Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Özet

Biz yüksek çözünürlüklü mikroskopi için mika desteklenen lipit katmanlarını hazırlamanın bir yöntem mevcut. Mica bir atomik ölçekte şeffaf ve düz, ancak nadiren nedeniyle zorluklar ele görüntülenmesinde kullanılan; bizim hazırlık mika tabakanın da birikimi ile sonuçlanır, ve iki katmanlı hazırlanmasında kullanılan malzemeyi azaltır.

Özet

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır (SLBS) yaygın membran özellikleri (faz ayrımı, kümeleme dinamikleri) ve bu tür ilaçların veya peptidler gibi başka bileşikler ile etkileşimi incelemek için bir model olarak kullanılır. Ancak SLB özellikleri, kullanılan desteğine bağlı olarak farklılık gösterir.

SLB görüntüleme ve ölçümler için yaygın olarak kullanılan teknikler tek bir molekülün floresan mikroskopi, FCS ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) vardır. AFM son derece düz bir yüzeye (genellikle mika) gerektirir ise en çok optik görüntüleme çalışmaları, bir cam destek üzerinde gerçekleştirildiği için bu maddelerin şarj ve yumuşaklık özellikleri güçlü difüzyon etkileyebilir, çünkü bu teknikleri sonuçları, doğrudan karşılaştırılamaz. Ne yazık ki, cam slayt kesme ve mika ince dilim yapıştırma için gerekli olan el becerisi yüksek SLB hazırlanması için mika rutin kullanımı için bir engel oluşturur. Bu tercih edilen bir yöntem, bu tür hazır mika olmasına karşınyüzeyleri sık sık özellikle küçük çalışma mesafesi, yüksek sayısal diyafram lensler ile, düzensiz (dalgalı) ve görüntü zor olarak bitirmek. Burada vezikül lipid birikimi ve SLB hazırlanması için, ince, düz bir mika yüzeylerin hazırlanması için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunarlar. Ayrıca, bizim ölçüye oda SLB veziküller formasyonu için sadece çok küçük miktarlar gerektirir. AFM çalışmalarda kullanılan doğrudan karşılaştırılabilir olan yüksek kaliteli lipid iki katmanlı yüzeylerin, etkili, basit ve ucuz bir üretim genel prosedürü ile sonuçlanır.

Giriş

Mevcut protokolün genel amacı da atomik kuvvet ile kombine edilebilir optik toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) veya konfokal mikroskopi kullanılarak mika desteklenen lipit tabakalarının (SLBS) yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mika yüzeyleri hazırlamak için bir yöntem göstermektir mikroskobu (AFM).

SLBS lipid kümeleme, faz ayrılması, peptidler, proteinler veya diğer bileşikler ^1-5 ile iki tabakalı bileşenler veya bunların etkileşimleri ve dinamikleri çok sayıda çalışmalar için yaygın olarak kullanılan bir model vardır. Farklı alt tabakalar SLB oluşumu çalışmanın ^4,6-8 doğasına bağlı olarak, (örneğin, cam, mika, silikon dioksit, polimerler) için kullanılabilir. Tipik membran çalışmalar, TIRFM ve AFM gibi mikroskopi tabanlı görüntüleme teknikleri, güveniyor. Cam şeffaf olduğu için Böylece TIRFM görüntüleme için, bir cam yüzeyi, tipik bir seçimdir. Cam imalatı nispeten kolay ve sonuçların kalitesi öncelikleönce lipid veziküllerin çökeltilmesinden temizleme ayrıntılı yüzey tarafından belirlenir. Yüksek çözünürlük nedeniyle eksenel AFM mika yüzeyleri gerektirir. Mika mükemmel bazal bölünme yakın olan, bir silikat mineraldir. Böylece, taze yarılmış mika hatta alt-nanometre ölçeğinde ⁹ zar yükseklik farklarının gözlem sağlayan atomik düz.

Örneğin flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), izleme tek bir molekül (SMT) ve (sıkı bağlamak) ışıkla ağartma sonra floresan kurtarma gibi yöntemler kullanılarak difüzyon çalışmalar, lipid zarı dinamikleri tevdi hangi üzerine yüzey tipine, burada cam büyük ölçüde bağlıdır, ancak gösterdi ve mika yaygın olarak farklı sonuçlar ^10,11 verebilir. Bu farklılıklar membran sondaların difüzyon katsayıları, aynı zamanda farklı oranları ile difüzyon parçacıkların ayrı popülasyonlarının algılama ve muhtemelen farklı durumları arasında geçiş sadece içerir.

Bu durumda,Aynı yüzey (bu durumda mika) kullanılmadıkça TIRFM ve AFM teknikleri kullanılarak elde edilen sonuçların doğrudan bir karşılaştırma, genellikle sorunludur. TIRFM ve AFM bilayeri görüntüleme aynı mika yüzeye ^12,13 yürütülmüştür bazı çalışmalar olmasına karşın, mika nadiren çoğunlukla nedeniyle taşıma problemleri, optik mikroskopi için kullanılır. Mika hazırlık sonra optik yapıştırıcı ¹² kullanarak lamel yapıştırılmış ince broşürler, içine elle kesim gerektirir. Bu yöntem, bununla birlikte tatmin edici sonuçlar elde etmek için bazı pratik gerektirir. Dahası, elde yüzeyleri onları zor düşük çalışma mesafesi, yüksek sayısal diyafram lensler ile kullanmak için yapım, genellikle dalgalı ve kalın.

Bu protokolde tarif edildiği gibi hazırlanmıştır mika yüzeyler çok ince (170 um lamel kalınlığı dahil ~ 220 um) ve son derece düz, başarılı bir yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kritik olan "saç, dalgalı" önlenir. Bunlar kullanılabilirTIRFM veya konfokal kurulumları için. Ayrıca, aynı örnekler AFM transfer edilebilir ve hatta TIRFM / konfokal ve AFM ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Bu iki teknik birleştiren iki katmanlı zar yapısı ¹⁴ ile difüzyon davranışı doğrudan bir ilişki sağlar. Mika yüzeyleri taze yarılır, çünkü onlar temiz ve (cam temizleme protokollerinin genellikle Piranha çözüm, sülfürik asit, sodyum / potasyum hidroksit gibi kimyasallar dahil) zaman alıcı, kötü tekrarlanabilir, ve potansiyel olarak tehlikeli temizlik prosedürlerini gerekmez. De tarif edilen bir protokol küçük odası, montajı, en az 50 ul için etkili iki katmanlı oluşumu için gerekli veziküllerin hacmini azaltır. Son olarak, yüzey montaj tüm süreç zaman tüketen geleneksel mika bölünme ve tutkallama işlemi yaptığı gibi, (hazırlık az 30 dakika sürer), ve manuel beceri yüksek derecede gerektirmez değildir.

Protokol

1.. Mica ve Slaytlar Hazırlık

1. Sıra No: 1 ½ (0.17 mm) boyama rafa lamelleri.
2. 60 ° C'de% 2 deterjan içinde 30 dakika boyunca sonikasyon
3. Iyonu giderilmiş su ile 20 kez yıkanır.
4. Forseps kullanarak slaytları çıkarın ve sıkıştırılmış hava veya nitrojen kullanarak kuru darbe.
5. Mika levha makas veya jilet kullanarak 10 x 10 mm kare parçalar halinde kesilir.
6. Jilet kullanarak 2-3 ince broşürler halinde her mika parça kesin.
   NOT: Bu adım keskin bıçak kullanımını gerektirir.

2.. Mika Montaj ve Montaj Odası

1. Etanol ile temizleyin mikroskobik cam slayt.
2. Optik yapıştırıcı kullanılarak cam slayt adım 1.6 kesilmiş mika Tutkal broşür. Düşük viskoziteli yapıştırıcı iyi damla yaymak ve mika tutkal tavsiye edilir.
3. , UV lamba altında 10 dk Cure.
   Not: Yapışkan 380nm 350 aralığında maksimum emme ve requ önerilen enerji ile UV ışığı ile sertleştirilirTam tedavi için ired 4,5 J / cm ^{2 'dir.} Bununla birlikte, farklı ışık kaynakları (yapıştırıcı malzeme, satıcı tarafından sunulan bakınız) Bu adım için kullanılabilir.
4. Scotch bant ile ilk birkaç katmanları kaldırarak temiz bir mika yüzey Açığa.
5. Mika yüzeye optik yapıştırıcı küçük bir damla (~ 20 mikron) yerleştirin.
   NOT: Bu aşamada, düşük otofloresan düzeyi ile yüksek viskoziteli yapıştırıcı tavsiye edilir. Deneyimlerimiz düşük (adım 2.2) ve yüksek viskoziteli yapıştırıcı kombinasyonunu kullanarak mika bölme anlamlı etkinliği (adım 2.7) arttırdığını göstermiştir.
6. Yavaşça hava kabarcıkları kaçınarak, yapıştırıcı damla üzerine taze temizlenmiş lamel yerleştirin, 1 dakika razı olsun.
7. , UV lamba altında 10 dk Cure.
   NOT: Bu aşamadan sonra cam slayt, mika ve lamel sandviç (birkaç hafta kadar) bir zaman nispeten uzun bir süre boyunca saklanabilir. Mika yüzey taze olduğundan emin olmak için, sadece gerçek SLB öncesi hazırlık sonraki adıma geçin.
   NOTYapışkan 380nm 350 aralığında maksimum emme ve tam tedavisi için gerekli olan enerji ile önerilen UV ışığı ile sertleştirilir 4.5J/cm ^2'dir. Bununla birlikte, farklı ışık kaynakları (yapıştırıcı malzeme, satıcı tarafından sunulan bakınız) Bu adım için kullanılabilir.
8. Videoda gösterildiği gibi bir exacto bıçak kullanarak, hafifçe yan cam slayt lamel kaldırılıyor. Çoğu durumda, mika, ince ve düz bir tabaka lamel takılı kalır. (Adım 2.4 tekrarlayın) tekrar edilebilir Mika cam slayt bağlı.
9. Mika tabakası hala lamel yapıştırılmış ve adım 2.8 'yarma sırasında tamamen kaldırıldı değildi emin olmak için, çıplak gözle ya da mikroskop altında yüzey kalitesini kontrol edin. Bir forseps ile küçük bir çizik yapma veya iğne diseksiyon mika algılanabilir, farklı bir tutarlılık vardır yapıştırıcı ayırt yardımcı olacaktır.
10. 1.5 ml şişe kapağından lastik conta çıkarın ve optik kullanarak yüzeye ters kapağı tutkalyapışkan veya tırnak cilası, ve UV lamba ile tedavi veya hava sırasıyla, 10 dakika kurumasını bekleyin.
    NOT: örnek AFM görüntüleme ile eş zamanlı optik (TIRFM veya konfokal) için hazırlanmış ise, bir 1.5 ml şişe kapağı mikroskop sahnede AFM baş bağlamaya çok küçük olabilir. Bu durumda, kapak AFM başlığı monte etmek için uygun olan daha büyük bir çapa sahip herhangi bir plastik O-halka ile ikame edilmiş olabilir. Deney mika yüzeye zarar vermeden kapağı çıkarmadan gerektiren bir durumda, silikon yağ yerine, yapıştırıcı veya oje kullanılabilir.

3.. Desteklenen çift katlı lipid (SLB) Oluşumu

1. Yüzeyli odasına taze hazırlanmış lipozom solüsyonu yerleştirin. SLB oluşumu için gerekli olan minimum hacmi ~ 30 ul.
   NOT: lipozom ve SLB oluşumu hakkında daha fazla bilgi için, örneğin Çanta ark olarak yayınlanan protokolleri, bakınız, 2014 ^15...
2. İstenilen protokolü kullanılarak SLB oluşumu ile devam edin. İnkübasyon sırasında veGörüntüleme, odacık bir ısı-blok veya erime sıcaklığının üstünde kullanılan lipitleri tutmak için gerekli sıcaklığı sağlamak için ısıtıldı mikroskop aşamasında yerleştirilebilir.

Sonuçlar

SLBS floresan lipid sondaların difüzyon davranışı alt maddeye bağlı olarak farklıdır. SMT tekniği ile birleştirilmiş TIRFM parçacık hareketleri görselleştirme ve difüzyon katsayıları ayıklamak için değerli bir yöntemdir. Bir DOPC cam ve mika üzerinde desteklenen (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin) iki katmanlı olarak bir difüzyon Sfingomiyelin-ATTO647N prob tek molekül sinyalleri bağlı hareketli şekilde gösterilir. Burada yer yüzeyi mika edilen protokole göre hazırlandı. Op...

Tartışmalar

Bu protokol, lipid iki katmanlı birikimi ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için düz ve ince mika yüzeylerin hazırlanması için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu teknik, çok yüksek kalitede bir yüzey elde etmek için mika kritik olan cam mika cam sandviç (adım 2.8), dikkatli sökme sınırlı az manuel beceri gerektirir. Mika yaran olmadan optik yapıştırıcı ayırmak için mümkün olduğu Taze kırılmış mika Denetim zaman optik yapıştırıcı maruz kalan bölgeleri bırakarak, bu noktada g...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power