JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Özet

Inme deneysel hayvan modelleri inme patoloji anlamak ve daha etkin tedavi stratejileri geliştirmek için paha biçilmez araçlardır. Tekrarlayan hipoksik önkoşullama (TÜSP) A 2 hafta protokol fokal iskemik inme bir fare modelinde merkezi sinir sistemi (MSS) yaralanmalara karşı uzun süreli koruma uyarır. ÜSP hem süresi (2 ya da 4 saat) ve yoğunluğu (% 8 ve% 11 O2) değişir hipoksiye 9 stokastik maruz oluşur. ÜSP endojen bir merkezi sinir sistemi koruyucu fenotipin uzun süreli indükleme gösteren, infarkt hacmi, kan-beyin bariyeri (BBB) ​​kesintileri ve hipoksi son maruz kaldıktan sonra hafta inme sonrası inflamatuar yanıtı azalır. infarkt hacmi BBB bozulması çift ölçümü için yöntem ÜSP ya da diğer olası nöro-koruyucu olan farelerde nörovasküler koruma değerlendirilmesinde etkindir. Yetişkin erkek Swiss Webster fareleri% 21 O kadar ÜSP veya süresi eşdeğer maruz kalma tarafından öngörülmekte edildi (yani oda havası). 60 dk geçici orta serebral arter tıkanıklığı (tMCAo) Son hipoksik maruziyet aşağıdaki 2 hafta oluşturuldu. Oklüzyon ve reperfüzyon Hem transkraniyal lazer Doppler flowmetre ile doğrulanmıştır. Reperfüzyondan sonra yirmi iki saat Evans Mavi (EB) damardan, bir kuyruk damarından enjeksiyon yoluyla uygulanmıştır. 2 saat sonra, hayvanlar izofluran doz aşımı ve beyin kesitleri ile kurban edilmiş 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyandı. İnfarktlar hacimleri daha sonra sayıldı. Daha sonra, EB tMCAo sonra BBB bozulma belirlemek için 48 saat boyunca dokusundan ekstre edilmiştir. Özet olarak, ÜSP diğer merkezi sinir sistemi tabanlı ve sistemik pro-enflamatuar hastalık durumları için translasyon potansiyeli olan farelerde, felç yaralanması uzun vadeli endojen nörovasküler koruma indükleme, minimum maliyet, çoğaltılmış basit bir protokoldür.

Giriş

Yetişkin sakatlık ve ölüm dördüncü önde gelen nedeni önde gelen nedeni olarak, inme ABD yetişkin nüfusun karşı karşıya olduğu en zayıflatıcı hastalık devletlerinden biridir. Inme 1 hayvan modelleri iskemik yaralanma azaltarak yeni yöntemler ve deneysel araştırma için izin İnme sonrası kurtarma iyileştirilmesi. Böyle translasyonel araştırma için bir yeni cadde ön hazırlık olduğunu. Önkoşullanma takip eden ve daha ciddi yaralanma zararı azaltmak için olmayan bir zarar uyaran kasıtlı kullanımıdır. 2 Hipoksik önkoşullanma in vivo ve in vitro çalışmalar, hem de vuruş karşı koruma sağlayan beyinde pleiotropik değişikliklere gösterilmiştir . 3 Bununla birlikte, hipoksi bir tek maruziyet sadece erişkin farelerde iskemiye karşı toleransı az 72 saat uyaran, kısa vadeli nöro sunmaktadır. Lin ve ark hipobarik hipoksi 14 saat, günlük risklerin 4 Hatta dört hafta sonra. found o nöro sadece bir hafta. 5 Tekrarlanan hipoksik önkoşullama (TÜSP) için devam etti sıklığı, süresi ve hipoksik risklerin yoğunluk stokastik varyasyonlar ile karakterizedir. Tek bir önkoşullanma meydan aksine, TÜSP farelerde sekiz hafta kadar süren bir serebroprotektiftir fenotip oluşturmakta. 6 RHP son hipoksi maruz kaldıktan sonra hafta boyunca enfarktüs hacimleri, kan-beyin bariyeri (KBB) bozulması, damar iltihabı ve lökosit ROS azaltılmış . ÜSP özellikle işemik hemisferde B hücresi popülasyonlarının korurken, T hücresi, monosit ve makrofaj popülasyonlarının düşürülmesinde iskemik beyin iltihabı, indirgenmiş. 7 Aslında, ÜSP felç dahil olmak üzere, herhangi bir merkezi sinir sistemi hasarı önce farelerde bir bağışıklık bastırıcı fenotipi neden olmuştur. ÜSP ile tedavi edilen sağlıklı farelerden izole ÜSP ile muamele edilmiş B hücreleri, antijen sunumu ve antikor üretimi hem de bir baskılanması ile, özel bir anti-inflamatuar bir fenotip sergilemiştir.pro-enflamatuar adaptif immün mekanizmaları genel azalma sadece merkezi sinir sistemi özgü enflamatuar hastalıklar için endojen bağışıklık indükleme ÜSP mükemmel bir yöntem sağlar, aynı zamanda, bir ön-iltihabik nedenleri mevcuttur sistemik yaralanma ya da hastalık modelleri.

TÜSP geçici orta serebral arter tıkanıklığı (tMCAo) Aşağıdaki infarkt hacmi ve BBB bozulma azaltır. Gibi yaygın olarak kullanılan tMCAo inme hayvan modelleri, çarpıcı bir şekilde inme olduğunun anlaşılması, yanı sıra, daha etkili nöroterapötik tasarımını geliştirmek. İlk Koizumi ve arkadaşları tarafından geliştirilen. 1986 yılında, 8 tMCAo prosedürü kemirgenlerde inme ve reperfüzyon aşağıdaki inflamasyon araştırmak için tercih edilen yöntemlerden birini uyaran bir yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. TMCAo yöntemleri geliştikçe, silikon kaplı filamentlerin daha yakın zamanda kullanım daha başka modeller 9,10 subaraknoid kanama riskini azaltmak/ Sup> maalesef tMCAo sık sık enfarktüs hacimleri geniş bir varyasyon üreten olsa ve güvenilirliğini artırmak. 11-13 Bu çalışmaların çoğu 2,3,5 trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyanarak koronal beyin kesitlerinde enfarktüsü bölgeleri belirginleştiren, kabul edilen bir enfarktüs ölçümü için altın standart o canlı, yinelenebilir sonuçlar üretmek için basit ve ucuz bir yoldur çünkü. TTC mitokondri içinde mevcut dehidrojenazın bir alt-tabaka olarak hizmet eder. Beyin dilimleri TTC çözeltisi maruz kaldıklarında formazan non çözünür indirgeme ürünü, uygun bir mitokondrilerinde koyu kırmızı bir renk çöktürülmesi burada TTC seçici canlı hücre alınır. Çünkü iskemik dokuda mitokondriyal disfonksiyon, bu doku hasarlı ve sağlıklı doku farklılaşması için izin beyaz kalır. 14

TÜSP ayrıca iskemik yarımkürede BBB bozulması azaltır. 6. Bu nedenle, BBB bütünlüğünün ikili miktarının aynı b içindeTTC-tabanlı infarkt hacmi olarak yağmurlar endojen koruma dolu etkinlik ile ilgili faydalı bilgiler ve tedavi edilmemiş ve tedavi edilen hayvanlarda BBB bozulması ve enfarktüs arasındaki potansiyel nedensel ilişkileri sağlayacak 15 tespitler. inme ikincil bir kesintiye BBB, aracılığıyla periferik kandan akını sonuçta iskemik inmeli hastalarda enfeksiyon ve ölüm oranlarının artırılması, iskemik yarımkürede lökosit popülasyonları, pro-inflamatuar sitokinler, oksidatif stres, vazojenik ödem ve hemorajik dönüşümünü artırır . 16,17 hayvan modellerinde BBB bozulması ölçülmesi için yaygın bir yöntem, beyin içine Evans mavisi (EB) boya sızıntı niceliğinin belirlenmesine dayandığı. 15,18-21 EB seçici albümin, bir küresel serum proteinine bağlanan (MW = 65 kDa) Bu yaralanmamış hayvanlarda BBB aşmaz. 22 iskemik inme sonrasında, EB beyin infiltratlar ve optik yoğunluk withi ölçümü için izin 620 nm'de fluorescesn perfüze yaralı parankim. 22 optik yoğunluk EB transkardiyak perfüzyon ile otopsi kortikal damar yıkanıp olmuştur BBB geçirgenliği ile doğru orantılıdır. EB tatbikat hayvanlarda TTC-lekeli beyinleri hemen işleme ile, enfarktüs hacmi BBB bozulması hem etkin bir şekilde belirlenebilir. Bu nöronal yaralanma BBB bozulması inme sonrası beyinde eşlik işlemleri değildir Bununla birlikte, dikkat edilmesi gereken, 23,24 şekilde kurban süre seçimi, önemli bir husustur.

Aşağıdaki protokol RHP yöntemi, geçici bir arter tıkanıklık uyarılması için tMCAo yöntemini detayları bu modellerin insan hastalarda orta serebral arter tıkanıklıkları ve nöral ve vasküler inme yaralanma bitiş noktaları belirlemek için ikili histolojik yöntemler. TTC genel bir enfarktüs hacim ölçümü sağlayan, hücre ölümü ve toplu doku hasarı büyüklüğüneume, EB BBB hasar hemisferik ölçümü için sağlarken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Bu protokol deneysel hayvan kullanımı için Sağlık (NIH) politikası için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından riayet UT Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Tekrarlayan Hipoksik Önkoşullanma

  1. Özel tasarım dört gaz regülatörleri ile ilgili debimetreler ve (O 2) tankları bir giriş portu aracılığıyla odalarına akmasına oksijenden sıkıştırılmış gazın izin PVC borular standart 15 L indüksiyon odalarına ekleyin. Özel tasarım hakkında daha fazla bilgi için donatım ve Malzemeleri bakın.
  2. 8 ve% 11,% O 2 poz almak Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma (TÜSP) Grubu ve Kontrol Grubu, aynı zamanda% 21 O 2 (oda havası) için pozlama alırsınız: 2 gruba fareler bölün. Frekans varyasyonlarının Tablo 1'e bakınız, yoğunluk (8 ve% 11 O2 ve% 21 O 2) ve ÜSP maruz kalma süresi (2 ya da 4 saat).
  3. Kendi O 2 tanklarına bağlı olan odalar, sağlam yiyecek ve su şişeleri ile her kafesin üst filtre kapağını çıkarın ve kafes yerleştirin. Kapatın ve bölmenin kapağını sabitleyin.
    1. Tanklar için ana gaz vanasını açın ve pozlama ilk 5 dakika dakika (LPM) başına 2 L her indüksiyon odası için başlangıç ​​akış ayarlayın. Maruz kalanı için 1 LPM akış hızını azaltın.
    2. Maruziyet sonunda, 0 LPM akışını azaltmak ve tankların gaz vanasını kapatın.
    3. Kamara kapaklarını açın ve her kafeste filtre üst kapağını değiştirin. Bir sonraki hipoksi maruziyetinde kadar standart konut kafesleri yerleştirin.
  4. NPD (Steris) ya da her kullanımdan sonra eşdeğer bir dezenfektan / deodorant her indüksiyon odasını aşağı püskürtün.
  5. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, iki hafta boyunca her gün aynı zamanda 21 ve% ÜSP fareler hem Açığa.

2. GeçiciOrta Serebral Arter Tıkanıklığı (tMCAo)

  1. Nihai RHP maruz kaldıktan sonra inme zamanlaması hakkında daha fazla bilgi için tartışma bakın.
  2. Aseptik cerrahi işyeri hazırlayın. % 70 Etanol veya eşdeğer dezenfektan ve tüm cerrahi aletler otoklav ile temizleyin çevredeki işyeri.
    1. Serebral kan akımı (CBF) göreceli değişiklikleri ölçmek için Laser Doppler Flowmetri (LDF) aleti ayarlayın. 37 ° C'ye kadar ısıtma pedi açın. 34 ° C inkübatör açın.
  3. Küçük bir indüksiyon odasında% 4 izofluran /% 70 NO 30/2% O 2 karışımı kısa bir pozlama ile fareler anestezi. Hafifçe pençe kısma doğru anestezi onaylayın. Fare pençesini çekilirse, indüksiyon odasına fare dönmek ve izofluran pozlama devam edin.
  4. Anestezi indüksiyon odasından fareler çıkarın ve hızlı bir şekilde burun konisi farenin burnunu yerleştirin. Anes akışını kapatarak, burun konisi gaz akışını açınhipestezi indüksiyon odası.
    1. % 70 No 2 /% 30 O 2 gaz karışımı değiştirmeden, prosedürün geri kalanı için idame dozu olarak% 1.8 izofluran sabitleyin. Nefes yavaş ve prosedür boyunca düzenli kalır ama nefes hızlı ve sığ olursa, izofluran dozu artırmak gerekir. Bakım dozlu bir deneyde kullanılan ekipman üretiminde ve hayvan arasında değişebilir.
  5. Bir microshaver kullanarak, göz ucuyla ve kulak yanı sıra boyun ventral orta hat arasındaki temporal bölgede saç tıraş. Fazla kürk çıkarın ve işlem sırasında kurumasını kornealar korumak için steril bir pamuklu çubukla göz kayganlaştırıcı uygulayın. Aseptik koşullarda sürdürmek için steril bir pamuklu çubukla alkol pedleri ve çubukla providon-iyot ile kesi bölgeyi silin.
  6. Kemirgen cerrahi kurallarına göre analjezikler uygulayın.
  7. Göz ve kulak arasındaki zamansal deri yoluyla bir kesi yapmak.Temporal kas Açığa. Cerrahi mikro makas kullanarak, beyaz kas çizgili alanı içinde zamansal sırtı zamansal kas ligament kesti.
    1. Yavaşça kafatası yoluyla orta serebral arter (MCA) görselleştirmek için forseps ile yanal kas toplu itin. Temporal kasın kesildikten sonra, bölge kan ile dolabilir. Yavaşça herhangi bir potansiyel kanama sadık bir pamuklu bir bez kullanın.
    2. MCA alanına LDF prob ucunu hedefleyin. Bu alanda fareler arasında değişmektedir olarak seçilen gemi kaydedin.
    3. Istikrarlı bir kırmızı kan hücresi akı okunana kadar kafatası ile yerde ve aynı hizada yer LDF tutun ve bazal CBF olarak bu değeri kaydediniz. Lazer Doppler flowmetri Ideal temel CBF> 600 akı, ama bu üreticiye değişir. Bazal CBF ise <400 akı, akım kayıt yakındaki bir ven veya hedef damarın üzerine sonda tamamlanmamış bir yerleştirme muhtemeldir.
  8. Taban CBF kurulduktan sonra repositiFare üzerinde böylece boyun maruz kalmaktadır. Başını Destek ve roket ucu konisi gelen sürekli anestezi altında fare tutmak.
  9. Sadece klavikulaya mandibulanın altından ventral orta hat kesi olun.
    1. Forseps kullanarak, sol karotis arter (CCA) açığa çıkarmak için tüm yüzeysel fasya teşrih künt. Bağ dokusu ve vagus sinirinden CCA ayırın.
    2. Kalıcı bir 6.0 ipek sütür ile CCA Arter. Filament yerleşim kapatılmasıy için yeterli oda izin mümkün olduğunca proksimaline kadar bağlanması dikiş yerleştirin.
    3. Döngü ve gevşek massedici dikişine CCA distalinde etrafında ikinci bir ipek kravat 6.0 sütür. Massedici Filament sonradan karotis yoluyla dişli olacak gibi arteri tıkamak için dikkatli olun.
    4. Gevşek bağlı ipek sütür ile CCA distal kelepçe 8 x 2 mm hafif mikro serrafine areterial kelepçe kullanın. Yavaşça forseps ile CCA kaldırın ve lige sütür olarak proksimal olarak, küçük bir boylamasına bir kesi yapmak3 mm Vannas mümkündür.
    5. Arter lümen girmek için kesiden bir 12 mm silikon kaplı 6.0 gauge naylon massedici filament geçirin ve sonra bir kaç mm ilerlemek. Gevşek CCA dışına itmek filaman ve arteriyel kelepçesini kaldırmaz kan akışını sağlamak için kapatıcı filamanın ucu etrafında ikinci gevşek ipek sütür sıkın.
    6. Internal karotis arter içine CCA (ICA) ve dış karotid arter (ECA) ilk ayrımında, 9 10.5 mm geçmiş için ICA.Advance massedici filamanın girmek için ilk çatallanma sağ dalı haline massedici filaman iplik Sol internal karotis arter (ICA) içine ikinci ipek sütür.
    7. Kısa bir süre ICA girdikten sonra, ICA ve pterogopalantine arter (KİK) arasında ikinci çatallanma sol dal içine tıkayıcı filament ilerlemek. PPA Görselleştirme size massedici filamanın tam yerleştirme ile hafif bir direnç hissedene kadar yani devam olası değildir.Forseps ile ICA Kaldırma Filament ikinci birfurcation sol dalı haline daha kolay iplik yardımcı olabilir. İkinci ipek sütür sıkın.
    8. MCA üzerinde kesi görünür böylece fareyi çevirin. LDF donanımları ile, CBF LDF okumaları aracılığıyla engellenmiş olduğunu onaylayın. Başarılı bir tıkanma temel CBF bir>% 80 azalma olduğunu.
    9. Doğru pozisyon elde edildiğinde tamamen çift düğüm fırsat massedici filamanın çevresine ikinci ipek sütür sıkın ve. Gerekirse, hafifçe itmek veya başarılı bir tıkanıklığı (bazal CBF örn>% 80 azalma) için CBF kriterlerini ulaşmak için massedici filament çekin.
    10. 6.0 naylon sütür ile boyun ve baş ağzını kapatınız.
  10. Tıkanma süresi için 34 ° C kuluçka makinesi içinde yer fareler. Oklüzyon Önerilen uzunluğu 60 dk, ancak bu yaş, gerilme bağımlı serebrovasküler anatomi, 25 farklılıklardan ve olduğa ölçüde için değişiry (hafif, orta, şiddetli) istenen. Hayvanlar anestezi kapalı geliyor dakika içinde bilincini yeniden emin olun.
  11. Adım 2.3 açıklandığı gibi, izofluran ile hayvan yeniden uyutmak, 5 dk önceden tanımlanmış kapama süresinin bitiminden önce, kafa derisi kesi açıp MCA perfüzyon hala transkranial LDF okumaları kullanılarak azaltılır onaylayın. CBF yeterince (örneğin <% 20 bazal BKA) azalır değilse, MCA oklüzyonu sırasında bir noktada reperfüzyon ve fare daha deney dışında tutulmalıdır.
  12. Orta hat boyun kesi açın ve gevşek CCA çevresinde üçüncü bir ipek sütür kravat, CCA çatallanma ikinci ipek sütür ama proksimal distal filaman çıkarıldıktan sonra dış karotid arter (ECA) canlı kalmasını sağlamak için.
    1. Kes veya tıkayıcı iplik (yani ikinci ipek sütür) tutan düğümü çöz ve yavaş yavaş massedici filament çekilme. Çıkarıldı sonra, hızlı bir şekilde kapatmakCCA etrafında üçüncü ipek sütür ICA kan akmasını en aza indirmek için. Çift düğüm bu dikiş ve 6.0 naylon sütürler ile kesi kapatın.
    2. Reperfüzyon 5 dakika sonra CBF seviyesini ölçmek için fare yerleştirin. Başarılı reperfüzyon genellikle tıkanıklığı akışı gibi, araştırmacılar kendi kriter kurabilir, bazal CBF>% 50 BKA olarak tanımlanan, ancak. Hayvanlar taban% 50 altında bir CBF sergilemek ise, MCA 'kalıcı' tıkalı olduğu muhtemeldir ve bu nedenle başka bir çalışma dışlama kriterini temsil eder.
    3. 6.0 naylon sütür ile her iki kesiler kapatın. Kemirgen kurallarına göre tuz, anestezi (Lidokain) ve antibiyotik sağlayın. Bununla birlikte antibiyotik (minosiklin 3 mg / kg), bazı küçük dozlarda nöroprotektif şu felç olduğu tespit edilmiştir. 26
  13. Temiz, steril bir kafes içinde ameliyat, yer farelerin aşağıdaki ısıtılmış inkübatör bilinç kazanmak sonra. Nemlendirilmiş foo sağlayınd veya beslenme hidrasyon diyet jel takviyeleri ve hayvanlar gibi su petri inme sonrası hareketlilik sınırlı olacaktır. Aşırı ameliyat sonrası ağrı ve ölüm kurtarma sırasında yakından hayvanları izleyin.

3. Evans Mavi (EB) Enjeksiyon

  1. Reperfüzyon sonrası EB 22 saat enjekte edilir ve kurban ve TTC boyama öncesinde 2 saat boyunca kan dolaşımında sirküle edilmelidir.
  2. (Tuzlu su içinde% 2 EB) enjeksiyon için EB çözeltisi yapmak ve yavaşça oda sıcaklığında karıştırın. Filtre filtre kağıdı ile bir çözelti veya oda sıcaklığında, küçük çözünmemiş EB kaldırmak için şırınga ve saklamak için bağlanmış bir 0.2 mikron filtre içinden itmek.
  3. Enjeksiyon için gerekli EB miktarı (4 ml / kg vücut ağırlığı) 29 ölçü bir iğne ile 0.3 cc insülin şırıngaya boya istenilen miktarda çizmek ve çözelti, oda sıcaklığında olduğundan emin olun hazırlanması
    1. Düz dipli koruyucularını kullanarak fare kısıtlamaktadır. Yanal damar upp böylece kuyruk tutermost. Yanal damarları kuyruk merkez çizgisinin her iki tarafında yer almaktadır. Enjeksiyon için sabit fare tutmak için kuyruk ucunu tutun.
    2. Damarın perfore için dikkatli olmak, damar içine yaklaşık 3.5 mm iğne takın. İğne şırınga geri çekme ve kan izleri bakarak ven olduğunu doğrulayın.
    3. 1 dakikalık bir süre boyunca, boyanın tüm enjekte edilir. Çözelti venine olacak, basınç şırıngaya uygulandığında çok az direnç olmalıdır. Fare kuyruğu, bacaklarda ve gözünde ani renk değişikliği ile EB başarılı sistemik venöz yönetimini onaylayın.
    4. Kuyruk iğne çıkarın ve yavaşça kanamayı durdurmak amacıyla temiz gazlı bez ile basınç uygulayın.
  4. Farenin cilt mavi döndüğünde zamanlama başlayın. 2 saat zayıflamış BBB nüfuz için EB dolaşmaya izin verin.

4. 2,3,5 Triphenyltetrazolium Klorür (TTC) Boyama

  1. Perfüzyon ve TTC boyama reperfüzyon sonrası 24 saat meydana gelmelidir.
  2. Kurban belirlenen süre öncesinde% 2 TTC çözeltisi hazırlayın. 0.01 M fosfat tamponlu tuz çözeltisi, 500 ml (PBS), pH 7.4 TTC tozu, 10 g ekleyin. Su banyosu içinde 37 ° C ısı çözeltisi TTK çözündürücü kolaylaştırmak için. DİKKAT: TTC toz ve çözelti deri, akciğer ve göz tahriş edici. Bu maddelerle çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
    1. Toz tamamen çözündükten sonra, hemen ardından 4 ° C 'de bir şişe kapağı folyo ve deposuna aktarımı. TTC ve TTC ile boyandı doku ışığa duyarlı bulunmaktadır.
  3. TMCAo sonra 24 saat ve EB uygulamasından sonra 2 saatte bir küçük indüksiyon odasında bir izofluran doz aşımı ile hayvan kurban. Perfüzyon ölümünün ardından oksijen yokluğunda başlar otolitik en aza indirmek için sacricice aşağıdaki derhal başlamalıdır.
  4. Hızla hayvan sabitlemekpençeleri ile tutturulmuş önkol bir strafor platformunda. Sadece göğüs kafesi altında orta hat karın duvarından lateral kesi kesin. Dikkatle kalbi maruz diyaframdan kesti.
    1. 27 dil bilgisi kanatlı infüzyon iğne soğuk 0.01 M PBS, buz ile doldurulmuş ve birleştirilmiş bir 60 cc şırınga ile 5 ml / dk akış hızında perfüzyon Pompayı çalıştırın. Yaklaşık 0.5 cm kalbin sol ventrikül içine iğne ucu yerleştirin ve sağ atrium kesti. Venöz kan renksiz görünene kadar aşamalı sulandırılmış venöz kan perfüzyon sırasında atrium dışarı akması gerekir. Transkardiyal kalbinden 30 mi, 0.01 M fosfat tamponlu tuz (PBS) serpmek.
  5. Şeffaf 20 sintilasyon şişelerine TTC çözeltisi 5 ml.
  6. Hemen hayvanların başını kesmek ve küçük makas ve bir spatula gerekirse kullanarak beynini teşrih, perfüzyon aşağıdaki. Subaraknoid hemorrha uygulanan hayvanların dışlamak için beyinleri inceleyindikiş yerleştirme sekonder Willis poligonu de ge. Fark EB sızıntı veya ödem olmaksızın, tıkalı MCA için yarımkürede kontralateral soluk göründüğünü kontrol edin.
  7. Bir fare beyin 1.0 mm kalınlığında koronal kesitler hale getirmek için tasarlanmış bir akrilik beyin matrisine PBS dökün. Matris içine kadar beyin, dorsal yüzü koyun ve hemen beynin üzerinde PBS dökün. Nemli beyin tutun.
    1. Matrisin rostral tarafında ikinci yuvaya paslanmaz çelik 0.21 mm kalınlığında bıçak sokarak koku ampuller çıkarın.
    2. Matrisin kaudal tarafında dördüncü yuvaya bir bıçak sokarak beyincik çıkarın.
    3. Matriste kalan yuvaları orta yuvaya bıçağı yerleştirin. Eşit dilimleme sırasında dokuda en eşit dağılımını sağlamak için kalan doku bisecting kalan bıçakları takın.
    4. Tüm bıçaklar takıldıktan sonra, onu nemlendirmek için beyne PBS 1 ila 2 damla ekleyin.
    5. Bıçak kaldırrostral bölge ile başlayan matristen bir defada s biri. TMCAo sonra TTC analizi için ilk 7 dilim tutun. Dikkatle TTC-dolu bir şişeye bıçak dilim aktarmak için küçük bir spatula kullanın.
  8. Tüm bölümleri flakon olduktan sonra, kap ve bölümler pembe çevirene kadar ılık su banyosu yerleştirin. Düzensiz boyanma yol açabilecek bölüm örtüşmesini önlemek için gerekirse yavaşça banyosunda şişeyi çevirin. Sonra TTK imha ve TTC kimyasal reaksiyonu sonlandırmak için beyin bölümleri kapsayacak şekilde şişenin içine% 4 paraformaldehid çözüm dökün.
  9. Hemen temiz bir 1 "x 3" cam slayt bölümleri düzenlemek ve rostral gelen kaudal Bölümleri yönlendirmek.
    1. Bölümler slaytta düzenlenir zaman standart bir tarayıcı kullanılarak slayt tarayın. Görüntü analizi için 600 dpi en az çözünürlük ayarlayın. Hayvanın adını ve taranan görüntüde bir metrik cetvel dahil ettiğinizden emin olun.
    2. Slayt ters çevirinve toplanan tüm verileri sağlamak için arka tarafını tarar.

5. Enfarktüs Hacim Ölçümü

  1. Standart bir görüntü analizi yazılımı (ör ImageJ) kullanarak, enfarktüs hacmini ölçmek.
  2. Yeterli analizi için yüksek çözünürlüklü (örn 600 dpi) Tarama görüntüler. Bitki görüntüler. Taranan görüntüde yer alan metrik cetvel kullanarak tüm görüntüler için ölçek standart hale.
  3. Aşağıdaki formül kullanılarak kontralateral yarımkürenin toplam hacmi hesaplayın. Ipsilateral yarımkürenin toplam hacmini hesaplamak için bu formülü tekrarlayın.
    Her dilim dilim kalınlığı x toplam kontralateral yarımkürede toplamı
  4. Dolaylı infarkt hacmi hesaplayın. . Bir kontrol olarak sağlıklı, kontralateral yarımkürede kullanarak inme ipsilateral ödem Kontrol 27 dolaylı enfarktüs hacmini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
    Kontralateral yarımkürenin Toplam hacim -
    (Toplam volumenfarktüs 3 ölçümün ipsilateral hemisfer e -Ortalama hacmi)

6. Kan beyin bariyeri (KBB) Bütünlük Niceleme

  1. EB ölçümü için hazırlık ilk 2,5 inç tekneler tartmak tartmak. Kilo kaydedin ve her bir hayvan için iki tartmak tekneler etiket: ipsilateral hemisferde diğeri kontralateral yarımkürede için bir.
  2. TTC-lekeli bölümleri taradıktan sonra, ipsilateral ve kontralateral hemisfer içine atılan jilet ile her bölüm bisect. Bir tartmak teknede 7 kesimlerinden ipsilateral hemisferlerin yerleştirin ve ağırlığı kaydedin. Kontralateral yarımkürede için tekrarlayın.
  3. Hemen 48 saat boyunca 56 ° C'de bir fırın grubu ağırlıkça tekneler aktarın.
  4. Kurutuldu bölümleri tartın. Ayrı 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine her iki yarımkürede aktarın.
    1. Her bir yarım küre için gerekli formamid miktarı (kuru doku 8 ml / g) hesaplayın ve bunların ilgili microcentrifug ekleE tüpleri. Formamid ışığa karşı hassastır ve ileriye bu noktadan itibaren folyo tüm formamit tedavi edilen örnekleri kapsamaktadır.
    2. Başka bir 48 saat daha 56 ° C'de ayarlanmış bir kuluçka mikrosantrifüj tüpleri aktarın.
  5. 48 saat sonra, etiketli mikrosantrifüj tüpler başka bir dizi içine mavi süpernatant dışarı pipetle. Ayıklanır süpernatant hacmi maksimize etmek tüpün dibine doku itin. Süpernatant tüpleri tutun ve tüm doku atmayın.
  6. Standart eğri için formamid EB üstel seri dilüsyonları hazırlayın. Formamid EB 64 ug / ml ile 0.125 ila 1 boş (formamid sadece) ve daha sonra 10 üstel çözümler ug / ml ekleyin.
    1. Bir 96-yuvalı plaka içine, standart eğri için yapılan seyreltileri 300 ul Pipet. İlgili kuyulara süpernatant 300 ul pipetle.
    2. 620 nm'de bir spektrofotometrede absorbansı ölçülür.
    3. Absorbans o ile EB dilüsyonlarının standart eğri karşılaştırınSüpernatan örnekleri f. optik yoğunluğu BBB bütünlüğü ile doğru orantılıdır.
    4. Arka plan olarak kontralateral yarımkürede optik yoğunluğunu varsayalım ve katlık değişime belirlemek için formül (ipsilateral-kontralateral) / kontralateral kullanın. İstatistiksel analiz hakkında daha ayrıntılı bilgi için Martin ve ark bakın. 2010. 18

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu çalışma, 10 haftalık ÜSP içine rasgele başlangıcında (n = 10), 25 erkek Swiss Webster fareleri veya% 21 O 2 (n = 15) grupları dahildir. İki hafta son RHP maruz kaldıktan sonra, cerrahi işlemler kör gruplarla, yapıldı ve gün arasında denge. TMCAo ardından, 1 fare ameliyat sonrası iyileşme döneminde ölen ve reperfüzyon CBF kriterini karşılamak yoktu çünkü 1 fare çalışma dışı bırakıldı. Her ikisi de dışlanmış fareler% 21 O 2 grup vardı. Uyarınca kurallara...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sistemik hipoksi farelerde (yani, 2 saat% 11 O 2) Bir tek maruziyet "geçici" kısa ömürlü hipoksik ön hazırlık meydan epigenetik yanıtı anlam tMCAo, 29 beyni korur ve temel fenotip içinde geri günler. Hipoksik önkoşullama uyaranın Tekrarlanan sunumlar dramatik nöroprotektif fenotip süresini uzatmak. 6 Birçok çalışma tekrarlayan uyaran trenin sıklığı, büyüklüğü ve süresi bu yanıtın kritik belirleyicileri olduğunu göstermiştir. Örneği...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Flowmeters, regulatorsVetEquip, IncSpecialty orderFour flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench.
21% O2 tankAirGasOX USP200
11% O2 tankAirGasSpecialty order
8% O2 tank AirGasSpecialty order
15 L induction chambersVetEquip941454
Moor Laber Dopper Flow Moor Instruments moorVMS-LDF1-HP0.8 mm diameter probe 
High Intensity Illuminator NikonNI-150
Zoom Stereo Microscope NIkonSMZ800Other surgical microscopes may be used. 
Kent Scientific Right Temperature CODAKent Scientific CorporationDiscontinuedRecommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
Hovabator IncubatorStromberg's2362-EOur model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. 
V010 Anesthesia system VetEquip901807Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters
250 ml isoflurane Butler ScheinNDC-11695
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer Andis #23905Replacement blades are available from Andis (#23995)
Betadine Fisher Scientific19-898-867 
Q-tipsMultiple sellers Catalog number not available 
Gauze PadsFisher Scientific67622
Surgical drapeFisher ScientificGM300 
Silk Sutures Look/Div Surgical SpecialtiesSP115
Nylon SuturesLook/Div Surgical SpecialtiesSP185
Durmont #5 forceps (2) Fine Science Tools 11251-35Angled 45°
Surgical ScissorsFine Science Tools 14028-10
3 mm VannasKent Scientific CorporationINS600177Straight blade
Hartman Hemostats Fine Scientific Tools13002-10
Occluding filamentsWashington UniversitySpecialty orderFilaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. 
Evans BlueSigma AldritchE2129-10G
Filter Paper Sigma AldritchWHA1001150150 mm, circles, Grade 1 
Weigh BoatsFisher Scientific02-202-1012.5" diameter
0.9% Sodium Chloride Injection USP Baxter Pharmaceutics 2B1321
0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needleBecton Dickinson Labware309301
Flat bottom restrainer Braintree Scientific FB M2.0" diameter
TTCSigmaT8877
10x PBS, pH 7.4Fisher ScientificBP399-20
Water BathMultiple sellers Catalog number not available Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath.
Styrofoam boardMultiple sellers Catalog number not available 
Large Syringe KitPumpSystems IncP-SYRKIT-LG
Perfusion PumpPumpSystems IncNE-300 
60 cc syringeFisher ScientificNC9203256
27 gauge winged infusion setKawasumi Laboratories, IncD3K1-25G 1
20 ml scintillation vialFisher Scientific50-367-126
Stainless steel spatulaFisher Scientific14-373-25A
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronalCellPoint Scientific Catalog number not available 
0.21 mm stainless steel blades, 25 pkCellPoint Scientific Catalog number not available Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative.
4% paraformaldehydeSanta Cruz Biotechnology SC-281692
Superfrost microscope slides Fisher Scientific12-550-15
HP Scanjet G4050Multiple sellers Catalog number not available Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol.
ImageJ National Institute of HealthCatalog number not available 
Analytical BalanceMettler Toledo XSE 205U
Precision Compact Oven  Thermo Scientific PR305225M
1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs)Denville Scientific C2170
FormamideFisher ScientificBP228-100
96-well platesFisher Scientific07-200-9
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Catalog number not available 

Referanslar

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
  3. Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
  4. Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
  5. Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
  6. Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
  7. Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22(2014).
  8. Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  9. Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
  11. Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561(2013).
  12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  13. Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
  14. Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
  15. Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
  16. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
  17. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
  18. Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
  19. Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
  20. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
  21. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019(2012).
  22. Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
  23. Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
  24. Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
  25. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
  26. Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7(2004).
  27. Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
  28. Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517(2010).
  29. Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
  30. Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
  31. Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065(2013).
  32. Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
  33. Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
  34. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
  35. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  36. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  37. Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
  38. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  39. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  40. Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
  41. Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
  42. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  43. Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
  44. Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
  45. Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
  46. Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
  47. Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
  48. Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
  49. Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 99hipoksin artlamage ici orta serebral arter t kan klfeln roprotektifkan beyin bariyeri bozulmas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır