Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Resumo

Apresenta-se um método de preparação de mica suportado bicamadas lipídicas para microscopia de alta resolução. Mica é transparente e liso em uma escala atômica, mas raramente usado em imagiologia por causa de dificuldades de manuseio; a preparação resulta em deposição uniforme da folha de mica, e reduz o material usado na preparação de bicamada.

Resumo

Bicamadas lipídicas suportadas (EBSL) são amplamente utilizados como modelo para o estudo de propriedades da membrana (separação de fases, de agrupamento, dinâmica) e sua interação com outros compostos, tais como drogas ou peptídeos. No entanto características SLB diferente, dependendo do suporte utilizado.

Técnicas comumente usados ​​para imagens e medições SLB são microscopia única molécula de fluorescência, FCS e microscopia de força atômica (AFM). Como a maioria dos estudos de imagiologia óptica são realizadas sobre um suporte de vidro, enquanto que a AFM requer uma superfície extremamente lisa (geralmente mica), os resultados destas técnicas não podem ser directamente comparados, uma vez que as propriedades de carga e de suavidade destes materiais influenciam fortemente a difusão. Infelizmente, o nível elevado de destreza manual necessária para o corte e colagem de fatias finas de mica para a lâmina de vidro apresenta um obstáculo para a utilização de rotina de mica para a preparação SLB. Embora este seja o método de escolha, tal mica preparadasuperfícies muitas vezes acabam por ser irregular (ondulado) e difícil de imagem, especialmente com distância de trabalho pequeno, lentes de alta abertura numérica. Aqui apresentamos um método simples e reprodutível para preparar superfícies planas finas de mica para a deposição de vesícula lipídica e preparação SLB. Além disso, a nossa câmara personalizado feito requer apenas pequenas quantidades de vesículas para a formação SLB. Os resultados do procedimento geral para a produção eficiente, simples e barata de alta qualidade superfícies da bicamada lipídica, que são directamente comparáveis ​​com os utilizados em estudos de AFM.

Introdução

O objetivo geral do presente protocolo é mostrar um método para preparar superfícies de mica em alta resolução de imagem de mica suportada bicamadas lipídicas (EBSL) utilizando microscopia óptica de fluorescência total de reflexão interna (TIRFM) ou microscopia confocal, que também poderia ser combinada com a força atômica microscopia (AFM).

EBSL é um modelo amplamente usado para numerosos estudos de agrupamento lipídico, a separação de fases, a dinâmica de componentes de bicamada ou as suas interacções com peptídeos, proteínas ou outros compostos ^1-5. Substratos diferentes podem ser usadas para a formação de SLB (isto é, vidro, mica, dióxido de silício, polímeros), dependendo da natureza do estudo ^4,6-8. Estudos de membrana típicas contam com técnicas de imagem com base em microscopia, como TIRFM e AFM. Assim, para a imagiologia TIRFM, uma superfície de vidro é uma escolha típica porque o vidro é transparente. Preparação de vidro é relativamente fácil, e a qualidade dos resultados é primariamentedeterminada pela superfície limpeza completa antes da deposição de vesículas lipídicas. AFM, devido à sua alta resolução axial requer superfícies mica. Mica é um mineral de silicato, com cerca de clivagem basal perfeita. Assim, a mica recém clivada é atomicamente plana, permitindo a observação da membrana diferenças de altura, mesmo em escala sub-nanométrica ^9.

Estudos de difusão, utilizando métodos como a espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), seguindo molécula única (SMT), e recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) mostrou no entanto, que a dinâmica da membrana lipídica depender muito do tipo de superfície sobre a qual são depositados, em que vidro mica e pode dar resultados muito diferentes ^10,11. Estas diferenças incluem não apenas os coeficientes de difusão das sondas de membrana, mas também a detecção de populações distintas de partículas que difundem a taxas diferentes, e, possivelmente, a comutação entre os diferentes estados.

Assim,a comparação directa dos resultados obtidos utilizando técnicas de TIRFM e AFM é muitas vezes problemática, a menos que a mesma superfície (neste caso, a mica) é usado. Embora existam alguns estudos onde TIRFM e AFM bicamada de imagem foi realizado na mesma superfície mica ^12,13, mica é raramente usado para a microscopia óptica, principalmente por causa de problemas de manuseio. Preparação mica requer corte à mão em folhetos finos, que são então coladas à lamela utilizando adesiva óptica ^12. Este método, porém, requer um pouco de prática para alcançar resultados satisfatórios. Além disso, as superfícies obtidas são muitas vezes ondulado e grosso, tornando-os difíceis de usar com baixa distância de trabalho, lentes de alta abertura numérica.

Mica superfícies preparadas como descrito no presente protocolo são muito finas (~ 220 mM, incluindo a espessura da lamela de 170 um) e extremamente lisa, evitando "ondulação", o qual é crítico para uma imagem com alta resolução. Eles podem ser utilizadospara TIRFM ou confocal setups. Além disso, as mesmas amostras podem ser transferidos para a AFM, e ainda visualizados simultaneamente com TIRFM / confocal e AFM. A combinação destas duas técnicas permite correlação direta do comportamento de difusão com a estrutura da membrana de bicamada ^14. Como as superfícies de mica são recém-clivada, são limpos e não necessitam de demorado, pouco reprodutível, e procedimentos de limpeza potencialmente perigosas (protocolos de limpeza de vidro geralmente incluem produtos químicos como solução Piranha, ácido sulfúrico, hidróxido de sódio / potássio). Montagem de uma pequena câmara, também descrito no protocolo, reduz o volume de vesículas necessários para a formação de bicamada eficaz para menos de 50 ul. Finalmente, todo o processo de montagem de superfície não é demorado (preparação leva menos do que 30 min), e não requerem um elevado grau de habilidade manual, tal como a clivagem de mica convencional e colagem.

Protocolo

1. Mica e Slides Preparação

1. Lugar No. 1 ½ (0,17 mm) em lamelas suporte de coloração.
2. Sonicar durante 30 min em 2% de detergente a 60 ° C.
3. Lave 20 vezes com água deionizada.
4. Retirar as lâminas usando uma pinça e secar com ar comprimido ou nitrogênio.
5. Corte folha mica em 10 x 10 mm pedaços quadrados usando uma tesoura ou lâmina de barbear.
6. Corte cada pedaço mica em 2-3 folhetos finas utilizando lâmina de barbear.
   NOTA: Esta etapa exige o uso de lâmina afiada.

2. Assembléia Mica e da Câmara de montagem

1. Limpe lâmina de vidro microscópicas com etanol.
2. Glue folheto de mica cortado no passo 1.6 a lâmina de vidro com adesivo óptico. Adesivo de baixa viscosidade é aconselhável para melhor difundir a queda e cole a mica.
3. Cure sob a lâmpada UV, 10 min.
   NOTA: O adesivo é curado por luz UV com uma absorção máxima na gama de 350 a 380nm e a energia recomendado required para cura total é de 4,5 J / cm ^2. No entanto, as diferentes fontes de luz pode ser utilizado para este passo (ver materiais fornecidos pelo fornecedor de adesivo).
4. Expor uma superfície mica limpo, eliminando as primeiras camadas com fita adesiva.
5. Coloque uma pequena gota (~ 20 mM) de adesivo óptico sobre a superfície da mica.
   NOTA: Nesta etapa, adesivo de alta viscosidade, com baixo nível de autofluorescência é aconselhada. Nossa experiência mostrou que o uso de combinação de baixo (passo 2.2) e adesivos de alta viscosidade aumenta significativamente a eficácia da divisão mica (passo 2.7).
6. Delicadamente, coloque lamela limpo de fresco para a gota de cola, evitando bolhas de ar, vamos contentar com 1 min.
7. Cure sob a lâmpada UV, 10 min.
   NOTA: após esta etapa, a sanduíche da lâmina de vidro, mica e lamela pode ser armazenado por um período relativamente longo de tempo (até algumas semanas). Vá para a próxima etapa, pouco antes da preparação real SLB, para certificar-se da superfície da mica é fresco.
   NOTA: O adesivo é curado por luz UV com uma absorção máxima na gama de 350 a 380nm e a energia necessária para recomendada a cura completa é 4.5J/cm ^2. No entanto, as diferentes fontes de luz pode ser utilizado para este passo (ver materiais fornecidos pelo fornecedor de adesivo).
8. Usando um estilete, desmontar cuidadosamente a lamela de lâmina de vidro lateral, como mostrado no vídeo. Na maioria dos casos, uma camada fina e plana de mica permanecerá ligado à lamela. Mica ligado a lâmina de vidro podem ser reutilizados (repita a partir do passo 2.4).
9. Verificar a qualidade da superfície ao olho nu ou sob um microscópio de dissecação, a certificar-se de que a camada de mica ainda está colada à lamela e não foi completamente removido durante a cisão no passo 2.8. Fazendo um pequeno arranhão com uma pinça ou agulha de dissecação ajudará a distinguir entre o adesivo que tem uma consistência diferente detectável a partir de mica.
10. Remova a vedação de borracha a partir de um frasco de tampa de 1,5 ml e cola a tampa de cabeça para baixo para a superfície, usando ópticaadesiva ou unha polonês, e curar com lâmpada UV, ou deixar que o ar seco 10 min, respectivamente.
    NOTA: Se a amostra é preparada para simultânea óptico (TIRFM ou confocal) com imagens de AFM, um ml frasco cap 1.5 pode ser muito pequeno para montar a cabeça AFM no palco microscópio. Nesse caso, o tampão pode ser substituído por qualquer plástico junta tórica com um diâmetro maior, adequado para a montagem de cabeça de AFM. No caso, quando o experimento requer remoção da tampa, sem danificar a superfície de mica, graxa de silicone pode ser usado em vez de cola ou unha polonês.

3. Formação Apoiado Lipid Bilayer (SLB)

1. Coloque solução de lipossomas preparados na hora na câmara com a superfície. O volume mínimo necessário para a formação de SLB é ~ 30 ul.
   NOTA: Para obter mais detalhes sobre o lipossoma e formação SLB, referem-se a protocolos publicados, tais como tais como Bolsa et al, 2014 ^15..
2. Prossiga com formação SLB usando o protocolo desejado. Durante a incubação eimagiologia, a câmara pode ser colocada num bloco de calor ou fase de microscópio aquecida para manter a temperatura necessária para manter os lípidos sendo utilizadas acima da sua temperatura de fusão.

Resultados

O comportamento de difusão de sondas fluorescentes lipídicas em EBSL é diferente, dependendo do substrato. TIRFM combinada com a técnica SMT é um método valioso para a visualização de movimentos de partículas e extrair os seus coeficientes de difusão. Sinais de moléculas isoladas de uma sonda de esfingomielina-ATTO647N difusão numa DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) em bicamada suportada em vidro e de mica são mostrados na figura animada em anexo. A superfície de mica foi preparado de ac...

Discussão

Este protocolo descreve um método para a preparação de superfícies lisas e de mica fina para deposição de bicamada lipídica e de alta resolução de imagem. A técnica requer habilidades manuais mínimos, limitado principalmente para a desmontagem cuidadosa do sanduíche vidro-mica-vidro (passo 2.8), que é fundamental para a obtenção de uma superfície de mica de alta qualidade. A inspecção da mica clivada de fresco é sempre necessário, neste ponto, uma vez que é possível para a mica de separar da subst?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power