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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Abstract

Modelli animali sperimentali di ictus sono strumenti preziosi per la comprensione ictus patologia e sviluppare strategie di cura più efficaci. Un protocollo 2 settimane per ripetitivo precondizionamento ipossico (RHP) induce una protezione a lungo termine contro il sistema nervoso (CNS) lesione centrale in un modello murino di ictus ischemico focale. RHP consiste 9 esposizioni stocastici all'ipossia che variano sia in durata (2 o 4 ore) e l'intensità (8% e 11% O 2). RHP riduce volumi infarto, barriera emato-encefalica (BBB) ​​rottura, e la risposta infiammatoria post-ictus per settimane dopo l'ultima esposizione all'ipossia, suggerendo una induzione a lungo termine di un fenotipo CNS-protettivo endogeno. La metodologia per il duplice quantificazione del volume dell'infarto e BBB perturbazione è efficace nel valutare la protezione neurovascolare nei topi con RHP o altri neuroprotectants putativi. Maschio adulto topi Swiss Webster sono stati condizionati da RHP o esposizioni di durata equivalente al 21% O (aria ambiente). A 60 min transitoria occlusione dell'arteria cerebrale media (tMCAo) è stata indotta 2 settimane dopo l'ultima esposizione ipossica. Sia l'occlusione e riperfusione sono stati confermati da transcranico laser Doppler flussimetria. Ventidue ore dopo riperfusione, Blu di Evans (EB) è stato per via endovenosa somministrato attraverso una iniezione coda vena. 2 ore più tardi, gli animali sono stati sacrificati per sezioni di overdose e di cervello isoflurano sono stati colorati con 2,3,5- trifeniltetrazolio cloruro (TTC). Volumi infarti sono stati poi quantificati. Avanti, EB è stato estratto dal tessuto oltre 48 ore per determinare BBB perturbazione dopo tMCAo. In sintesi, RHP è un semplice protocollo che può essere replicato, con un costo minimo, per indurre a lungo termine endogeno protezione neurovascolare da un infortunio ictus nei topi, con il potenziale traslazionale per altri stati di malattia pro-infiammatorie CNS-based e sistemici.

Introduzione

Come la principale causa di disabilità adulta e la quarta causa di morte, ictus è una delle patologie più debilitanti di fronte alla popolazione adulta degli Stati Uniti. 1 I modelli animali di ictus permettono di indagine sperimentale di nuovi metodi per ridurre il danno ischemico e migliorare il recupero post-ictus. Una strada nuova per questo tipo di ricerca traslazionale è precondizionamento. Precondizionamento è l'uso intenzionale di uno stimolo non dannosi per ridurre i danni da una successiva e più grave, lesioni. 2 Hypoxic precondizionamento ha dimostrato di produrre cambiamenti pleiotropici nel cervello che forniscono protezione contro ictus sia in vivo e in vitro . 3 Tuttavia, una singola esposizione all'ipossia offre solo neuroprotezione a breve termine, inducendo a meno di 72 ore di tolleranza nei confronti dell'ischemia in topi adulti. 4 anche dopo quattro settimane di 14 hr esposizioni quotidiane all'ipossia ipobarica, Lin et al. found che neuroprotezione è stato sostenuto solo per una settimana. 5 precondizionamento ipossico ripetitiva (RHP) è caratterizzato da variazioni stocastiche in frequenza, la durata e l'intensità delle esposizioni ipossiche. A differenza di una singola sfida precondizionamento, RHP induce un fenotipo cerebroprotective che dura fino a otto settimane nei topi. 6 RHP ridotti volumi infarto, barriera emato-encefalica (BBB) ​​rottura, infiammazione vascolare, e dei leucociti diapedesi per settimane dopo l'esposizione ipossica finale . RHP particolare ha ridotto l'infiammazione nel cervello ischemico attraverso la riduzione delle cellule T, monociti, macrofagi e le popolazioni, pur mantenendo popolazioni di cellule B nell'emisfero ischemico. 7, infatti, RHP indotto un fenotipo immunosoppressivo nei topi prima di eventuali lesioni del sistema nervoso centrale, tra cui l'ictus. Cellule B RHP-trattati isolati da RHP trattati topi sani mostravano un fenotipo antinfiammatorio unico, con una sottoregolazione sia presentazione dell'antigene e la produzione di anticorpi. Ilriduzione complessiva pro-infiammatorie meccanismi immunitari adattivi rende RHP una metodologia eccellente per indurre immunosoppressione endogena non solo per le malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale-specifici, ma anche modelli di infortunio o malattia sistemica che includono una patologia pro-infiammatoria.

RHP riduce sia il volume dell'infarto e BBB rottura dopo un transitorio mezzo occlusione dell'arteria cerebrale (tMCAo). I modelli animali di ictus, come comunemente usato tMCAo, migliorano notevolmente la comprensione della fisiopatologia di ictus, nonché la progettazione di neurotherapeutics più efficaci. Prima sviluppato da Koizumi et al., 1986, 8 la procedura tMCAo è un metodo ampiamente utilizzato per indurre ictus nei roditori e uno dei metodi preferiti per indagare infiammazione seguente riperfusione. Poiché i metodi per tMCAo evolvono, l'uso più recente di filamenti silicone rivestite ridurre ulteriormente il rischio di emorragia subaracnoidea rispetto ad altri modelli 9,10 </ Sup> e migliorare l'affidabilità, anche se purtroppo tMCAo produce spesso una grande variazione dei volumi di infarto. 11-13 La maggior parte di questi studi delineano regioni infarto in sezioni di cervello coronali con la colorazione 2,3,5- trifeniltetrazolio cloruro (TTC), considerato un gold standard per la quantificazione infarto, perché è un modo semplice e poco costoso per produrre vivide, risultati replicabili. TTC serve come substrato delle deidrogenasi presenti nei mitocondri. Quando fettine cerebrali sono esposti alla soluzione TTC, TTC è selettivamente preso in cellule viventi in cui il suo prodotto di riduzione non solubile, formazano, precipita ad un colore rosso intenso nei mitocondri vitali. A causa della disfunzione mitocondriale nel tessuto ischemico, questo tessuto rimane bianca, consentendo la differenziazione dei tessuti danneggiati e sani. 14

RHP riduce anche perturbazione BBB nell'emisfero ischemico. 6 Pertanto, il duplice quantificazione dell'integrità BBB all'interno dello stesso bpiogge il volume dell'infarto-based TTC determinazioni 15 potrebbe fornire informazioni utili sul pieno efficacia di protezione endogena, e potenziali relazioni causali tra interruzione BBB e infarto negli animali non trattati e trattati. L'afflusso di sangue periferico attraverso un BBB perturbato, secondaria a ictus, aumenta popolazioni leucocitarie, citochine pro-infiammatorie, lo stress ossidativo, vasogenico e trasformazione emorragica nell'emisfero ischemico, in ultima analisi, aumentando i tassi di infezione e mortalità nei pazienti con ictus ischemico . 16,17 Un metodo comune per misurare BBB perturbazione nei modelli animali è attraverso la quantificazione del blu di Evans (EB) perdita di colorante nel cervello. 15,18-21 EB si lega selettivamente all'albumina sierica, una proteina globulare (PM = 65 kDa) che non attraversa la BBB negli animali illesi. 22 A seguito di ictus ischemico, EB infiltra il cervello, e fluorescenza a 620 nm, permettendo per la misurazione della densità ottica within parenchima feriti perfuso. 22 La densità ottica è direttamente proporzionale alla permeabilità della BBB quando EB è stato lavato fuori della vascolarizzazione corticale post mortem da transcardiac perfusione. Con la trasformazione immediata di cervelli TTC-macchiati negli animali con la somministrazione EB, sia il volume dell'infarto e BBB disagi possono essere efficacemente quantificati. Va notato, tuttavia, che danno neuronale e BBB perturbazione non sono processi concomitanti nel cervello post-ictus, 23,24 così la selezione del tempo di sacrificio è una considerazione importante.

Il protocollo che segue i dettagli il metodo RHP, il metodo tMCAo per indurre una occlusione arteriosa temporaneo che modelli di mezza occlusioni dell'arteria cerebrale nei pazienti umani, ei metodi istologici doppi per la determinazione neurali e vascolari endpoint lesioni ictus. TTC misura morte cellulare e danni ai tessuti cumulativo, permettendo la quantificazione di un infarto vol generaleume, mentre EB prevede la quantificazione del danno emisferica BBB.

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Protocollo

NOTA: Questo protocollo è stato approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso UT Southwestern Medical Center, che si attiene dal National Institutes for Health (NIH) La politica per l'utilizzo degli animali sperimentali.

1. ripetitivo ipossico precondizionamento

  1. Design personalizzato quattro misuratori di portata sui regolatori di gas e allegare alle camere di induzione 15 L standard con tubi in PVC per consentire gas compresso da ossigeno (O 2) serbatoi di fluire nelle camere tramite una porta di ingresso. Vedere attrezzature e materiali per ulteriori dettagli su progettazione personalizzata.
  2. Dividete i topi in 2 gruppi: ripetitiva ipossico precondizionamento (RHP) del Gruppo, che ricevono le esposizioni al 8% e il 11% O 2, e il gruppo di controllo, che ricevono le esposizioni al 21% O 2 (aria ambiente) contemporaneamente. Vedere la Tabella 1 per le variazioni di frequenza, intensità (8 e 11% O 2 e 21% O 2), e la durata (2 o 4 ore) delle esposizioni RHP.
  3. Rimuovere il coperchio superiore del filtro di ogni gabbia e posizionare la gabbia, con bottiglie cibo e acqua intatti, nelle camere connessa alle rispettive O 2 serbatoi. Chiudere e fissare il coperchio della camera.
    1. Aprire la valvola principale del gas per i serbatoi e impostare il flusso iniziale per ogni camera di induzione a 2 L per min (LPM) per i primi 5 minuti di esposizione. Ridurre la portata di 1 LPM per il rimanente dell'esposizione.
    2. Alla fine dell'esposizione, ridurre il flusso di 0 LPM e chiudere la valvola del gas per i serbatoi.
    3. Aprire i coperchi da camera e sostituire il coperchio superiore del filtro in ogni gabbia. Mettere le gabbie in alloggiamento standard fino alla prossima esposizione ipossica.
  4. Spray giù ogni camera di induzione con NPD (Steris) o un equivalente / disinfettante deodorante dopo ogni uso.
  5. Esporre sia 21% e RHP topi allo stesso tempo del giorno nel corso di due settimane come descritto nella Tabella 1.

2. TransientOcclusione dell'arteria cerebrale media (tMCAo)

  1. Vedere discussione per ulteriori dettagli sui tempi di ictus a seguito di esposizione finale RHP.
  2. Preparare un intervento chirurgico di lavoro asettico. Pulire posto di lavoro circostante con il 70% di etanolo o un disinfettante equivalente e autoclave tutti gli strumenti chirurgici.
    1. Impostare lo strumento laser flussimetria Doppler (LDF) per misurare variazioni relative flusso ematico cerebrale (CBF). Accendere il rilievo di riscaldamento a 37 ° C. Accendere l'incubatore a 34 ° C.
  3. Anestetizzare topi con una breve esposizione ad una miscela di 4% isoflurano / 70% NO 2/30% O 2 in una piccola camera di induzione. Confermare anestesia corretta pizzicando leggermente la zampa. Se il mouse ritira la sua zampa, ritorno il mouse nella camera di induzione e proseguire l'esposizione isoflurano.
  4. Rimuovere i topi dalla camera di induzione dell'anestesia e inserire velocemente il naso del mouse nella cono. Aprire il flusso di gas per il cono, chiudendo portata ai anesThesia camera di induzione.
    1. Senza modificare l'NO 70 miscela al 2% / 30% O 2 gas, fissare isoflurano al 1,8% come dose di mantenimento per il resto della procedura. La respirazione deve rimanere lento e regolare durante tutta la procedura, ma se il respiro diventa rapido e superficiale, aumentare la dose isoflurano. Dose di mantenimento può variare tra produzione materiale e animale utilizzato per l'esperimento.
  5. Utilizzando un microshaver, radere i capelli sulla regione temporale tra l'angolo dell'occhio e dell'orecchio nonché linea mediana ventrale del collo. Rimuovere l'eccesso di pelliccia e applicare il lubrificante oculare con un tampone di cotone sterile per mantenere le cornee si secchi durante la procedura. Pulire zona incisione con tamponi imbevuti di alcool e tampone Providone iodio con un tampone di cotone sterile per mantenere condizioni asettiche.
  6. Somministrare analgesici secondo le linee guida chirurgiche roditori.
  7. Effettuare una incisione attraverso la pelle temporale tra l'occhio e l'orecchio.Esporre il muscolo temporale. Utilizzando chirurgiche micro-forbici, tagliare il legamento muscolo temporale alla cresta temporale all'interno dell'area di bianco striatura muscolare.
    1. Premere delicatamente la massa muscolare lateralmente con una pinza di visualizzare l'arteria cerebrale media (MCA) attraverso il cranio. Dopo incisione del muscolo temporale, l'area può riempirsi di sangue. Usare delicatamente un batuffolo di cotone per tamponare le emorragie potenziale.
    2. Obiettivo la punta della sonda LDF all'area MCA. Registrare la nave scelta come questa zona varia tra i topi.
    3. Tenere il LDF in luogo e filo con il cranio, fino a un flusso stabile di globuli rossi viene letta e registrare questo valore come la CBF basale. Ideale CBF basale su un laser flussimetria Doppler sono> 600 flusso, ma questo varia a seconda del produttore. Se basale CBF è <400 flusso, è più probabile da una vena, o un posizionamento incompleta della sonda sul vaso target registrazione flusso.
  8. Dopo basale CBF è stabilito, repositisul mouse in modo che il collo è esposto. Sostenere la testa e tenere il mouse in anestesia costante dal musetto.
  9. Effettuare una incisione mediana ventrale da appena sotto la mandibola alla clavicola.
    1. Utilizzando pinze, Blunt sezionare tutto fascia superficiale per esporre l'arteria carotide comune sinistra (CCA). Separare il CCA da tessuto connettivo e il nervo vago.
    2. Definitivamente legare il CCA con una sutura 6.0 seta. Posizionare la sutura legatura come prossimale possibile per consentire uno spazio sufficiente per occludere il posizionamento del filamento.
    3. Loop e vagamente legare un secondo di seta 6.0 sutura intorno distale CCA alla sutura occlusione. Fare attenzione a non ostruire l'arteria come il filamento occlusione sarà poi threaded attraverso la carotide.
    4. Utilizzare un micro serrafine morsetto areterial luce 8 x 2 mm per serrare il distale CCA per la sutura di seta loosely-legato. Sollevare delicatamente la CCA con una pinza e fare una piccola incisione longitudinale, come prossimale alla sutura legatura comepossibile con 3 Vannas mm.
    5. Infilare un siliconato 6.0 calibro nylon occlusione filamento 12 millimetri attraverso l'incisione per inserire il lume delle arterie, e poi avanzare di qualche mm. Avvitare senza bloccare la seconda sutura di seta allentato attorno alla punta del filamento occlusione per assicurare il flusso sanguigno non spingere il filamento dal CCA e rimuovere il morsetto arteriosa.
    6. Alla prima biforcazione del CCA nell'arteria carotide interna (ICA) e l'arteria carotide esterna (ECA), infilare il filamento occlusore nel ramo destro della prima biforcazione ad entrare nel ICA.Advance filamento occlusione 9-10,5 mm oltre la seconda sutura di seta in arteria carotide interna sinistra (ICA).
    7. Poco dopo essere entrati in ICA, far avanzare il filamento occlusione nel ramo di sinistra alla seconda biforcazione tra l'ACI e l'arteria pterogopalantine (PPA). Visualizzazione della PPA è improbabile quindi procedere fino a quando fa resistenza mite con il pieno inserimento del filamento occlusione.Sollevamento della ICA con una pinza può aiutare il filamento infilare più facilmente nel ramo sinistro del secondo birfurcation. Stringere la seconda sutura di seta.
    8. Girare il mouse in modo l'incisione sopra il MCA è visibile. Con l'attrezzatura LDF, verificare che il CBF è bloccato attraverso letture LDF. Una occlusione successo una riduzione> 80% da CBF basale.
    9. Completamente stringere e doppio nodo della seconda sutura di seta attorno al filamento occlusione al raggiungimento della posizione corretta. Se necessario, premere leggermente in o tirare il filamento occlusione di raggiungere i criteri CBF per occlusione di successo (ad esempio riduzione> 80% rispetto al basale CBF).
    10. Chiudere l'apertura del collo e la testa con punti di sutura 6.0 nylon.
  10. Topi posto nel 34 ° C incubatore per la durata dell'occlusione. Lunghezza consigliata di occlusione è di 60 minuti, ma questo varia per età, le differenze ceppo-dipendente di anatomia cerebrovascolare, 25 e l'estensione della injury desiderato (lieve, moderata, grave). Assicurarsi che gli animali riprendano conoscenza all'interno minuti di venuta fuori anestesia.
  11. Re-anestetizzare gli animali con isoflurano, come descritto al punto 2.3, 5 minuti prima della fine del periodo di occlusione predefinito, aprire l'incisione del cuoio capelluto e confermare che la perfusione MCA è ancora ridotto utilizzando letture LDF transcranica. Se CBF non è sufficientemente ridotta (ad esempio <20% al basale CBF), la MCA ha riperfuso ad un certo punto durante l'occlusione e il mouse deve essere escluso da ulteriori sperimentazioni.
  12. Aprire l'incisione del collo linea mediana e legarlo senza una terza sutura di seta intorno al CCA, distale alla seconda sutura di seta ma prossimale alla biforcazione CCA per garantire che l'arteria carotide esterna (ECA) rimarrà vitali dopo il filamento viene rimosso.
    1. Tagliare o sciogliere il nodo che contiene il filamento occlusione (cioè, secondo sutura di seta) e ritirare il filamento occlusione lentamente. Una volta rimosso, rapidamente chiudere ilterzo sutura di seta attorno al CCA per ridurre al minimo il riflusso di sangue dal ICA. Doppio nodo questa sutura e chiudere l'incisione con punti di sutura 6.0 nylon.
    2. Riposizionare il mouse per quantificare il livello di CBF dopo 5 min di riperfusione. Riperfusione successo è generalmente definito come CBF> 50% del valore basale CBF, ma, come con il flusso di occlusione, gli investigatori possono stabilire la propria criterio. Se gli animali mostrano una CBF inferiore al 50% della loro linea di base, è probabile che il MCA è 'permanente' occlusa, e quindi rappresenta un altro criterio di esclusione studio.
    3. Chiudere le due incisioni con punti di sutura 6.0 nylon. Fornire salina, anestetico (lidocaina), e gli antibiotici secondo le linee guida di roditori. Tuttavia, alcune piccole dosi di antibiotici (3 mg / kg di minociclina) sono stati trovati ad essere tratto neuroprotettivo seguenti. 26
  13. Dopo aver ripreso conoscenza in incubatrice riscaldato dopo l'intervento, posto topi in un ambiente pulito, gabbia sterile. Fornire foo inumiditoidratazione Integratori Alimentari gel d o nutrizionali e una capsula di Petri di acqua come gli animali saranno hanno limitato la mobilità dopo l'ictus. Monitorare gli animali da vicino durante il recupero per eccessivo dolore postoperatorio e la morte.

3. Blu di Evans (EB) Iniezione

  1. Iniettare EB 22 ore dopo riperfusione e deve circolare nel sangue per 2 ore prima del sacrificio e la colorazione TTC.
  2. Preparare una soluzione iniettabile EB (2% in soluzione salina EB) e mescolare delicatamente a temperatura ambiente. Filtro soluzione attraverso carta da filtro o spingere attraverso un filtro 0,2 micron attaccato ad una piccola siringa per rimuovere non disciolto EB e conservare a temperatura ambiente.
  3. Preparare la quantità necessaria di EB iniettabile (4 ml / kg di peso corporeo) Disegnare la quantità desiderata di colorante in una siringa da insulina 0,3 cc con un ago calibro 29 e assicurarsi che la soluzione sia a temperatura ambiente
    1. Trattenere mouse usando piatta restrainer fondo. Tenere la coda in modo che la vena laterale è uppermost. Vene laterali si trovano su entrambi i lati della mezzeria della coda. Tenere la punta della coda per mantenere costante il mouse per l'iniezione.
    2. Inserire l'ago nella vena di circa 3,5 millimetri, facendo attenzione a non forare la vena. Verificare che l'ago sia in vena disegnando indietro sulla siringa e alla ricerca di tracce di sangue.
    3. Iniettare tutta colorante nel corso di 1 min. Se la soluzione sta nella vena ci dovrebbe essere sempre minor resistenza, la pressione viene applicata alla siringa. Conferma di successo la somministrazione venosa sistemica di EB da un cambiamento di colore immediato coda, arti, e gli occhi del mouse.
    4. Rimuovere l'ago dalla coda e delicatamente applicare pressione con garza pulita al fine di fermare l'emorragia.
  4. Inizia tempi quando la pelle del topo diventa blu. Lasciare che la EB di circolare per 2 ore di penetrare il BBB indebolita.

4. 2,3,5- trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione

  1. Perfusione e TTC colorazione devono avvenire 24 ore dopo la riperfusione.
  2. Preparare una soluzione TTC 2% prima del tempo designato del sacrificio. Aggiungere 10 g di polvere TTC a 500 ml di 0,01 M tampone fosfato salino (PBS), pH 7,4. Soluzione Riscaldare a 37 ° C in bagno d'acqua per facilitare solubilizzante del TTC. ATTENZIONE: polvere TTC e la soluzione sono una pelle, polmoni, e l'occhio irritanti. Indossare dispositivi di protezione adeguati durante la manipolazione di questi materiali.
    1. Una volta che la polvere si è completamente sciolta, trasferire immediatamente ad una bottiglia, copertina in carta stagnola, e conservare a 4 ° C. TTC e tessuti colorati con TTC sono sensibili alla luce.
  3. A 24 ore dopo tMCAo e 2 ore dopo la somministrazione EB, sacrifica l'animale con una dose eccessiva isoflurano in una piccola camera di induzione. Perfusion dovrebbe iniziare immediatamente dopo sacricice per minimizzare autolisi che inizia in assenza di ossigeno dopo la morte.
  4. Garantire rapidamente l'animalesu una piattaforma di polistirolo con avambracci appuntate tra le zampe. Tagliare una incisione laterale attraverso la parete addominale dalla linea mediana appena sotto la gabbia toracica. Tagliare con cautela attraverso il diaframma per esporre il cuore.
    1. Avviare la pompa di perfusione a 5 ml / min di portata con una siringa da 60 cc riempito con ghiaccio freddo 0,01 M PBS e collegato ad un calibro 27 alata infusione ago. Posizionare la punta dell'ago circa 0,5 cm nel ventricolo sinistro del cuore e tagliare l'atrio destro. Progressivamente sangue venoso diluito deve fuoriuscire dell'atrio durante la perfusione finché appare sangue venoso incolore. Transcardially profumato 30 ml 0,01 M tampone fosfato salino (PBS) attraverso il cuore.
  5. Aggiungere 5 ml di soluzione TTC in 20 bottiglie trasparenti scintillazione.
  6. Subito dopo la perfusione, decapitare gli animali e sezionare le cervella con piccoli forbici e una spatola, se necessario. Esaminare il cervello per escludere gli animali che hanno subito hemorrha subaracnoideage presso il Circolo di Willis, secondaria di sutura. Controllare che il controlaterale emisfero occluso MCA appare pallido, senza subire perdite EB o edema.
  7. Versare PBS in una matrice acrilica cervello progettato per rendere 1,0 millimetri di spessore sezioni coronali di cervello di topo. Posizionare il cervello, lato dorsale fino, nella matrice e versare immediatamente PBS nel cervello. Mantenere il cervello umido.
    1. Rimuovere bulbi olfattivi inserendo un acciaio 0,21 millimetri lama spessa nel secondo alloggiamento dalla rostrale della matrice.
    2. Rimuovere il cervelletto inserendo una lama nel quarto alloggiamento dalla caudale della matrice.
    3. Inserire una lama nella fessura mezzo rimanenti slot nella matrice. Inserire le rimanenti lame, uniformemente biseca la restante tessuto per garantire la più uniforme distribuzione del tessuto durante il taglio.
    4. Una volta che tutte le lame sono state inserite, aggiungere 1-2 gocce di PBS al cervello per inumidire.
    5. Rimuovere la lamas uno alla volta dalla matrice che inizia con la regione rostrale. Mantenere i primi 7 fette di analisi TTC dopo tMCAo. Utilizzare una piccola spatola per trasferire accuratamente le fette dalla lama alla fiala TTC-riempita.
  8. Dopo che tutte le sezioni sono nel flacone, tappare e metterlo in un bagno di acqua calda fino sezioni diventano rosa. Ruotare delicatamente il flacone nel bagno se necessario per evitare sovrapposizioni sezione, che potrebbe portare a colorazione non uniforme. Poi smaltire il TTC e versare una soluzione di paraformaldeide al 4% nel flaconcino per coprire le sezioni di cervello di interrompere la reazione chimica TTC.
  9. Organizzare immediatamente le sezioni su un pulito 1 "x 3" vetrino e orientare sezioni da rostrale a caudale.
    1. Quando le sezioni sono disposte sul vetrino, la scansione della diapositiva utilizzando uno scanner standard. Impostare la risoluzione a un minimo di 600 dpi per l'analisi delle immagini. Assicurati di includere il nome dell'animale e un righello metrico nell'immagine acquisita.
    2. Capovolgere il vetrinoe la scansione del lato posteriore per garantire che tutti i dati sono raccolti.

5. Infarto Volume Quantificazione

  1. Quantificare il volume dell'infarto utilizzando un software di analisi di immagine standard (ad esempio, ImageJ).
  2. Scansione di immagini ad alta risoluzione (ad esempio, 600 dpi) per l'analisi adeguata. Ritagliare le immagini. Standardizzare la scala per tutte le immagini utilizzando il righello metrico incluso nel l'immagine acquisita.
  3. Calcolare il volume totale dell'emisfero controlaterale utilizzando la seguente formula. Ripetere questa formula per calcolare il volume totale dell'emisfero ipsilaterale.
    Somma di emisfero controlaterale totale di ogni fetta di spessore x fetta
  4. Calcolare il volume dell'infarto indiretta. . Controllo per l'edema ipsilaterale dal tratto utilizzando il sano, emisfero controlaterale come controllo 27 Utilizzare la seguente formula per calcolare il volume dell'infarto indiretta:
    Il volume totale di emisfero controlaterale -
    (Volum totalee di emisfero ipsilaterale medi di equipaggio volume di 3 misure di infarto)

6. barriera emato-encefalica (BBB) ​​Integrità Quantificazione

  1. Per preparare EB quantificazione, prima pesare 2,5 pollici pesa barche. Registrare il peso ed etichettare due pesare barche per ciascun animale: uno per l'emisfero ipsilaterale e uno per l'emisfero controlaterale.
  2. Dopo la scansione delle sezioni TTC-colorate, bisecare ogni sezione con una lama di rasoio usa e getta in emisferi ipsilaterale e controlaterale. Posizionare gli emisferi omolaterale di tutte le 7 sezioni in una barca pesare e registrare il peso. Ripetere l'operazione per l'emisfero controlaterale.
  3. Trasferire immediatamente le barche peso a un set forno per 56 ° C per 48 ore.
  4. Pesare sezioni secchi. Trasferire entrambi gli emisferi in provette da 1,5 ml microcentrifuga separati.
    1. Calcolare la quantità di formammide necessaria per ciascun emisfero (8 ml / g di tessuto secco), e aggiungere al rispettivo microcentrifugtubi e. Formammide è sensibile alla luce e coprire tutti i campioni formammide trattati in fogli da questo punto in poi.
    2. Trasferire i microprovette di un incubatore a 56 ° C per un altro 48 ore.
  5. Dopo la 48 ore, pipetta il surnatante blu in un altro set di microprovette etichettati. Spingere il tessuto alla parte inferiore del tubo per massimizzare il volume di supernatante estratto. Mantenere i tubi di surnatante e smaltire tutti i tessuti.
  6. Preparare diluizioni seriali esponenziali di EB in formammide per la curva standard. Include uno vuoto (formammide solo) e poi 10 soluzioni esponenziali da 0.125 ug / ml a 64 ug / ml di EB in formammide.
    1. Pipettare 300 ml di diluizioni effettuate per la curva standard in una piastra a 96 pozzetti. Dispensare 300 ml di surnatante in pozzetti.
    2. Misurare l'assorbanza su uno spettrofotometro a 620 nm.
    3. Confrontare la curva standard delle diluizioni EB con l'assorbanza of i campioni surnatante. La densità ottica è direttamente proporzionale alla integrità della BBB.
    4. Si supponga che la densità ottica dell'emisfero controlaterale come sfondo e utilizzare la formula (ipsilaterale-controlaterale) / controlaterale per determinare cambiamenti piega. Per ulteriori informazioni su analisi statistiche vedere Martin et al., 2010. 18

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Risultati

Questo studio ha incluso 25 topi maschi Swiss Webster che erano 10 settimane di età all'inizio di randomizzazione in RHP (n = 10) o il 21% O 2 (n = 15) gruppi. Due settimane dopo l'esposizione finale RHP, sono stati eseguiti interventi chirurgici, con i gruppi in cieco e controbilanciato tra i giorni. Dopo tMCAo, 1 topo morto durante il recupero post-operatorio e 1 mouse è stato escluso dallo studio perché non soddisfa il criterio di riperfusione CBF. Entrambi i mouse sono stati esclusi dal gruppo ...

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Discussione

Una singola esposizione ad ipossia sistemica (ad esempio, 2 ore del 11% O 2) in topi "transitoriamente" protegge il cervello da tMCAo, 29 cioè la risposta epigenetico alla sfida precondizionamento ipossico è di breve durata, e il fenotipo di base viene ripristinata entro giorni. Presentazioni ripetitive dello stimolo precondizionamento ipossico estendono notevolmente la durata del fenotipo neuroprotettivo. 6 Molti studi hanno dimostrato che la frequenza, ampiezza e d...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Flowmeters, regulatorsVetEquip, IncSpecialty orderFour flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench.
21% O2 tankAirGasOX USP200
11% O2 tankAirGasSpecialty order
8% O2 tank AirGasSpecialty order
15 L induction chambersVetEquip941454
Moor Laber Dopper Flow Moor Instruments moorVMS-LDF1-HP0.8 mm diameter probe 
High Intensity Illuminator NikonNI-150
Zoom Stereo Microscope NIkonSMZ800Other surgical microscopes may be used. 
Kent Scientific Right Temperature CODAKent Scientific CorporationDiscontinuedRecommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
Hovabator IncubatorStromberg's2362-EOur model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. 
V010 Anesthesia system VetEquip901807Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters
250 ml isoflurane Butler ScheinNDC-11695
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer Andis #23905Replacement blades are available from Andis (#23995)
Betadine Fisher Scientific19-898-867 
Q-tipsMultiple sellers Catalog number not available 
Gauze PadsFisher Scientific67622
Surgical drapeFisher ScientificGM300 
Silk Sutures Look/Div Surgical SpecialtiesSP115
Nylon SuturesLook/Div Surgical SpecialtiesSP185
Durmont #5 forceps (2) Fine Science Tools 11251-35Angled 45°
Surgical ScissorsFine Science Tools 14028-10
3 mm VannasKent Scientific CorporationINS600177Straight blade
Hartman Hemostats Fine Scientific Tools13002-10
Occluding filamentsWashington UniversitySpecialty orderFilaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. 
Evans BlueSigma AldritchE2129-10G
Filter Paper Sigma AldritchWHA1001150150 mm, circles, Grade 1 
Weigh BoatsFisher Scientific02-202-1012.5" diameter
0.9% Sodium Chloride Injection USP Baxter Pharmaceutics 2B1321
0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needleBecton Dickinson Labware309301
Flat bottom restrainer Braintree Scientific FB M2.0" diameter
TTCSigmaT8877
10x PBS, pH 7.4Fisher ScientificBP399-20
Water BathMultiple sellers Catalog number not available Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath.
Styrofoam boardMultiple sellers Catalog number not available 
Large Syringe KitPumpSystems IncP-SYRKIT-LG
Perfusion PumpPumpSystems IncNE-300 
60 cc syringeFisher ScientificNC9203256
27 gauge winged infusion setKawasumi Laboratories, IncD3K1-25G 1
20 ml scintillation vialFisher Scientific50-367-126
Stainless steel spatulaFisher Scientific14-373-25A
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronalCellPoint Scientific Catalog number not available 
0.21 mm stainless steel blades, 25 pkCellPoint Scientific Catalog number not available Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative.
4% paraformaldehydeSanta Cruz Biotechnology SC-281692
Superfrost microscope slides Fisher Scientific12-550-15
HP Scanjet G4050Multiple sellers Catalog number not available Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol.
ImageJ National Institute of HealthCatalog number not available 
Analytical BalanceMettler Toledo XSE 205U
Precision Compact Oven  Thermo Scientific PR305225M
1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs)Denville Scientific C2170
FormamideFisher ScientificBP228-100
96-well platesFisher Scientific07-200-9
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Catalog number not available 

Riferimenti

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