Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Özet

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Özet

Protein-protein etkileşimleri, organizmanın canlı hücresi ve kontrol homeostazında işlemlerinin çoğunun aracılık eder. Engelliler protein etkileşimleri protein etkileşimlerini önemli ilaç hedeflerini, yapım hastalığına neden olabilir. Bu, moleküler seviyede, bu etkileşimleri anlamak için bu nedenle çok önemlidir. Protein etkileşimleri, hücresel ve biyokimyasal tahlilleri kantitatif biyofiziksel deneylerinde değişen çeşitli teknikler kullanılarak incelenmiştir ve bu protein alanları ile ya da peptidler ile, tam uzunlukta proteinler ile gerçekleştirilebilir. Peptitler peptitler kolaylıkla sentez edilebilir çünkü protein etkileşimleri çalışma ve belirli etkileşim siteleri odaklanarak izin olarak mükemmel araçlar hizmet vermektedir. Peptid dizileri tedavi amacıyla hedef proteini bağlanan peptidleri, iki protein arasındaki etkileşim bölgeleri tespitine olarak elenmesini sağlamak. Onlar da yüksek kapasiteli SAR çalışmaları sağlar. Bağlanma yerleri, bir tipik ola tanımlanması içinCal peptid dizisi genellikle, kısmen istenilen hedef proteinin bir veya daha fazla ortak proteinlerin tam dizilerinden türetilen 10-20 kalıntıları çakışan peptidler içerir. Hedef bağlama proteini için bir dizi tarama proteinin sadece az miktarda kullanarak kolay ve hızlı bir yöntem ortak proteinlerin bağlanma bölgeleri, karşılık gelen bağlanan peptitleri göstermektedir.

Bu yazıda, bir hedef protein ve ortakları arasındaki etkileşim siteleri haritalanması için peptid dizileri taranması için bir protokol açıklar. Peptid dizisi hesaba kendi ikincil yapılar alan ortak proteinlerin dizileri temel alınarak tasarlanmıştır. Bu protokolde kullanılan diziler INTAVIS Biyoanalitik Instruments tarafından hazırlanan Celluspots diziler vardı. Dizi özgül olmayan bağlanma ve üzerinde çalışılan protein ile kuluçkaya önlemek için bloke edilir. Bir antikor kullanılarak saptanması, proteinler arasındaki özel etkileşim sahalarına karşılık gelen bağlanan peptitleri göstermektedir.

Giriş

Protein-protein etkileşimleri canlı hücrenin içinde işlemlerinin çoğunun aracılık eder. Engelliler protein etkileşimleri protein etkileşimlerini önemli ilaç hedeflerini, yapım hastalığına neden olabilir. Bu, moleküler seviyede, bu etkileşimleri anlamak için bu nedenle çok önemlidir. Protein etkileşimleri, hücresel ve biyokimyasal tahlilleri kantitatif biyofiziksel deneylerinde değişen çeşitli teknikler kullanılarak incelenmiştir ve bu protein alanları ile ya da peptidler ile, tam uzunlukta proteinler ile gerçekleştirilebilir. Peptidler protein etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlar hizmet vermektedir. Peptidler kolayca sentezlenebilen ve bir taraftan ve diğer taraftan ^1,2 üzerinde yüksek verimli bir şekilde birden fazla protein hedefleri üzerinde belirli bir etkileşim sitesi odaklanarak izin edilebilir olmasıdır. Peptid dizisi tarama bir hızlı, kısa bir süre ³ çok sayıda ortakları ile bir hedef protein etkileşimleri ile ilgili verilerin büyük miktarda elde edilmesi için bir metodu gerçekleştirmek için kullanımı kolay. Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve analiz etmek için diğer biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemlerden farklı olarak, peptid dizi tarama protein çok düşük bir konsantrasyonu gerektirir ve nihai çok zayıf algılayabilir. Peptid dizileri enzim aktivitelerini ⁶ ve yüksek verim inceleyerek, protein-protein ya da reseptör-ligand etkileşim bölgeleri ^4, homo veya hetero-oligomerizasyon arayüzleri eşleme gibi peptid-protein etkileşimleri birçok uygulama için karakterize edici antikorlar ⁵ epitoplar kullanılabilir Yapısal aktivite ilişkisi (SAR) ⁷ inceler. Peptit dizisi tarama hakkında derinlemesine bir inceleme için Katz ve arkadaşları bkz. ⁴

Peptid dizilerin çeşitli tipleri şu anda mevcuttur. Peptidlerin sentezi esas olarak spot tekniği ^4,8 kullanarak, doğrudan katı destek üzerindeki peptit, katı destek veya sentezine tutturulmadan önce: peptid dizilerini hazırlamak için, iki büyük sentetik stratejiler vardır.peptidler, 9-florenilmetiloksikarbonil (FMOC) ^8, genellikle katı bir destek üzerinde sentezlenir. Yaygın sentetik şemalarda arasında Cı ucu yoluyla peptid N ucu yoluyla bağlantı (ör JPT pepstar dizileri ⁹⁾ ve peptit bağlanma (örneğin, PepScan pepchip dizileri ^10, JPT pepspot diziler ⁹ ve INTAVIS celluspot dizileri ^{11) 4.} Katı destek değişir ve böylece kendisine peptit bağlama kimyasını neden olmamaktadır. Cys-sonlu peptidler tiol grubu ¹² ile cam slaytlar bağlı olabilir. Bir peptidin N sonu bir birlik oluşturacak amino asidin esterifikasyonu yoluyla selüloz zar üzerinde bir hidroksil grubuna bağlı olabilir ⁸ eklenmiş.

Burada, protein-protein etkileşimlerini incelemek için olan bir yöntem olarak peptid dizileri taranması için ayrıntılı bir protokol sunmaktır. Biz kullanılan dizi büyük amo içeren bir mikro-dizi Celluspots dizidirBir cam slayt tarafından desteklenen küçük bir selüloz zarı üzerine noktalar (384 noktalar çiftleri) ve unt. Bu düşük protein hacmi ve antikorlar ile çalışan ve tek bir deneyde başına veri önemli miktarda elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Bu dizi aynı zamanda düşük bağlanma afinite algılanmasını sağlayan yüksek peptid yoğunluğu içerir. Dizi, normal hücre çoğalması ¹³ kontrol etmek için son derece önemli olan Stil-CHFR etkileşim haritalama için kullanılmıştır. İki protein arasındaki Kontrolsüz etkileşim kanser gelişimine yol açabilir. Bu etkileşimi haritalama biz spesifik bağlanma yeri ve artıklarını ¹⁴ bağlayıcı bulundu. Bu, protein-protein etkileşimini inhibe rasyonel inhibitörleri tasarımı için önünü açıyor.

Protokol

1. Peptid dizisi Tasarımı

1. Kısmen, 10-20 kalıntıları çakışan peptidler halinde hedef proteinin dizisini bölün. Belirli bir deney üzerinde örtüşme miktarı ve performans laboratuar kaynakları, ancak ilke olarak uzun örtüşme iyi Vary. Peptidler etkileşiminden sorumlu olabilir protein hesap bilinen ikincil yapı elemanları içine alır tasarımı.
2. Ticari satıcıları aracılığıyla tasarlanmış peptid dizisi sipariş. Burada kullanımı peptidler kovalent olarak C-terminali dizi haline bağlandı.

Cilt 2. Engelleme Non-spesifik

1. % 0.05 Tween 20 (TBST / PBST) içeren bir 50 mM Tris veya fosfat tampon çözeltisi oluşturunuz ve (tam iyonik kuvvet öğrenmek amacıyla) HCI veya NaOH, ölçülü bir miktarı ve NaCl ile arzu edilen iyonik gücü ile istenen pH değerine ayarlamak . Burada, 7.5 bir pH değerine ve 150 mM arasında bir iyonik gücünü kullanır.
2. Bir bloke edici çözelti yapmak% 2.5 (ağırlık / hacim) TBST / PBST içinde yağsız süt tozu.
3. Spesifik olmayan bağlanma, önlemek için, bloke etme çözeltisi 5 ml dizi bırakın. 2-4 saat oda sıcaklığında karıştırıldı ve gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de için dizi inkübe edin.

3. protein ile kuluçkalanarak

1. Oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca 5 ml TBST'ye / PBST ile iki kez, daha sonra 30 saniye için çözüm engelleme ve 5 ml ilk dizi yıkayın.
2. (Ağırlık / hacim), spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için kaymağı alınmış süt tozu% 2.5 ihtiva eden His-takılı protein çözeltisinin 5 ml'si ile yıkanmıştır dizi inkübe edin. Burada tarif edilen bloke çözeltisi içinde çözülmüş protein çözeltisinin 4.5 uM (Stil 500-650) kullanın.
   Not: Genellikle 5-10 uM proteininin taranması için kullanılır, ancak protein konsantrasyonu, bağlama eğilimi ve yerel dizi bağlanmış peptidlerin konsantrasyonları (etkinliğine bağlı olarak, daha düşük 2-3 uM olabilir sentezi). Tampon hangi proteinin,değişebilir çözündürüldü, ancak yukarıda tarif edilen engelleme çözeltisi kullanılarak protein seyreltilmesi yaygın olan bir virüstür.
3. Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de 3-8 saat için protein çözeltisi içinde dizi inkübe edin.

4. antikorla enkübe

1. 5 ml TBST'dir / PBST'yle dizi üç kez yıkayın. Birinci yıkama, oda sıcaklığında bir karıştırıcı üzerinde iki adet 5 dakikalık yıkama ve ardından 30 saniye içindir.
2. Oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat süre ile, bloklama çözeltisi olarak aynı konsantrasyonlarda ile aynı katkı maddeleri ihtiva eden bir kültür ortamı tamponunda: seyreltilmiş HRP ile konjüge edilmiş antikor, 5 ml (1.500 1) ile yıkandı, dizi inkübe edin. Antikor, hedef proteini ya da etiketi ya da bağlanabilmektedir.
3. Ste olmadan aynı protokol tekrarlayarak dizi hedef proteinin (örneğin, oligomerizasyonu çalışmaları) peptidler ihtiva ettiği takdirde, dizideki peptidler ile antikorun etkileşimi test kontrol deneyleri gerçekleştirmekp = 3, bir protein ile kuluçkalanarak.
4. 5 ml TBST'dir / PBST'yle dizi üç kez yıkayın. Birinci yıkama, oda sıcaklığında bir karıştırıcı üzerinde iki adet 5 dakikalık yıkama ve ardından 30 saniye içindir.

5. Array Okuma

1. Bir ECL batı lekeleme substrat kiti ile bir kemiluminesens geliştirme yürütmek.
2. Bir parlak görüntü analiz cihazı ile algılamayı gerçekleştirin.
3. Sonuçlarını analiz. Dizi hem çiftleri aynı sinyalleri gösterir, bu yüzden sonuçların güvenilir olduğundan emin olun. Protein ortağının yapısı eğer biliniyorsa, bağlama peptidleri için yapısına arama ve bağlanma siteleri için bir nokta. Sekansında uzakta bile peptidler üçüncül yapı birbirine yakın olacak ve bağlama sahası oluşturabilir.

Sonuçlar

Stil, çok önemli centrosomal proteindir. ^{19 -} Normal hücre bölünmesi ve hücre proliferasyonu ^13,15 denetler. STİL çeşitli proteinlerin ^18,20,21 ile etkileşime girer ve bu etkileşimlerin en doğası gereği düzensiz bölgesi (IDR) ^14, merkezi bölümü aracılığıyla meydana gelir. Biz STİL bağlayıcı protein CHFR türetilen peptidlerin oluşan bir dizi tasarlanmıştır. CHFR stres ²² mitotik yanıt olarak oluşturulan bir tümör bastırıcıdır. ...

Tartışmalar

Peptid dizisi tarama ortaklarının bir hedef proteinin bağlanma mevkilerinin belirlenmesi için mükemmel bir araçtır. Bu testin gerçekleştirilmesi için, hızlı ve kolay ve sonuçlar, bir veya iki gün içinde elde edilebilir. Peptid dizisi tarama çok yönlüdür ve birçok amaç için kullanılabilir. Bu fosforilasyon gibi post çeviri modifikasyonlar tanımlanması ve kinazların alt tabakaların tanımlanması için de kullanılabilir. Örneğin: miyeloid lösemi, akut ilgilidir FLT3 kinaz, bir peptit dizisi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptide array	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Antibody (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Biological industries	20-500-120
Skim Milk	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	FUJI film