Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Riepilogo

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Abstract

Le interazioni proteina-proteina mediano maggior parte dei processi nella cellula e soggiorno di controllo omeostasi dell'organismo. Proteina deteriorate possono provocare malattie, rendendo le interazioni proteina importanti bersagli farmacologici. È quindi estremamente importante capire queste interazioni a livello molecolare. Interazioni proteine ​​sono studiate utilizzando una varietà di tecniche che vanno da saggi cellulari e biochimici per saggi biofisici quantitative, e questi possono essere eseguite sia con proteine ​​integrali, con domini proteici o peptidi. Peptidi servono come ottimi strumenti per studiare le interazioni proteina da peptidi possono essere facilmente sintetizzati e consentire la messa a fuoco su siti specifici di interazione. Array peptidici permettono l'identificazione dei siti di interazione tra due proteine ​​così come screening per peptidi che si legano alla proteina bersaglio per scopi terapeutici. Essi consentono inoltre ad alto rendimento studi SAR. Per l'identificazione di siti di legame, un Typimatrice peptide cal solito contiene parzialmente sovrapposte 10-20 residui peptidi derivati ​​dalle sequenze complete di una o più proteine ​​partner della proteina bersaglio desiderato. Screening matrice per legare la proteina bersaglio rivela i peptidi leganti, corrispondenti ai siti di legame delle proteine ​​partner, in un modo semplice e veloce utilizzando solo piccole quantità di proteine.

In questo articolo si descrive un protocollo per lo screening array di peptidi per la mappatura dei siti di interazione tra una proteina bersaglio e dei suoi partner. L'array peptide è stato progettato sulla base delle sequenze delle proteine ​​partner, tenendo conto delle loro strutture secondarie. Gli array utilizzati in questo protocollo sono stati Celluspots array preparati da INTAVIS bioanalitici Instruments. L'array è bloccato per impedire il legame aspecifico e quindi incubate con la proteina studiata. Rilevamento utilizzando un anticorpo rivela i peptidi di legame corrispondenti ai siti specifici di interazione tra le proteine.

Introduzione

Le interazioni proteina-proteina mediano maggior parte dei processi nella cellula vivente. Proteina deteriorate possono provocare malattie, rendendo le interazioni proteina importanti bersagli farmacologici. È quindi estremamente importante capire queste interazioni a livello molecolare. Interazioni proteine ​​sono studiate utilizzando una varietà di tecniche che vanno da saggi cellulari e biochimici per saggi biofisici quantitative, e questi possono essere eseguite sia con proteine ​​integrali, con domini proteici o peptidi. Peptidi servono come ottimi strumenti per studiare le interazioni delle proteine. Questo perché i peptidi possono essere facilmente sintetizzati e consentono la messa a fuoco su un sito di interazione specifica su un lato e più bersagli proteici in maniera elevata produttività dall'altro ^1,2 mano. Proiezione matrice Peptide è un veloce, facile da eseguire metodo per ottenere una grande quantità di dati sulle interazioni di una proteina bersaglio con numerosi partner in breve tempo ³. A differenza di altri metodi biochimici o biofisici per la rilevazione e l'analisi di interazioni proteina-proteina, lo screening matrice peptide richiede una concentrazione molto bassa di proteine ​​e può rilevare molto debole legame. Array di peptidi possono essere utilizzati per molte applicazioni nelle interazioni peptide-proteina come la mappatura della proteina-proteina o recettore-ligando siti di interazione ^4, interfacce omo- o etero-oligomerizzazione, anticorpi che caratterizzano epitopi ^5, studiando attività enzimatiche ⁶ e throughput elevato struttura- rapporto di attività (SAR) studia ^7. Per un esame approfondito circa lo screening gamma peptide vedere Katz et al. ⁴

Attualmente esistono diversi tipi di matrici di peptidi. Ci sono due principali strategie sintetiche per la preparazione di matrici peptide: sintesi dei peptidi prima di essere esposti al supporto solido, o per la sintesi di peptidi direttamente sul supporto solido, principalmente con la tecnica SPOT ^4,8. Lapeptidi sono sintetizzati sul supporto solido solito da 9-fluorenilmetilossicarbonil (Fmoc) chimica ^8. Tra gli schemi sintetici comuni sono allegati peptide attraverso il terminale N (ad esempio, JPT array pepstar ⁹⁾ e l'attaccamento peptide attraverso il terminale C (ad esempio, PEPSCAN array pepchip ^10, JPT array pepspot ⁹ e INTAVIS array celluspot ^{11) 4.} Il supporto solido può variare e così fa la chimica dell'accoppiamento peptide ad esso. Peptidi Cys-terminati possono essere allegati ai vetrini tramite il gruppo tiolo ^12. Il terminale N di un peptide può essere legato covalentemente ad un gruppo ossidrile sulla membrana di cellulosa attraverso esterificazione degli aminoacidi allegato ^8.

Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening array di peptidi come metodo per lo studio delle interazioni proteina-proteina. L'array che abbiamo usato è l'array Celluspots, che è un micro-array che contiene grandi amount di macchie (duplicati fino a 384 punti) su una piccola membrana di cellulosa supportati da un vetrino. In questo modo si lavora con bassi volumi di proteine ​​e anticorpi e di ottenere significative quantità di dati per ogni singolo esperimento. Questa matrice contiene anche ad alta densità peptide che permette la rilevazione di bassa affinità di legame. L'array è stato utilizzato per mappare l'interazione STIL-CHFR, che è molto importante per il controllo della proliferazione delle cellule normali ^13. Interazione incontrollata tra le due proteine ​​può portare allo sviluppo del cancro. Con la mappatura questa interazione abbiamo trovato il sito di legame specifico e residui ¹⁴ vincolanti. Questo spiana la strada per la progettazione di inibitori razionali che inibiscono questa interazione proteina-proteina.

Protocollo

1. Progettazione di un array di peptidi

1. Dividere la sequenza della proteina bersaglio in parte si sovrappongono 10-20 residui peptidi. Variare la quantità di sovrapposizione sulla esperimento specifico e le risorse del laboratorio esecuzione, ma in linea di principio più lunga è la sovrapposizione meglio. Nel progettare i peptidi tengono conto noto elementi della struttura secondaria della proteina che può essere responsabile per l'interazione.
2. Ordinare l'array peptide progettato presso i rivenditori commerciali. Qui, uso peptidi legati covalentemente alla matrice attraverso il C-terminale.

2. Blocco legame non specifico

1. Effettuare una soluzione tampone Tris 50 mM o fosfato contenente 0,05% di Tween 20 (TBST / PBST) e regolare il pH desiderato con una quantità misurata di HCl o NaOH (per conoscere la forza ionica precisi) e la forza ionica desiderato con NaCl . Qui, utilizzare un pH di 7,5 ed una forza ionica di 150 mM.
2. Fare una soluzione di saturazione di2,5% (w / v) di latte scremato in polvere in TBST / PBST.
3. Per prevenire il legame non specifico, immergere la matrice in 5 ml di soluzione bloccante. Incubare la matrice per 2-4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C su un agitatore.

3. Incubare con la proteina

1. Lavare la matrice prima con 5 ml di soluzione di blocco per 30 sec e poi due volte con 5 ml di TBST / PBST per 5 minuti su un agitatore a temperatura ambiente.
2. Incubare la matrice lavato con 5 ml di His-tag soluzione proteica contenente 2,5% (w / v) di latte scremato in polvere per impedire legame non specifico. Qui, utilizzare 4,5 mM di soluzione proteica (STIL 500-650) disciolto nella soluzione di blocco descritto.
   NOTA: Generalmente 5-10 mM proteine ​​sono utilizzati per lo screening, ma la concentrazione di proteina può essere ancora a partire da 2-3 micron, a seconda della affinità di legame e le concentrazioni locali di peptidi che delimitano sulla matrice (efficienza del sintesi). Il buffer in cui la proteinaviene disciolto può variare ma è comune per diluire la proteina utilizzando la stessa soluzione di saturazione sopra descritto.
3. Incubare la matrice nella soluzione proteica per 3-8 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.

4. Incubare con l'anticorpo

1. Lavare l'array tre volte con 5 ml di TBST / PBST. Il primo lavaggio è di 30 secondi seguito da due lavaggi 5 min su agitatore a temperatura ambiente.
2. Incubare la matrice lavato con 5 ml di anticorpo HRP-coniugato diluito (1: 1.500) in un tampone di incubazione che contiene gli stessi ingredienti alle stesse concentrazioni come la soluzione di saturazione, per 1 ora su un agitatore a temperatura ambiente. L'anticorpo può legarsi sia alla proteina bersaglio o il tag.
3. Eseguire esperimenti di controllo testare l'interazione dell'anticorpo con peptidi sull'array, specialmente se l'array contiene peptidi dalla proteina bersaglio (ad esempio, per oligomerizzazione studi) ripetendo lo stesso protocollo senza step 3, incubando con la proteina.
4. Lavare l'array tre volte con 5 ml di TBST / PBST. Il primo lavaggio è di 30 secondi seguito da due lavaggi 5 min su agitatore a temperatura ambiente.

5. Lettura del Array

1. Effettuare sviluppo chemiluminescenza con un kit di substrato western blotting ECL.
2. Eseguire il rilevamento con un analizzatore di immagini luminescenti.
3. Analizzare i risultati. Assicurarsi che entrambi i duplicati su matrice mostrano gli stessi segnali, quindi i risultati sono affidabili. Se la struttura del partner proteina è noto, la ricerca sulla struttura dei peptidi leganti e cercare i siti di legame. Anche i peptidi che sono molto nella sequenza possono essere vicini nella struttura terziaria e creare un sito di legame.

Risultati

STIL è una proteina molto importante centrosomica. Controlla normale divisione cellulare e la proliferazione delle cellule ^{13,15 - 19.} STIL interagisce con numerose proteine ^{​​18,20,21,} e la maggior parte delle interazioni si verificano attraverso la sua parte centrale, che è una regione intrinsecamente disordinati (IDR) ^14. Abbiamo progettato un array costituito da peptidi derivati ​​dalla proteina legante STIL CHFR. CHFR è un soppressore del tumore che è indotta in risposta...

Discussione

Lo screening matrice Peptide è un ottimo strumento per identificare i siti di legame di una proteina bersaglio nei suoi partner. Questo test è veloce e facile da eseguire e il risultato può essere ottenuto in uno o due giorni lavorativi. Proiezione matrice Peptide è versatile e può essere utilizzato per vari scopi. Può essere usato per caratterizzare modifiche Traduzione successive come fosforilazione e identificare substrati di chinasi. Ad esempio: la chinasi FLT3, che è legato alla leucemia mieloide acuta, fosf...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptide array	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Antibody (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Biological industries	20-500-120
Skim Milk	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	FUJI film