, (ii) l'étirement du corps et l'épinglage la patte avant droite de la table d'opération, (iii) épinglant la patte arrière droite et gauche patte de la table d'opération.
3. Tirez la peau le long du côté gauche de l'abdomen inférieur à l'aide de pinces, puis couper le long du côté gauche du cadavre de l'abdomen inférieur du sternum à l'aide de petits ciseaux de dissection.
4. Étendre l'excision à travers le sternum, puis sur le côté de la main droite du cadavre du sternum au bas de l'abdomen à l'aide de pinces et de petits ciseaux de dissection, assurant qu'aucun des structures sous-jacentes sont endommagés.
5. Enfin, tirez doucement sur le volet de la peau de la poitrine à l'abdomen inférieur en utilisant l'iris pinces à dissection courbes pour exposer le péritoine.
6. Soulevez doucement le péritoine avec une pince et couper verticalement pour exposer les organes internes, assurant qu'aucun des organes sous-jacents sont endommagés.

8. Collectele tube digestif

1. Identifier l'estomac, l'intestin grêle, caecum, le côlon et le système lymphatique mésentérique.
2. Retirez l'estomac par sectionnant doucement de chaque côté, puis le placer dans un bijou contenant 1,6 ml de PBS stérile à l'aide de pinces stériles.
3. Transect le côlon au rectum. Retirez soigneusement la totalité de la masse intestinale du cadavre en utilisant une pince de dissection et les placer dans une boîte de Pétri stérile. Assurez-vous que cela est fait doucement afin que la structure intestinale et structures lymphatiques mésentériques ne se séparent pas.

9. La séparation du tube digestif et du système lymphatique mésentérique (Figure 2)

1. Verser 30 ml de PBS stérile dans la boîte de Pétri, en assurant le tractus gastro-intestinal est complètement immergé.
2. Identifier la masse centrale du système lymphatique mésentérique, et pincer à l'aide de fines pinces à dissection. Identifier la partie la plus proximale de l'intestin grêle, et pincer à l'aide de fines pinces à dissection.
3. Tirez doucement sur le central de masse de système lymphatique mésentérique et l'intestin grêle distal dans des directions opposées jusqu'à ce que les deux tissus sont totalement séparées l'une de l'autre. Effectuez ce processus avec soin pour veiller à ce que les petits intestins ne sont pas tendus, car cela empêche la collection reproductible proximale, moyenne et régions distales. Placez le système lymphatique mésentérique dans 300 à 500 pi de PBS stérile et placer sur la glace.

10. Le sectionnement du tube digestif

1. Transect le tractus gastro-intestinal à la caecum de séparer l'intestin grêle du côlon.
2. Placez le côlon dans 300-500 pi de PBS stérile et placer sur la glace.
3. Recueillir les tissus représentatifs des régions proximale, intermédiaire et distale de l'intestin grêle. Aligner l'intestin grêle de la mi-parcours.
4. Puis, (i) collectionne les 2 derniers cm de tissu avant de le caecum que l'intestin grêle distal, (ii) de recueillir le tissu 5-7 cm au-dessus du point médian comme l'intestin grêle proximal, et(Iii) recueillir le tissu du 3 - 5 cm au-dessous du point médian que l'intestin grêle milieu.

11. Collecte du foie

1. Identifier les trois lobes du foie de rat après l'enlèvement de l'estomac.
2. Tirez lobes loin de la cavité abdominale à l'aide de fines pinces à dissection.
3. Retirer le foie par couper les ligaments fixation à l'aide de ciseaux fins. Placer le foie dans 300 à 500 pi de PBS stérile et placer sur la glace.

12. La collecte de Spleen

1. Identifier la rate.
2. Tirez rate loin de l'estomac et utiliser des ciseaux fins à couper le ligament gastro.
3. Placez la rate dans 300-500 pi de PBS stérile et placer sur la glace.

13. La collecte des reins

1. Identifier les reins qui deviendront visibles à l'arrière de la cavité abdominale lors de l'enlèvement de l'appareil gastro-intestinal et d'autres organes.
2. Uretères coupées et des ligaments attachés uchanter des ciseaux fins de dissection et enlever les reins à l'aide de pinces fines. Retirer les glandes surrénales et toute matière grasse (si encore attaché) à l'aide de pinces fines et des ciseaux de dissection.
3. Placez les deux reins à 300-500 pi de PBS stérile et placer sur la glace.

14. Collecte du cerveau

1. Après décapitation, maintenir la tête en position verticale en utilisant des pinces courbes. Pincez la peau sur le dessus de la tête en utilisant longitudinalement une autre série de pinces courbes, et faire une incision à l'aide des ciseaux fins de dissection. Couper en restant près de la peau du cou, de nouveau longitudinalement avec des ciseaux fins de dissection.
2. Tirez la peau dans une direction vers l'extérieur à l'aide de pinces fines des deux côtés de révéler le crâne et supprimer lambeaux de peau à l'aide de ciseaux fins de dissection. Placez ciseaux fins de dissection en ouverture de la moelle et faire une incision le long du crâne vers la tribune.
3. Tirez sur les deux sections du crâne dans une direction vers l'extérieur à l'aide de pinces fines. Couper pour supprimer les segments du crâne.
4. Supprimer cerveau à l'aide de larges pinces, en utilisant un mouvement vers le haut de l'excavation de l'ouverture de la moelle vers la tribune. Laver le cerveau dans du PBS deux fois pour enlever tout le sang de la procédure de décapitation.

15. Traitement des tissus et homogénéisation

1. Pour les expériences nécessitant des comptages de viabilité ou l'extraction d'ADN, place des tissus dans des tubes contenant du PBS stérile. Déterminer immédiatement le nombre de bactéries viables par dilution en série dans du PBS et placage sur des plaques de gélose de Mac Conkey, ou conserver à -20 ° C avec 20% de glycérol pour le court terme. Pour l'extraction de l'ADN, des tissus de conserver à -20 ° C.
2. Pour les expériences nécessitant l'extraction d'ARN, place des tissus dans des volumes appropriés de solution RNAlater (10 pi par 1 mg de tissu), puis stocker immédiatement à -20 ° C pour le court terme ou à -80 ° C stockage à long terme.
3. Pour les expériences nécessitant toner, posez tissus dans 10 ml de solution Methacarn (60% méthanol, 30% de chloroforme et de l'acide acétique à 10%), puis stocker unet RT (20-25 ° C) pendant jusqu'à 3 semaines.
4. Calculer le poids du tissu par comparaison des poids des tubes avant et après addition de tissus. Homogénéiser les tissus à l'aide d'un homogénéisateur. Laver une fois l'homogénéisateur dans 70% d'éthanol et deux fois dans du PBS stérile entre l'homogénéisation de chaque échantillon.
   REMARQUE: Methacarn fixation est souhaitable pour la fixation des échantillons intestinaux afin de préserver les structures de défense des muqueuses liée mucine; formol fixation peut être utilisé pour les tissus systémiques.

Résultats

Le E. coli K1 modèle d'infection systémique décrit ici reprend la plupart des caractéristiques de l'infection naturelle chez l'homme. Les bactéries sont ingérées, coloniser le tractus gastro-intestinal, la translocation dans le compartiment de sang via les ganglions lymphatiques mésentériques, avant l'établissement de la maladie spécifique d'un organe à une inflammation associée du cerveau ^24. Surtout, le modèle affiche une forte dépendance des personnes âgées; comme le montre la figure 3, deux jours d'âge (P2) de jeunes rats sont très sensibles à la maladie invasive, mais sur une période de sept jours, les animaux deviennent de plus en plus réfractaires à l'infection, mais pas à ¹⁷ la colonisation du tube digestif. Après transit à partir du site de colonisation gastro-intestinal pour le compartiment sang, les bactéries peuvent être visualisés dans des échantillons de sang par microscopie de fluorescence (figure 4) avant d'entrer dans le système nerveux central essentiellement au plexus choroïde ^25. Chez certains animaux, il ya une vaste invasion d'autres organes majeurs tels quepoumons, la rate et les reins ^25.

Le nombre de bactéries dans les tissus peuvent varier considérablement entre les petits individuelles ^25, mais lorsque la charge microbienne est marqué comme présent ou absent, il ya un degré élevé de reproductibilité à l'égard de l'invasion organe. Avec une portée de 12 chiots en une seule cohorte de test, les calculs de puissance en utilisant G Software Puissance * déterminé que la taille de cet échantillon correspond à une probabilité de trouver un effet basé sur la survie en utilisant six animaux de la cohorte et> 99% de probabilité si tout 98,6% douze sont pris en considération. Le modèle est donc adapté à l'évaluation de nouveaux agents spécialement conçus pour le traitement des infections bactériennes et néonatale a été utilisé dans le mode opératoire pour évaluer le potentiel thérapeutique de la capsule dépolymérase EndoE qui supprime sélectivement la capsule K1 de la surface bactérienne ^24-26. Il peut également être utilisé pour étudier les interactions hôte-bactérie qui ont un impact sur le pathogenesis de E. neuropathogens coli; dans ce contexte, il a été utilisé pour les études de E. coli A192PP colonisation et la diffusion. Il a été démontré que E. cellules coli A192PP persistent dans le tractus gastro-intestinal de P2, P5 et P9 chiots en grand nombre; aspects temporels de la colonisation dans ces trois groupes étaient très similaires (Figure 5) et reflète la capacité de la bactérie à reproduire et maintenir la densité de la population dans l'intestin.

La virulence de la souche clinique A192 a été renforcée par le passage en série chez les rats nouveau-nés afin d'assurer que peu ou pas de redondance de l'utilisation des animaux. E. coli A192 colonisé P2 rats nouveau-nés avec 100% d'efficacité, a suscité une bactériémie chez 35% des animaux et a produit un effet létal à 25% ^27. Le A192PP dérivé des passages colonise le tractus gastro-intestinal, produit bactériémie et provoque la létalité dans tous les petits P2. Ainsi, le modèle peut être utilisé pour étudier la virulence de différentes K1 souches en ce qui concerne leur capacité à envahir les autres systèmes d'organes du système nerveux central et sur le site de colonisation. Dans ce contexte, Pluschke et collaborateurs ²³ ont utilisé un modèle d'infection chez le rat nouveau-nés afin de déterminer la capacité de 95 E. coli K1 souches d'origine humaine pour provoquer une bactériémie après la colonisation intestinale; ils ont observé de grandes variations dans l'efficacité de la colonisation et à la fois la capacité invasive, qui sous-tend la nature clonale de E. coli K1 neuropathogens.

Figure 1. Matériaux pour la collecte de tissus: (A) balance, (b) des tubes pré-pesées contenant des milieux nécessaires, (C) le fonctionnement table, règle et aiguilles à cerner l'animal, (D) 70% (v / v) de l'éthanol et du PBS pour stériliser l'équipement de collecte de tissu, (E) Kit de collecte de tissus, y compris une grande paire de ciseaux pour la décapitation et ciseaux et des pinces et les lames de différentes tailles et formes, (F) la glace pour conserver les tissus, (G) 70% (v / v) d'éthanol pour la stérilisation la table d'opération et ses environs. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. La séparation du tractus gastro-intestinal et le système lymphatique mésentérique. (A) Saisissez la masse centrale du système lymphatique mésentérique avec de fines pinces à dissection. (B) Saisissez la partie proximale de l'intestin grêle, et tirer dans des directions opposées. (C) Le tractus gastro-intestinal et le système lymphatique mésentérique sera entièrement indépendante sure. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. La survie des bébés rats nouveau-nés âgés de deux jours (P2) à neuf jours (P9) après l'administration orale de E. coli A192PP, illustrant la forte dépendance des personnes âgées de l'infection systémique. Chaque groupe représente 24 nouveau-nés.

Figure 4. images de fluorescence de E. cellules coli A192PP dans un frottis sanguin d'un chiot de P2 infectés après administration orale de bactéries. L'antigène lipopolysaccharide O à la surface bactérienne était stained avec un anticorps polyclonal de lapin anti-O18 et second anticorps conjugué à Alexa546 de chèvre anti-lapin. La capsule K1 a été visualisée avec un réactif EndoE-GFP. Pratiquement toutes les bactéries détectées dans des échantillons de sang affichées à la capsule de protection K1. Les images ont été capturées par le Dr Andrea Zelmer. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. E. coli A192PP colonisation intestinale après l'administration de l'inoculum bactérien de l'ADN. On a extrait de l'intestin entier et E. coli K1 unités formant colonie / g (UFC / g) de tissu déterminé par la réaction quantitative en chaîne par polymérase (PCR quantitative) ciblant le gène polysialyltransférase (Neus) comme décrit ailleurs ¹⁷ . LOD: limite de détection.

Caractéristique	Sain	Malsain
Couleur de la peau	Rose	Pale / Jaune
Agilité (réflexe de redressement)	Pup inverse immédiatement sur le placement en arrière	Difficulté à inverser placement vers l'arrière (> 3 sec) ou ne peut pas atteindre
Une légère pression sur l'abdomen	Pas de son	Son agitation
Estomac ligne / de lait	Visible et blanc	Non visible
Température	Chaud	Relativement froid *
Poids	Gain de 1,5-2 g par jour	Pas de prise de poids ou perte de poids
Comportement lorsqu'il est placé dans une cage	L'évolution vers la mère et commence feeding	Impossible de déplacer vers la mère et montre la difficulté à téter

Tableau 1. Sept points système de notation: Les trois premiers scores énumérés sont généralement les premiers signes observés. * Les nouveau-nés atteints d'une infection systémique expérience élevé la température du corps (> 2 ° C). Cependant, en raison du manque de souplesse des animaux pour atteindre leur mère à maintenir la température du corps, les animaux malades peuvent être séparés de la litière et sentir le froid de la main nue.

Discussion

Le modèle animal décrit ici se fonde sur des travaux antérieurs qui vise à reproduire les principales caractéristiques des infections survenant naturellement chez l'homme. Rats nouveau-nés ont été initialement utilisées pour étudier la méningite infantile dus à H. influenzae de type b-dire l'espèce remplit les critères clés pour un modèle robuste de l'infection. Ainsi, le portail d'entrée de l'agent pathogène devrait refléter celle de l'infection naturelle de l'homme et donner reproductible monter à la pathologie semblable d'une durée suffisante pour permettre une intervention thérapeutique. Les techniques utilisées ne doit pas limiter l'application de la procédure et ne devraient pas contribuer à la maladie résultat ^20. Le modèle de H. influenzae méningite chez les rats nourrissons développés par Moxon et collègues répond à ces critères ^20; l'infection naturelle se produit après la colonisation des muqueuses des voies respiratoires supérieures et cette caractéristique importante a été reproduit dans les rats nouveau-nés par des non-traumatiquetic instillation des bactéries sur les membranes des voies nasales. Fait important, la nature dépendant de l'âge de l'infection a été reproduit dans le modèle.

Le même groupe étaient également les premiers à développer un modèle non-invasive de E. coli K1 NBM chez le rat nouveau-né ^22. Chiots Sprague-Dawley exempts d'agents pathogènes ont été colonisés par l'alimentation ¹⁰ août au 10 oct bactéries à travers un tube gastrique par voie orale; l'inoculum est donc considérablement plus élevée que celle employée par nous. La colonisation par les trois souches K1 examinés, C94 (O7: K1: H), EC3 (O1: K1: H) et LH (O75: K1: H3), a eu lieu dans une proportion relativement élevée (48-74%) de K1 animaux nourris, mais l'incidence de la bactériémie, la méningite et la mortalité étaient variables et significativement plus faible que les taux de la colonisation. La nature clonale de E. coli K1 infection expérimentale a été établi plus tard ²³ et il est maintenant évident que seule O18: K1 et, dans une moindre mesure, O7: K1 sérotypes sont capablesà provoquer systématiquement une infection systémique. Pour cette raison, ces enquêtes de la pathogenèse de neuropathogène E. coli K1 étaient basées sur l'utilisation de la O18 virulence accrue: K1 souche A192PP. Une comparaison de E. coli K1 alimentation de rats nouveau-nés grâce à une sonde gastrique, tel qu'il est utilisé par Glode et ses collègues ^22, et une méthode d'alimentation des gouttelettes comme employé par le groupe Achtman ²³ a révélé un nombre excessif de décès à l'aide de la première méthode, presque certainement en raison de dommages aux surfaces muqueuses par la sonde gastrique. Comme les taux de colonisation sont comparables à ces deux méthodes, il est recommandé d'utiliser la méthode moins invasive de nourrir les bactéries à l'aide d'une pipette avec une pointe stérile, tel que décrit dans la présente communication.

E. coli A192PP de souche utilisée dans nos études est O18: K1. Il est de plus un dérivé de la souche virulente de E. clinique coli A192 qui a été initialement récupéré à partir d'un patient atteint de septicémie ²⁷ . La virulence accrue de la souche a été obtenue par passage en série par ²⁶ rats nouveau-nés. La souche provoque une gravité de la maladie dépendant de l'âge, de la bactériémie et 100% de mortalité lorsqu'ils sont administrés à des animaux âgés 2 jours ^28. En revanche, âgés de 9 jours les animaux sont complètement résistants à la maladie. K1-spécifique du bactériophage lytique peut être utilisé pour distinguer E. coli K1 autre de E. souches coli ^29. Dans cette étude, la sensibilité des bactéries viables à K1E bactériophage doit être utilisé pour (i) vérifier la pureté de la E. suspensions coli K1 prêts à être donnés aux animaux, et (ii) de différencier E. coli K1 des autres coliformes afin de calculer la viabilité dans les écouvillons péri-anales, du sang et des échantillons de tissus. Si la colonie est E. coli K1, elle sera susceptible de bactériophage K1E lyse, et la croissance bactérienne est inhibée au niveau du site d'inoculation bactériophage. Si la colonie est pas E. coli K1, il sera brésistant à KIE lyse bactériophage e, et il devrait y avoir une zone de croissance bactérienne au site d'inoculation bactériophage. Il convient de garder à l'esprit que les modèles animaux ne peuvent pas refléter toutes les caractéristiques de la maladie naturelle. Le modèle actuel peut être modifié de manière à examiner les caractéristiques de virulence de bactéries autres que E. neuropathogènes coli A192PP et des variations dans la taille de l'inoculum coloniser peuvent être logés. Les applications futures de la technique pourraient inclure l'évaluation des médicaments a grand besoin de traiter la maladie et de découvrir les détails de la réponse de l'hôte à la colonisation et l'invasion des tissus.

La méthode décrite ici est simple mais efficace. Portées simples de 10 - 12 chiots ont été employés comme groupes d'essai ou de contrôle et cette approche dans litière assure un degré élevé de reproductibilité et de la validité statistique. Il est impératif que les chiots sont retournés à leur mère naturelle dès que possible après tout procedure et portées ne doivent pas comprendre pourquoi les animaux soumis à différentes interventions. Il est important que l'inoculum nourris être réchauffé sinon les chiots rejeter la culture offert. Les chiots se développent rapidement une microflore complexe et dans les deux jours de la naissance, le tractus gastro-intestinal est colonisée avec un large éventail de bactéries du phylum établi que les microbes les plus abondants chez le nourrisson et adulte intestin. Les chiots qui ne sont pas nourris E. coli A192PP ne portent pas E. coli K1 dans le tractus gastro-intestinal ¹⁷ et ainsi de détermination des taux de colonisation est relativement simple. Cependant, la méthode à base de Neus qPCR pour la détection de la colonisation E. coli K1 est beaucoup plus sensible que les méthodes de culture traditionnelles et est fortement recommandé ^17.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)	Harlan, UK
E. coli K1 A192PP	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Glycerol	Sigma, UK	G5516
Mueller-Hinton Agar	Oxoid, UK	CM0037
Mueller-Hinton Broth	Oxoid, UK	CM0405
MacConkey Agar	Oxoid, UK	CM0007
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma, UK	P4417
Ethanol 100%	Sigma, UK	E7023
Heparin Sodium Salt	Sigma, UK	84020	Prepare 20 - 50 units/ml
RNAlater Solution	Sigma, UK	R0901	10 μl/mg tissue
Acetic Acid	Sigma, UK	320099
Chloroform	Sigma, UK	C2432
Methanol	Sigma, UK	322415
Cotton-tipped swabs	Fisher Scientific, UK	11542483
Alcotip Swabs	Scientific Laboratory Supplies, UK	SWA1000
Petri dishes	Sigma, UK	P5856
30 ml Universal Tube	AlphaLaboratories, UK	CW3890
0.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1405-1500
1.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1415-1000
0.1 μl calibrated loops	StarLab, UK	E1412-0112
L-shaped spreaders	StarLab, UK	E1412-1005
Cuvettes	Fisher Scientific, UK	10594175
Forceps straight with fine points	Fisher Scientific, UK	12780036
Forceps straight with blunt tips	Fisher Scientific, UK	12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points	Fisher Scientific, UK	12740926
Scissors straight with very fine points	Fisher Scientific, UK	12972055
Laboratory Scissors	VWR, UK	USBE4251
25 G Syringe Needles	Greiner Bio-One Ltd	N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers	PerkinElmer, UK	L60000BB
Unitemp Incubator	B&T, UK	OP958
Multitron shaking incubator	INFORS HT, UK	AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer	IKA Werke	0003737000