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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Zusammenfassung

Experimentellen Tiermodellen von Schlaganfall sind wertvolle Werkzeuge für das Verständnis Schlaganfall Pathologie und Entwicklung wirksamerer Behandlungsstrategien. A 2 Wochen Protokoll für sich wiederholende hypoxischen Präkonditionierung (RHP) induziert langfristigen Schutz gegen das zentrale Nervensystem (ZNS) verletzt in einem Mausmodell der fokalen ischämischen Schlaganfall. RHP besteht aus 9 stochastischen Belichtungen auf Hypoxie, die sowohl in der Zeitdauer (2 bzw. 4 h) und die Intensität (8% und 11% O 2) zu variieren. RHP reduziert Infarktvolumen, Blut-Hirn-Schranke (BHS) Störung, und die nach einem Schlaganfall entzündliche Reaktion für Wochen nach dem letzten Auftreten von Hypoxie, was auf eine langfristige Induktion einer endogenen ZNS-Schutz Phänotyp. Die Methodik für die Dual-Quantifizierung der Infarktvolumen und BBB Störung wirksam ist bei der Beurteilung der neurovaskulären Schutz bei Mäusen mit RHP oder andere vermeintliche Neuroprotektoren. Erwachsene männliche Swiss Webster-Mäuse wurden durch RHP oder Dauer-äquivalenten Belichtungen auf 21% O vorkonditioniert (dh Raumluft). A 60 min transiente mittleren Hirnarterie (tMCAo) wurde 2 Wochen nach der letzten induzierten hypoxischen Exposition. Sowohl der Okklusion und Reperfusion wurden durch transkranielle Laser-Doppler-Flussmessung bestätigt. Zweiundzwanzig Stunden nach der Reperfusion, Evans Blue (EB) wurde intravenös durch eine Injektion in die Schwanzvene verabreicht. 2 Stunden später wurden die Tiere mit Isofluran Dosierung und Gehirnschnitte geopfert wurden mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) angefärbt. Infarkte Volumina wurden dann quantifiziert. Als nächstes wurde EB aus dem Gewebe über 48 Stunden extrahiert, um BBB-Störung nach tMCAo bestimmen. Zusammenfassend ist RHP ein einfaches Protokoll, repliziert werden kann, mit minimalen Kosten, um langfristige endogenen neurovaskulären Schutz vor Schlaganfall Verletzungen bei Mäusen zu induzieren, mit der Translationspotential anderen ZNS-basierte und systemische proinflammatorische Krankheitszuständen.

Einleitung

Als die führende Ursache für Invalidität bei Erwachsenen und die vierte führende Ursache des Todes ist der Schlaganfall eine der am stärksten beeinträchtigenden Krankheitszuständen vor der erwachsenen Bevölkerung der Vereinigten Staaten. 1 Tiermodellen von Schlaganfall ermöglichen experimentelle Erforschung neuer Methoden zur Reduzierung ischämischer Verletzung und Verbesserung der post-Wiederherstellung nach Schlaganfall. Ein neuartiger Weg für solche translationale Forschung ist Präkonditionierung. Vorkonditionierung ist die vorsätzliche Verwendung eines nicht-schädigenden Stimulus, um Schäden durch eine nachfolgende, und schwerer, Verletzungen zu vermeiden. 2 hypoxische Präkonditionierung hat sich gezeigt, pleiotrope Veränderungen im Gehirn, die Schutz vor Schlaganfall in vivo und in vitro Studien in produzieren . 3 jedoch eine einzige Forderung zu Hypoxie bietet nur kurzfristige Neuroprotektion, induzieren weniger als 72 Stunden von Toleranz gegenüber Ischämie in erwachsenen Mäusen. 4 Auch nach vier Wochen 14 Stunden tägliche Exposition bis hypobaren Hypoxie, Lin et al. found dass die Neuroprotektion wurde nur für eine Woche. 5 Repetitive hypoxischen Präkonditionierung (RHP) aufrechterhalten wird durch stochastische Schwankungen der Häufigkeit, Dauer und Intensität der hypoxischen Exposition aus. Im Gegensatz zu einem einzigen Präkonditionierung Herausforderung, RHP induziert eine cerebroprotektive Phänotyp, für bis zu 8 Wochen bei Mäusen. 6 RHP reduzierte Infarktvolumen, Blut-Hirn-Schranke (BHS) Störungen, Gefäßentzündung, und Leukozyten Diapedese für Wochen nach der letzten hypoxischen Exposition . RHP spezifisch verringert Entzündungen im ischämischen Gehirn durch Reduzieren T-Zelle, Monozyt und Makrophage-Populationen, und gleichzeitig B-Zellpopulationen in der ischämischen Hemisphäre. 7 Tatsächlich induzierte RHP immunsuppressiv Phänotyp bei Mäusen vor einer ZNS-Verletzung, einschließlich Schlaganfall. RHP-behandelten B-Zellen aus RHP-behandelten gesunden Mäusen isoliert zeigte eine einzigartige entzündungshemmende Phänotyp, mit einer Herabregulation der beiden Antigen-Präsentation und Antikörperproduktion. DieGesamtreduzierung der proinflammatorischen adaptiven Immunmechanismen macht RHP eine hervorragende Methode, um die endogene Immunsuppression nicht nur für ZNS-spezifische Entzündungserkrankungen zu induzieren, aber auch systemische Verletzungen oder Krankheitsmodelle, die eine pro-inflammatorischen Pathologie gehören.

RHP reduziert sowohl Infarktvolumen und BBB Störung nach einer transienten mittleren Hirnarterie (tMCAo). Tiermodellen von Schlaganfall, wie die üblicherweise verwendeten tMCAo, dramatisch verbessern das Verständnis der Pathophysiologie von Schlaganfall, sowie die Gestaltung effektiver Neurotherapie. Zuerst von Koizumi et al., 1986, 8 die tMCAo Verfahren ein weit verbreitetes Verfahren zur Induzierung von Schlaganfall bei Nagern und eine der bevorzugten Methoden zur Untersuchung von Entzündungen nach Reperfusion. Da die Methoden zur tMCAo entwickeln, die neuere Verwendung von silikonbeschichteten Filamente weiter zu reduzieren das Risiko einer Subarachnoidalblutung Vergleich zu anderen Modellen 9,10 </ Sup> und die Zuverlässigkeit zu erhöhen, wenn auch leider tMCAo oft produziert eine breite Variation in der Infarktvolumen 11-13. Die meisten dieser Studien Abgrenzung Infarkt Regionen in koronalen Hirnschnitten durch Färbung mit 2,3,5- Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), als Gold-Standard für die Quantifizierung der Infarkt, weil es ist eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, um lebendige, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. TTC dient als Substrat in Mitochondrien Dehydrogenasen. Bei Gehirnschnitten sind dem TTC-Lösung ausgesetzt wird, wird TTC selektiv in lebende Zellen aufgenommen, wo ihre nichtlöslichen Reduktionsprodukt, Formazan- fällt auf eine tiefrote Farbe in lebensfähige Mitochondrien. Wegen mitochondriale Dysfunktion in der ischämischen Gewebe bleibt diese Gewebe weiß, so dass für die Differenzierung von beschädigten und gesundem Gewebe. 14

RHP reduziert auch BBB Störung in der ischämischen Hemisphäre. 6 daher den doppelten Quantifizierung BBB Integrität innerhalb der gleichen bRegenfälle als TTC-basierte Infarktvolumen Bestimmungen 15 würde nützliche Informationen über die volle Wirksamkeit der körpereigenen Schutz und mögliche kausale Beziehungen zwischen BBB Störung und Infarkt in unbehandelten und behandelten Tieren zu schaffen. Der Zustrom von peripheren Blut durch einen gestörten BBB, sekundäre Schlaganfall, erhöht Leukozyten-Populationen, proinflammatorische Zytokine, oxidativer Stress, vasogenen Ödeme und hämorrhagischen Transformation in der ischämischen Hemisphäre, letztlich die Erhöhung der Infektionsraten und Mortalität bei Patienten mit ischämischem Schlaganfall . 16,17 Ein übliches Verfahren zur Messung der BBB Störungen in Tiermodellen ist durch Quantifizierung von Evans-Blau (EB) Farbstoff Leck in das Gehirn. 15,18-21 EB selektiv an Albumin, eine globuläre Proteinserum (MW = 65 kDa) das bedeutet nicht die BBB nicht überqueren in unverletzten Tiere 22. Nach ischämischen Schlaganfall, infiltriert EB das Gehirn, und fluoresziert bei 620 nm, so dass für die Messung der optischen Dichte within perfundierten verletzt Parenchym. 22. Die optische Dichte ist direkt proportional zu der Permeabilität der BBB bei EB aus der Post-mortem kortikalen Vaskulatur von transcardiac Perfusion gewaschen. Mit der unmittelbaren Bearbeitung der TTC-gefärbten Gehirn bei Tieren mit EB Applikation können sowohl die Infarktvolumen und BBB Störung effektiv quantifiziert werden. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass neuronale Schädigung und BBB Störung nicht gleichzeitige Prozesse in der post stroke Gehirn, 23,24, so dass die Auswahl der Tötungszeitpunkt ist ein wichtiger Gesichtspunkt.

Das folgende Protokoll beschreibt die RHP-Methode, die tMCAo Verfahren zur Induktion einer vorübergehenden Arterienverschluss, dass Modelle mittleren Hirnarterie Verschlüssen bei menschlichen Patienten, und die Dual histologischen Methoden zur Bestimmung der neuronalen und vaskulären Schlaganfall Verletzungen Endpunkte. TTC misst Zelltod und kumulative Gewebeschädigung, so dass für die Quantifizierung eines Gesamtinfarkt volume, während EB sieht die hemisphärische Quantifizierung BBB Schäden.

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Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) am UT Southwestern Medical Center, die von den National Institutes for Health (NIH) Politik für Versuchstiernutzung bleibt genehmigt.

1. Repetitive hypoxische Präkonditionierung

  1. Custom-Design vier Durchflussmesser für Gasreglern und heften sich an Standard 15 L Induktionskammern mit PVC-Rohre, Druckgas aus der Sauerstoff ermöglichen (O 2) Tanks, um über einen Einlasskanal in die Kammern fließen. Siehe Einrichtungen und Materialien für mehr Details über individuelles Design.
  2. Teilen Sie Mäusen in 2 Gruppen: Repetitive hypoxische Präkonditionierung (RHP) Gruppe, die Exposition gegenüber 8% und 11% O 2 zu empfangen, und der Kontrollgruppe, die Forderungen zu 21% O 2 (Raumluft) gleichzeitig empfangen. Siehe Tabelle 1 für die Variationen in der Frequenz, Intensität (8 und 11% O 2 21% O 2) und der Dauer (2 bzw. 4 h) RHP Belichtungen.
  3. Entfernen Sie die obere Filterdeckel aus jedem Käfig und setzen Sie den Käfig mit Futter und Wasser-Flaschen intakt, in den zu ihren jeweiligen O 2 Tanks verbunden Kammern. Schließen und sichern Sie den Deckel der Kammer.
    1. Öffnen Sie das Hauptgasventil für die Tanks und stellen Sie die Anfangsströmungs für jede Induktionskammer zu 2 l pro Minute (LPM) für die ersten 5 Minuten der Exposition. Reduzieren Sie die Durchflussrate auf 1 LPM für den verbleibenden Teil der Forderungen.
    2. Am Ende der Belichtung verringern die Durchflussleistung auf 0 LPM und Schließen des Gasventils für die Tanks.
    3. Öffnen Sie die Kammerdeckel und setzen Sie die Filter Deckel auf jedem Käfig. Legen Sie die Käfige in Standardgehäuse bis zum nächsten hypoxischen Exposition.
  4. Abspritzen jede Induktionskammer mit NPD (Steris) oder einer gleichwertigen Desinfektions- / Deodorant nach jedem Gebrauch.
  5. Setzen beide 21% und RHP Mäusen in der gleichen Tageszeit über einen Zeitraum von zwei Wochen, wie in Tabelle 1 beschrieben.

2. TransientMittleren Hirnarterie Occlusion (tMCAo)

  1. Siehe Diskussion um weitere Informationen über den Zeitpunkt der Schlaganfall nach der endgültigen RHP Exposition.
  2. Bereiten Sie eine aseptische Operation Arbeitsplatz. Sauberer Umgebung Arbeitsplatz mit 70% Ethanol oder einem gleichwertigen Desinfektions- und autoklaviert alle chirurgischen Werkzeugen.
    1. Die Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) Instrument, um relative Änderungen des zerebralen Blutflusses (CBF) zu messen. Einschalten des Heizkissen auf 37 ° C. Schalten Sie den Inkubator auf 34 ° C.
  3. Betäuben Mäusen mit einer kurzen Exposition gegenüber einer Mischung aus 4% Isofluran / 70% NO 2/30% O 2 in einer kleinen Induktionskammer. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch leichtes Kneifen der Pfote. Wenn die Maus zieht sich die Pfote, kehren die Maus an den Induktionskammer und weiter Isofluran Exposition.
  4. Entfernen Mäuse aus der Narkose Kammer und der Maus die Nase in die Bugnase schnell einfügen. Öffnen Sie den Gasfluss in den Nasenkegel, Verschließen Fluss zu den anesThesia Induktionskammer.
    1. Ohne dabei die 70% NO 2/30% O 2 Gasgemisch, fix Isofluran 1,8% als Erhaltungsdosis für den Rest des Verfahrens. Die Atmung sollte langsam und während des gesamten Verfahrens bleiben, aber wenn regelmäßige Atmung schnell und flach, erhöhen Sie die Isofluran-Dosis. Erhaltungsdosis zwischen Apparatebau und Tier in dem Experiment verwendet variieren.
  5. Mit Hilfe eines microshaver, rasieren die Haare auf der Schläfengegend zwischen der Ecke des Auges und des Ohres sowie ventralen Mittellinie des Halses. Entfernen Sie überschüssiges Fell und gelten okulare Gleitmittel mit einem sterilen Wattestäbchen, um die Hornhaut vor dem Austrocknen während des Verfahrens zu halten. Wischen Sie Schnittbereich mit Alkohol Pads und Tupfer Providon-Jod mit einem sterilen Wattestäbchen, um keimfreien Bedingungen zu halten.
  6. Verwalten Analgetika nach Nagetier chirurgischen Richtlinien.
  7. Einen Einschnitt durch die zeitliche Haut zwischen dem Auge und dem Ohr.Setzen Sie den M. temporalis. Verwendung chirurgische Mikro Schere, schnitt die Schläfenmuskel Bänder im zeitlichen Grat im Bereich der Weißmuskel Streifung.
    1. Schieben Sie die Muskelmasse seitlich mit einer Pinzette, um die Arteria cerebri media (MCA) durch den Schädel zu visualisieren. Nach Inzision der Schläfenmuskel kann die Fläche mit Blut zu füllen. Benutzen Sie vorsichtig mit einem Wattestäbchen, um eine mögliche Blutung zu stillen.
    2. Ziel das die LDF Sondenspitze mit der VKA-Bereich. Notieren Sie den gewählten da dieser Bereich variiert zwischen Mäusen Schiff.
    3. Halten Sie die LDF vorhanden und bündig mit dem Schädel, bis ein stabiler roter Blutkörperchen Fluss gelesen und notieren Sie diesen Wert als Basislinie CBF. Ideal Basis CBF auf einem Laser-Doppler-Flowmetrie sind> 600 Flussmittel, aber das wird mit Hersteller variieren. Falls der Ausgangswert CBF <400 Flusses ist die Strömungs Aufnahme von einem nahe gelegenen Vene oder einer unvollständigen Platzierung der Sonde über dem Zielgefäß am wahrscheinlichsten.
  8. Nach dem Baseline-CBF hergestellt ist, repositian der Maus, so daß der Hals freigelegt wird. Unterstützen Sie den Kopf und halten Sie die Maus unter stationären Anästhesie aus dem Nasenkonus.
  9. Machen Sie eine ventralen Mittellinienschnitt von knapp unter dem Unterkiefer bis zum Schlüsselbein.
    1. Mit einer Pinzette, stumpf sezieren alle oberflächliche Faszie, um die linke Arteria carotis communis (CCA) aussetzen. Trennen Sie die CCA vom Bindegewebe und den Vagusnerv.
    2. Dauerhaft ligieren die CCA mit einem 6,0 Seidenfaden. Legen Sie die Nahtligation als proximal wie möglich, um genügend Platz zum Verschließen Filament Platzierung zu ermöglichen.
    3. Loop und locker binden einen zweiten Seide 6,0 Nahtmaterial um das CCA distal zu dem verschließenden Naht. Achten Sie darauf, um die Arterie zu verschließen, wie das verdeckende Filament wird anschließend durch die Halsschlagader eingefädelt werden.
    4. Verwenden Sie einen 8 x 2 mm Lichtmikro serrafine areterial Haken, um den CCA distal der lose gebunden Seidenfaden zu klemmen. Gently heben Sie die CCA mit einer Pinzette und einen kleinen Längsschnitt, als proximal der Ligatur-Nahtmaterialmöglich mit 3 mm Vannas.
    5. Führen Sie eine 12 mm silikonbeschichteten 6,0 Gauge Nylonverdeck Filament durch den Einschnitt, um die Arterie Lumen eingeben und dann voran es ein paar mm. Die zweite losen Seidenfaden lose anziehen um die Spitze des verdeckenden Faden um den Blutfluss zu gewährleisten nicht drücken Sie den Faden aus dem CCA und entfernen Sie die Arterienklemme.
    6. An der ersten Gabelung der CCA in die Arteria carotis interna (ICA) und der A. carotis externa (ECA), führen Sie das verdeckende Faden in den rechten Ast der ersten Gabelung, um dem ICA.Advance dem verschließenden Filament 9 bis 10,5 mm Vergangenheit geben der zweite Seidenfaden in die linke Arteria carotis interna (ICA).
    7. Kurz nach Eingabe der ICA, vorab die verdeck Faden in die linke Zweig in der zweiten Gabelung zwischen der ICA und dem pterogopalantine Arterie (PPA). Visualisierung des PPA ist unwahrscheinlich, so gehen, bis Sie einen leichten Widerstand bei Vollplatzierung des verdeckenden Filament fühlen.Anheben des ICA mit einer Pinzette kann helfen, das Filament um leichter in den linken Ast der zweiten birfurcation fädeln. Ziehen Sie die zweite Seidenfaden.
    8. Drehen Sie die Maus so der Schnitt über dem MCA zu sehen ist. Mit der LDF Ausrüstung, bestätigen, dass die CBF durch LDF Lesungen blockiert. Eine erfolgreiche Okklusion ist eine Reduktion> 80% vom Ausgangswert CBF.
    9. Ganz fest und doppelklicken Knoten die zweite Seidenfaden um den verschließenden Filament, wenn die richtige Position erreicht ist. Falls erforderlich, drücken Sie leicht in oder ziehen Sie den Faden zu verschließenden CBF Kriterien für eine erfolgreiche Okklusion (zB> 80% Reduktion gegenüber dem Ausgangs CBF) zu erreichen.
    10. Schließen Sie den Hals und Kopf Öffnung mit 6,0 Nylon-Nähte.
  10. Ort Mäuse im 34 ° C Inkubator für die Dauer der Okklusion. Empfohlene Länge Okklusion 60 min, aber das variiert nach Alter, dehnungsabhängige Unterschiede in der Hirnanatomie, 25 und das Ausmaß der injury gewünschte (leicht, mittel, schwer). Stellen Sie sicher, dass die Tiere wieder zu Bewusstsein innerhalb von Minuten kommen aus der Narkose.
  11. Re-betäuben die Tiere mit Isofluran, wie in Schritt 2.3 beschrieben, 5 min vor dem Ende des vorgegebenen Zeitraums Okklusion, öffnen Sie den Kopfhauteinschnitt und bestätigen, dass der MCA Perfusion ist immer noch mit der transkraniellen LDF Messwerte reduziert. Wenn CBF nicht ausreichend reduziert (zB <20% des Ausgangs CBF) hat die MCA zu irgendeinem Zeitpunkt während der Okklusion reperfundiert und die Maus von der weiteren Experimenten ausgeschlossen.
  12. Öffnen die Mittellinie Halsschnitt auf und lose binden eine dritte Seidennaht um die CCA, distal zu dem zweiten Seidennaht aber proximal zu dem CCA Gabelung, um sicherzustellen, dass die externe Halsschlagader (ECA) lebensfähig bleiben, nachdem das Filament entfernt wird.
    1. Schneiden Sie oder lösen Sie den Knoten, der den verschließenden Faden (dh zweite Seidennaht) hält und langsam herausziehen, verschließenden Filament. Einmal entfernt, schnell schließen diedritte Seidennaht um die CCA, um einen Rückfluß von Blut aus der ICA minimieren. Doppel-Knoten diese Naht, und schließen Sie den Schnitt mit 6,0 Nylon-Nähte.
    2. Positionieren Sie die Maus, um das Niveau der CBF nach 5 min der Reperfusion zu quantifizieren. Erfolgreicher Reperfusion wird allgemein als CBF von> 50% des Ausgangswertes CBF definiert ist, sondern, wie bei Okklusion Strömung kann Ermittler eigene Kriterium aufzubauen. Wenn Tiere weisen eine CBF unter 50% ihres Ausgangs, ist es wahrscheinlich die MCA ist "dauerhaft" verschlossen und damit eine weitere Studie Ausschlusskriterium darstellt.
    3. Schließen Sie beide Schnitte mit 6,0 Nylon-Nähte. Bereitzustellen Salzlösung, Anästhetikum (Lidocain) und Antibiotika nach Nagetier Richtlinien. Doch einige kleine Dosen von Antibiotika (3 mg / kg von Minocyclin) haben sich als neuroprotektive folgenden Schlaganfall. 26
  13. Nach wieder bei Bewusstsein ist im beheizten Inkubator nach der Operation statt Mäuse in einem sauberen, sterilen Käfig. Bieten angefeuchteten food oder Nahrungsergänzungsmittel Trinknahrungs Gel und eine Petrischale von Wasser als den Tieren wird die Mobilität eingeschränkt nach Schlaganfall. Überwachung Tiere eng während der Wiederherstellung auf übermäßigen postoperativen Schmerz und Tod.

3. Evans Blue (EB) Injection

  1. Injizieren EB 22 Stunden nach der Reperfusion und sollte in den Blutkreislauf für 2 Stunden vor der Tötung und TTC-Färbung zu zirkulieren.
  2. Machen Sie ein EB-Injektionslösung (2% EB in Kochsalzlösung) und vorsichtig bei Raumtemperatur. Filter-Lösung durch Filterpapier oder Push durch ein 0,2 um Filter zu einer kleinen Spritze, um ungelöste EB zu entfernen und bei Raumtemperatur lagern angebracht.
  3. Bereiten Sie die Menge EB Injektions Bedarf (4 ml / kg Körpergewicht) Zeichne die gewünschte Menge des Farbstoffs in eine 0,3 cc-Insulinspritze mit einer 29-Gauge-Nadel, und sicherzustellen, dass die Lösung bei Raumtemperatur
    1. Zurückhalten Maus mit Flachboden-Rückhalteeinrichtung. Halten Sie den Schwanz, so dass die seitlichen Ader ist uppäußersten. Seitenrippen sind auf jeder Seite der Mittellinie des Endstücks befindet. Halten Sie die Spitze des Schwanzes, um die Maus stetigen zur Injektion zu halten.
    2. Führen Sie die Nadel in die Vene ca. 3,5 mm, man aufpassen, nicht, um die Vene zu perforieren. Bestätigen Sie, dass sich die Nadel in der Vene durch Zurückziehen der Spritze und auf der Suche nach Spuren von Blut.
    3. Injizieren der gesamte Farbstoff im Verlauf von 1 min. Wenn die Lösung in die Vene des Hinwegs sollte minimal Widerstand, wenn Druck auf die Spritze angewendet wird. Bestätigen erfolgreiche systemischen venösen Verabreichung von EB durch eine sofortige Farbänderung in den Schwanz, Gliedmaßen, Augen und der Maus.
    4. Entfernen Sie die Nadel aus dem Schwanz und sanft Druck auszuüben mit sauberen Gaze, um die Blutung zu stoppen.
  4. Beginnen Sie Zeit, wenn die Haut der Maus wird blau. Lassen Sie den EB zirkulieren 2 h, um den geschwächten BBB eindringen.

4. 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Staining

  1. Perfusion und TTC-Färbung sollte 24 Stunden nach der Reperfusion auftritt.
  2. Bereiten Sie eine 2% TTC Lösung vor dem festgelegten Zeitpunkt des Opfers. 10g TTC Pulver zu 500 ml 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4. Wärme Lösung auf 37 ° C im Wasserbad zu solubilisierende des TTC erleichtern. ACHTUNG: TTC-Pulver und Lösung sind eine Haut, Lunge, und augenreizend. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung beim Umgang mit diesen Materialien.
    1. Nachdem das Pulver vollständig gelöst hat, sofort in einer Flasche, Abdeckung mit Folie und Einspeicherung bei 4 ° C. TTC und Gewebe mit TTC gefärbt sind lichtempfindlich.
  3. Bei 24 Stunden nach tMCAo und 2 Stunden nach der EB Verwaltung, zu opfern das Tier mit einer Überdosis Isofluran in einer kleinen Induktionskammer. Perfusion sollte unmittelbar nach sacricice um Autolyse, die in Abwesenheit von Sauerstoff nach dem Tod beginnt zu minimieren beginnen.
  4. Sichern schnell das Tierauf einem Styropor-Plattform mit Unterarmen durch den Pfoten festgesteckt. Schneiden Sie einen seitlichen Schnitt durch die Bauchdecke von der Mittellinie direkt unter dem Brustkorb. Vorsichtig durch die Membran geschnitten, um das Herz freizulegen.
    1. Starten Sie den Perfusionspumpe bei 5 ml / min Volumenstrom mit einer 60-ml-Spritze gefüllt mit Eis kalt 0,01 M PBS und angeschlossen an eine 27 Gauge geflügelten Infusionsnadel. Setzen Sie die Spitze der Nadel etwa 0,5 cm in den linken Ventrikel des Herzens und schneiden Sie den rechten Vorhof. Schrittweise sollten verdünnt venöse Blut aus dem Vorhof während der Perfusion fließen, bis venöse Blut farblos erscheint. Transkardial perfundiert 30 ml 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch das Herz.
  5. 5 ml TTC Lösung in transparent 20 Szintillations-Flaschen.
  6. Unmittelbar nach Perfusion, enthaupten die Tiere und sezieren die Gehirne mit einer kleinen Schere und einem Spatel, wenn nötig. Untersuchen Sie die Köpfe, um Tiere, die subarachnoidale hemorrha unterzog ausschließenge im Kreis von Willis, sekundäre Naht Platzierung. Überprüfen Sie, dass die Halbkugel kontralateral zur verschlossenen MCA erscheint blass, ohne merkliche EB Auslaufen oder Ödeme.
  7. Gießen PBS in eine Acryl Gehirn Matrix entwickelt, um 1,0 mm dick koronalen Abschnitte eines Mäusegehirns zu machen. Legen Sie das Gehirn, Rückenseite nach oben in der Matrix und sofort gießen PBS über das Gehirn. Halten das Gehirn feucht.
    1. Entfernen der Riechkolben durch Einfügen eines aus rostfreiem Stahl von 0,21 mm dicke Klinge in den zweiten Schlitz von der rostralen Seite der Matrix.
    2. Entfernen des Kleinhirns, indem ein Blatt in der vierten Schlitz von der kaudalen Seite der Matrix.
    3. Legen Sie ein Blatt in den mittleren Schlitz der verbleibenden Zeitnischen in der Matrix. Legen Sie die restlichen Blätter, gleichmäßig halbiert das verbleibende Gewebe, um das Beste mäßige Verteilung der Gewebe während des Schneid gewährleisten.
    4. Nachdem alle Schaufeln eingefügt wurden, fügen 1-2 Tropfen PBS auf das Gehirn, um es zu befeuchten.
    5. Entfernen Sie das Blades eine zu einem Zeitpunkt von der Matrix beginnend mit der rostralen Bereich. Halten Sie die ersten 7 Scheiben für die TTC-Analyse nach tMCAo. Verwenden Sie einen kleinen Spatel sorgfältig übertragen Sie die Scheiben von der Klinge auf die TTC-Fläschchen gefüllt.
  8. Nachdem alle Abschnitte sind in der Ampulle, Kappe und legen Sie sie in einem warmen Wasserbad, bis die Abschnitte drehen rosa. Drehen Sie vorsichtig die Flasche in der Badewanne, wenn notwendig, Abschnitt überlappen, was zu einer ungleichmäßigen Färbung führen könnten, zu vermeiden. Dann entsorgen Sie das TTC und gießen Sie ein 4% Paraformaldehyd-Lösung in das Fläschchen, um Hirnschnitten bedecken, um die TTC chemische Reaktion zu beenden.
  9. Sofort ordnen Sie die Abschnitte auf eine saubere 1 "x 3" Glasobjektträger und richten Sie die Abschnitte von rostral nach caudal.
    1. Wenn die Abschnitte auf der Folie angeordnet sind, scannen Sie die Folie mit einem Standard-Scanner. Stellen Sie die Auflösung auf ein Minimum von 600 dpi für die Bildanalyse. Achten Sie darauf, den Namen des Tieres und ein Lineal in dem gescannten Bild enthalten.
    2. Flip über den Objektträgerund scannen Sie die Rückseite, um alle Daten gesammelt zu gewährleisten.

5. Infarktvolumen Quantifizierung

  1. Quantifizierung der Infarktvolumen mit Hilfe eines Standard-Bildanalyse-Software (zB ImageJ).
  2. Scannen von Bildern mit hoher Auflösung (zB 600 dpi) für eine angemessene Analyse. Zuschneiden von Bildern. Standardisierung der Maßstab für alle Bilder mit dem Lineal auf dem gescannten Bild enthalten.
  3. Berechnen des Gesamtvolumens der kontralateralen Hemisphäre Verwendung der folgenden Formel. Wiederholen Sie diese Formel, um das Gesamtvolumen des ipsilateralen Hemisphäre berechnen.
    Summe der Gesamt kontralateralen Hemisphäre jeder Scheibe x Schichtdicke
  4. Berechnen Sie die indirekte Infarktvolumen. . Steuerung für ipsilateral Ödem von Schlaganfall mit Hilfe der gesunden, kontralateralen Hemisphäre als Kontrolle 27 Verwenden Sie die folgende Formel, um die indirekte Infarktvolumen berechnen:
    Gesamtvolumen der kontralateralen Hemisphäre -
    (Total volume der ipsilateralen Hemisphäre -Mittlere Volumen von 3 Messungen der Infarkt)

6. Blut-Hirn-Schranke (BHS) Integrität Quantifizierung

  1. Um EB Quantifizierung vorzubereiten, zuerst wiegen 2,5-Zoll wiegen Boote. Das Gewicht und kennzeichnen zwei Boote wiegen für jedes Tier: eine für die ipsilaterale Hemisphäre und eine für den kontralateralen Hemisphäre.
  2. Nach dem Scannen der TTC-gefärbten Schnitten, halbieren Sie jeden Abschnitt mit einem Einweg Rasierklinge in ipsilateralen und contralateralen Hemisphären. Legen Sie die ipsilaterale Hemisphäre aus allen 7 Abschnitte in einem Boot wiegen und das Gewicht aufgezeichnet. Wiederholen Sie dies für kontralateralen Hemisphäre.
  3. Die Gewichts Boote unverzüglich in einem Ofen-Set für 56 ° C für 48 Stunden.
  4. Wiegen Sie die getrockneten Abschnitte. Bringen Sie beide Hemisphären in separate 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    1. Berechnen Sie die Menge an Formamid für jede Hemisphäre erforderlich (8 ml / g trockenes Gewebe), und in den jeweiligen microcentrifuge Röhren. Formamid ist lichtempfindlich und decken alle Formamid behandelten Proben in Folie von diesem Punkt an.
    2. Übertragen Sie die Reaktionsgefäße in einen Inkubator auf 56 ° C für weitere 48 h eingestellt.
  5. Nach 48 Stunden, pipettieren Sie das blaue Überstand in einem anderen Satz von markierten Mikrozentrifugenröhrchen. Push Gewebes am Boden des Röhrchens, das Volumen des extrahierten Überstandes zu maximieren. Halten Sie die Rohre des Überstandes und entsorgen Sie alle Gewebe.
  6. Vorbereitung exponentiellen seriellen Verdünnungen EB in Formamid für die Standardkurve. Fügen Sie 1 blank (Formamid), und dann 10 exponentiellen Lösungen von 0,125 ug / ml bis 64 ug / ml von EB in Formamid.
    1. Pipettieren von 300 & mgr; l der Verdünnungen für die Standardkurve hergestellt in einer 96-Well-Platte. Pipettieren von 300 ul des Überstands in die entsprechenden Vertiefungen.
    2. Die Extinktion mit einem Spektrophotometer bei 620 nm.
    3. Vergleichen Sie die Standardkurve der EB Verdünnungen mit der Absorption of den Überstandsproben. Die optische Dichte ist direkt proportional zu der Integrität der BHS.
    4. Angenommen, die optische Dichte der kontralateralen Hemisphäre als Hintergrund und verwenden Sie die Formel (ipsilateral-kontralateral) / kontralateral zur fache Änderung zu bestimmen. Für weitere Details über die statistische Analyse siehe Martin et al., 2010. 18

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Ergebnisse

An dieser Studie nahmen 25 männliche Swiss Webster-Mäuse, die 10 Wochen alt waren zu Beginn der Randomisierung in RHP (n = 10) oder 21% O 2 (n = 15) Gruppen. Zwei Wochen nach der letzten RHP Belichtung wurden chirurgische Verfahren durchgeführt, wobei Gruppen verblindet und zwischen den Tagen ausgeglichen. Nach tMCAo starb 1 Maus während der postoperativen Erholung und 1 Maus wurde von der Studie ausgeschlossen, weil sie nicht die Reperfusion CBF Kriterium erfüllen. Beide Mäuse waren ausgeschlossen von ...

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Diskussion

Eine einmalige Exposition, um systemische Hypoxie (dh 2 Stunden von 11% O 2) bei Mäusen "transient" schützt das Gehirn vor tMCAo, 29 bedeutet, die epigenetische Antwort auf die hypoxische Präkonditionierung Herausforderung ist von kurzer Dauer, und die Grundlinie Phänotyp innerhalb restauriert Tagen. Repetitive Präsentationen des hypoxischen Präkonditionierung Reiz dramatisch verlängern die Dauer der neuroprotektiven Phänotyp. 6 Viele Studien haben gezeigt, das...

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Flowmeters, regulatorsVetEquip, IncSpecialty orderFour flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench.
21% O2 tankAirGasOX USP200
11% O2 tankAirGasSpecialty order
8% O2 tank AirGasSpecialty order
15 L induction chambersVetEquip941454
Moor Laber Dopper Flow Moor Instruments moorVMS-LDF1-HP0.8 mm diameter probe 
High Intensity Illuminator NikonNI-150
Zoom Stereo Microscope NIkonSMZ800Other surgical microscopes may be used. 
Kent Scientific Right Temperature CODAKent Scientific CorporationDiscontinuedRecommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
Hovabator IncubatorStromberg's2362-EOur model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. 
V010 Anesthesia system VetEquip901807Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters
250 ml isoflurane Butler ScheinNDC-11695
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer Andis #23905Replacement blades are available from Andis (#23995)
Betadine Fisher Scientific19-898-867 
Q-tipsMultiple sellers Catalog number not available 
Gauze PadsFisher Scientific67622
Surgical drapeFisher ScientificGM300 
Silk Sutures Look/Div Surgical SpecialtiesSP115
Nylon SuturesLook/Div Surgical SpecialtiesSP185
Durmont #5 forceps (2) Fine Science Tools 11251-35Angled 45°
Surgical ScissorsFine Science Tools 14028-10
3 mm VannasKent Scientific CorporationINS600177Straight blade
Hartman Hemostats Fine Scientific Tools13002-10
Occluding filamentsWashington UniversitySpecialty orderFilaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. 
Evans BlueSigma AldritchE2129-10G
Filter Paper Sigma AldritchWHA1001150150 mm, circles, Grade 1 
Weigh BoatsFisher Scientific02-202-1012.5" diameter
0.9% Sodium Chloride Injection USP Baxter Pharmaceutics 2B1321
0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needleBecton Dickinson Labware309301
Flat bottom restrainer Braintree Scientific FB M2.0" diameter
TTCSigmaT8877
10x PBS, pH 7.4Fisher ScientificBP399-20
Water BathMultiple sellers Catalog number not available Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath.
Styrofoam boardMultiple sellers Catalog number not available 
Large Syringe KitPumpSystems IncP-SYRKIT-LG
Perfusion PumpPumpSystems IncNE-300 
60 cc syringeFisher ScientificNC9203256
27 gauge winged infusion setKawasumi Laboratories, IncD3K1-25G 1
20 ml scintillation vialFisher Scientific50-367-126
Stainless steel spatulaFisher Scientific14-373-25A
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronalCellPoint Scientific Catalog number not available 
0.21 mm stainless steel blades, 25 pkCellPoint Scientific Catalog number not available Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative.
4% paraformaldehydeSanta Cruz Biotechnology SC-281692
Superfrost microscope slides Fisher Scientific12-550-15
HP Scanjet G4050Multiple sellers Catalog number not available Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol.
ImageJ National Institute of HealthCatalog number not available 
Analytical BalanceMettler Toledo XSE 205U
Precision Compact Oven  Thermo Scientific PR305225M
1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs)Denville Scientific C2170
FormamideFisher ScientificBP228-100
96-well platesFisher Scientific07-200-9
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Catalog number not available 

Referenzen

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