Hibrid uCT-FMT görüntüleme ve görüntü analizi

Özet

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Özet

Floresan-aracılı tomografi (FMT) in vivo, floresan dağılımı uzunlamasına ve nicel tespitine olanak ve yeni sondaların biyolojik dağılımını değerlendirmek ve yerleşik moleküler problar ya da raportör genler kullanılarak hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için de kullanılabilir. örneğin, anatomik bir yöntemi ile kombine mikro bilgisayarlı tomografi (uCT), görüntü analizi için ve floresan rekonstrüksiyonu için faydalıdır. Biz nicel ölçümler ayıklamak için gerekli görüntü işleme aşamaları içeren multimodal uCT-FMT görüntüleme için bir protokol açıklar. Fareler hazırlanması ve görüntüleme yaptıktan sonra, çok modlu veri setleri kayıtlıdır. Daha sonra, gelişmiş bir floresans yeniden dikkate fare şeklini alır gerçekleştirilir. Kantitatif analiz için, organ segmentasyonları Etkileşimli segmentasyon aracını kullanarak anatomik verilere dayalı oluşturulan almaktadır. Son olarak, biyolojik dağılım Curves bir toplu işleme özelliğini kullanarak oluşturulur. Bu kemik ve eklemlerde bağlanan bilinen bir prob biyolojik dağılımını değerlendirerek yöntemin uygulanabilirliğini gösterir.

Giriş

Floresan aracılı tomografi olarak da adlandırılan floresan moleküler tomografi (FMT), kantitatif gibi anestezi fareler hatta insan vücut dokularında, örneğin, göğüsler ve parmak eklemlerinde olarak yaygın dokularda, floresan dağılımını değerlendirmek için gelecek vaat eden bir tekniktir. Hücre içi çözünürlükte ¹ de yüzeysel hedeflerin görüntüleme sağlayan non-invaziv mikroskopi teknikleri, aksine, FMT düşük çözünürlükte ² de olsa birkaç santimetre, derinliklerinde floresan kaynakların üç boyutlu rekonstrüksiyon verir. ^{5 -} Birçok hedeflenen floresan probları görüntü anjiyogenez, apoptoz, inflamasyon, ve diğerleri ² mevcuttur. Bazı problar, aktive edilebilir olup, örneğin., Florokromların unquenching giden özel enzim ayrılması yolu ile. Ayrıca, floresan proteinleri ifade raportör genler tümör hücre göçü ⁶ izlemek için, örneğin, görüntülü olabilir.

FMT kuvvetle, örneğin, ^2,7 veya MRG ⁸ uCT, anatomik bir modalite ile birlikte yararlanır. Tek başına FMT cihazları piyasada ⁹ mevcut iken, floresan görüntüleri anatomik referans bilgisi olmadan yorumlamak zordur. Son zamanlarda biz kaynaştırılmış anatomik görüntü verileri daha sağlam bir analiz ¹⁰ sağlayan, göstermek başardık. anatomik veriler aynı zamanda, doğru bir optik modellemesi ve floresan yeniden ¹¹ için önemli olan, fare, dış şekil olarak ön bilgi sağlamak için de kullanılabilir. Ayrıca, optik saçılma ve emilim haritaları doku tiplerinin segmentasyon kullanılarak tahmin ve sınıf özgü katsayılar ^12,13 atayarak edilebilir. Yakın-kızılötesi ışık için, hemoglobin melanin ve kürk ¹⁴ yanı sıra farelerde ana emici olduğunu. Göreceli kan hacmi büyüklüğe göre bölgesel farklılık olduğundan, bir emme haritası Quan için özellikle önemlidirtitative floresan rekonstrüksiyon ^13.

Invaziv olmayan görüntüleme cihazları kullanmanın bir avantajı, farenin çoklu zaman noktalarında, yani, uzunlamasına yansıması olmasıdır. Bu problar dinamik davranışı, yani hedef birikimi, biodistribution ve atılımı ^10,15 değerlendirmek için, ya da hastalığın ilerlemesini ¹⁶ değerlendirmek önemlidir. Birden fazla zaman noktalarında birkaç fareler görüntüleme, görüntü veri setlerinin büyük miktarda ortaya çıkar. Karşılaştırılabilirliği etkinleştirmek için aşağıdaki iyi tanımlanmış ve belgelenmiş protokol ile, sistematik bir biçimde, yani elde edilmelidir. taramaları çok sayıda görüntü verilerinden niceliksel ölçümler ayıklamak için gerekli olan görüntü analizi, bir sorun teşkil etmektedir.

Çalışmamızın amacı bazı çalışmalarda ^{10,13,15,17,18} boyunca biz kullanılan ve optimize bir uCT-FMT görüntüleme protokolü ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktır. Biz açıklamakveri setleri oluşturulur, nasıl, işlenmiş görüntülenmiştir ve analiz. Bu ^19, hidroksiapatite karşı bağlanan bir yerleşik moleküler prob, OsteoSense kullanılarak araştınlır ve görüntü kemik hastalıkları için kullanılabilir ve ² biçimlenme. Hayvanlarla ilgili tüm işlemler, hayvan bakımı konusunda hükümet inceleme komitesi tarafından onaylanmıştır.

Protokol

protokol, aşağıdaki adımları ayrıntılı bir açıklamasını içerir: İlk başta, hayaletler ya da fareler ve modelli fare yatak görüntüleme için hazırlanmıştır. Sonra tüm vücut taraması uCT elde edilir. Ardından fare yatakta iki taramaları (yukarı ve baş aşağı) elde edilir FMT aktarılır. Bu çoklu zaman noktalarında çok fareler için tekrar edilebilir. Veri toplama tamamlandıktan sonra, veri ihraç ve otomatik segmentasyon (a Definiens yazılım lisansı gerektiren) yanı sıra, görüntü füzyon ve (bir Imalytics Preklinik yazılım lisansı gerektiren) floresan yeniden etkinleştirmek için sıralanması gerekiyor. Sonunda organlar interaktif flüoresan biodistribution ölçmek için segmentlere nasıl multimodal veri setleri görsel ve nasıl gösterilir.

1. Phantom Hazırlık

Not: Phantom görüntüleme sistemi test etmek için yararlıdır, ama aynı zamanda fiili kalibrasyon belirlenmesiYeni prob r.

1. 200 mi su,% 2 agaroz, 1.8 g _TiO2 tozu, 50 ul tripan mavi bir çözelti hazırlayın. Kaynatıldıktan sonra yaklaşık 8 cm uzunluğunda, 3 cm genişliğinde ve 1.5 cm yüksekliğinde ve dikdörtgen forma çözeltisi doldurun.
2. Floresans ve uCT kontrast maddesinin bir karışımını ihtiva eden, pipet uçları kullanılarak hayali olarak çok sayıda floresan kusurları hazırlayın. Kapanım oluşturmak için, pipet uçları kesilmiş ve bir çakmak ile mühür.
3. Çözelti katılaşmış sonra, fantom içine kapanım yerleştirin. Düzensiz bir şekil elde etmek ve modelli fare sahibine sığdırmak için fantom bazı bölümlerini kesip.
4. Yeni prob için kalibrasyon faktörünü belirlemek için, bazı hayali taramaları gereklidir. Bunun için, varsayılan FMT fantom prob bilinen miktarları ile kombinasyon halinde kullanılır. Artan doğruluk için, gibi dahil içinde aynı saçılma katsayısı almak için çözüm% 4 lipid emülsiyonu ekleyinfantom geri kalanı. Ayrıca kolay görüntü analizi için uCT kontrast madde küçük bir miktar (% 2) ekleyin.

2. Fare Hazırlama

NOT: uCT-FMT görüntüleme anesthetization ve epilasyon gibi özel bir hazırlık gerektirir.

1. 7 gün görüntüleme önce klorofil içermeyen gıda fare yerleştirin. Bu arka plan sinyalini azaltmak ve 750 nm altında FMT kanalları için özellikle önemlidir olacaktır.
2. Tüm hayvan deneyleri anestezi altında yapılmaktadır. Fare uykuya dalmakta kadar hava (akış hızı 5 L / dk)% 2 izofluran ile dolu bir odasında fare yerleştirin anestezi başlatmak için. Nazik ayak veya deri sıkıştırarak ve kas tonusu gevşeme kontrol ederek (örneğin., Çene kası) uygun anesthetization onaylayın. Anestezi sürdürmek için, (bu oran 1 L / dak akış hava% 2 izofluran) fare burun üzerine yerleştirilen bir tüp kullanarak izofluran uygulama devam ediyor. Göz kuruluğa önlemek içins, anestezi fareler üzerinde veteriner merhemi kullanın.
3. Kontrast madde enjekte etmek, bant kullanarak bir ısıtma yastığı anestezi fare düzeltin. Kuyruk damarından bir kateter (bir tübe bağlı şırınga iğnesi) yerleştirin ve fluoresan kontrast maddesi enjekte (örneğin, 2 nmol, 5 ml maksimum enjeksiyon hacmi / kg vücut ağırlığı, örneğin, 30 g fare için 150 ul).
4. Tüylü fare taramak için, tarama alanı önceden tüyleri gerekmektedir. Bunun için, bir tıraş makinesi veya tüy dökücü krem ​​kullanın. Farelerin bazı suşları epilasyon kremi gelen döküntüleri gelişebilir. Bu nedenle, cilt değişiklikleri için fareler izlemek ve gerekirse bakım veteriner personeli başvurun. Yeni fare suşlar kullanılarak Ayrıca hayvanların az sayıda toleransı test edin.
5. (Oran 1 L / dak akış, havada% 2 izofluran) uCT ve FMT görüntüleme sırasında anestezi fare tutun.

3. Fare Yatak Hazırlık

NOT: uCT-FMT tarama için bir multimodal kullanınuCT ve FMT içine de uyuyor fare yatak.

1. Görüntüleme önce, ıslak mendil ile fare yatak temizleyin. Bu akrilik cam zarar verebilir, çünkü etanol kullanmayın. Bu otomatik işaretleyici algılama bozabilir, çünkü belirteçler suyun serbest olduğundan emin olun.
2. Multimodal fare yatağın vidaları açın ve üst kısmını kaldırın.
3. Fare yatakta anestezik gaz tüpünü takın ve bantla sabitleşmek.
4. Fare yatağa anestezi fare yerleştirin ve gaz tüpüne burun koydu. Farenin başı fare yatağının ön göstergesi (Şekil 1) olduğundan emin olun.
5. Fare optimal FMT görüş alanını kullanmak için fare yatağın ortasında olduğundan emin olun.
6. Fare yatak kapatın ve fare sıkıca tutulur kadar sıkın. Fare göğüs solunum hareketlerinin görsel izleme ile sürekli nefes emin olun.

4. uCT Imaging

NOT: tüm vücut taraması uCT kullanılarak yapılır. oluşturulan anatomik veriler, gelişmiş bir floresan yeniden ve görüntü analizi için, görüntü füzyonu için gereklidir.

1. UCT içine fare ile fare yatak yerleştirin. Fareyi uCT içine "kuyruk önce" gider şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Bu otomatik füzyon için önemlidir.
2. UCT-kapak kapandığında anestezi sürdürebilmek amacıyla, uCT durumunda yoluyla gaz kanal boruları yeniden bağlayın. İlk fare yataktan uzun tüp ayırmak ve uCT dışında en konnektörüne takın. Sonra uCT içinde konnektörüne kalan serbest ucunu takın.
3. UCT içine fare yatak sürün. Gaz boru gevşek değildir ve döner sehpanın tarafından yakalanmış alamadım emin olun. Gerekirse, bantla sabitleşmek. Fare yatağın sahibinin cut-out içine tüp yerleştirin.
4. UCT kapatın ve bir Topogram kazanır. Füzyon ve yeniden yapılanma için önemlidir ve fare yatak, önemli bir kısmını kapsayacak şekilde, en az iki subscans seçin.
5. Subscan başına 90 sn tarama süresi gerektiren bir tam dönüşü sırasında 1032 x 1012 piksel 720 projeksiyonları elde HQD-6565-360-90 adlı uCT tarama protokolü seçin. Tüpler gerilimi 65 kV ve akım 1.0 mA işletilmektedir. Alternatif, radyasyon dozu ve tarama süresini azaltmak tarama protokolü tarama zamanında subscan başına 29 s ile 516 x 506 piksel 720 projeksiyonları elde SQD-6565-360-29 seçin.
6. UCT taramayı başlatın. mavi çubuk ilerleme gösterir. subscans sonradan edinilmiş olacaktır. Hipotermi ve sıvı kaybı nedeniyle sadece bir kaç dakika kısa tarama süresi bir sorun değildir. Bu otomatik kullanıcıyı korumak için tarama keser çünkü tarama sırasında uCT kapağını açmayınradyasyon.
7. Tarama tamamlandığında, kapağı açın anestezik tüpü yeniden ve FMT bunu taşımak için sahibinin fare yatağı ayırmak.

5. FMT Görüntüleme

NOT: Doğrudan uCT taramadan sonra, fare geliştirilmiş bir floresan rekonstrüksiyonu için birlikte kullanılan iki yapılandırmaları (yukarı ve baş aşağı) FMT taranır.

1. FMT içine fare yatak yerleştirmeden önce FMT için (oran 1 L / dak akış, havada% 2 izofluran) anestezik gaz kaynağına açın. FMT kontrol yazılımı kullanarak, deneklerin uygun sayıda (yani fare) ile bir çalışma grubu oluşturmak. (Listelenmeyen yeni problar için kullanımı OsteoSense) görüntüleme için kullanılacak probları seçin.
2. FMT fare ile multimodal fare yatak taşıyın. Uzun esnek anestezik gaz tüpü gaz akışını sürdürür. FMT içine fare yatağı takmadan önce, dikkatlice beri tüp kaldırmakFMT içinde gerekli değildir. Fare yatağın vidaları çevirerek kaçının.
3. ("Head-Önce") ilk kırmızı gösterge ile FMT içine fare yatak yerleştirin. Görüntü füzyon uCT ile tutarlı olması için bu çok önemlidir.
4. FMT kapatın.
5. Doğru çalışma grubu ve konuyu seçin. FMT gerekli kanalı seçin (OsteoSense 750EX için, 750 nm kanalını kullanın).
6. Bir açıklama, örneğin ekleyin., "Yukarı" veya "aşağı" ve "Capture" tuşuna basarak bir bakış tarama kazanır. Bu görüş, tüm alanın bir yansıma görüntüsünü yakalar. Aksi takdirde 3D sonradan tarar elde etmek mümkün değildir, çünkü "Yansıma Görüntüler yalnızca" seçili olmayan emin olun.
7. 3D tarama için görüntüleme parametreleri ayarlayın. Farenin mümkün olduğunca dahil etmek için görüş alanını büyütmek. Genellikle baş ve kuyruk tamamen Ancak, görüş alanı içine sığmaz. Tıklayın "Gelişmiş221; ve görüntüleme ayarlarını kontrol edin. Sırasıyla 5000 ve 50000, normal ve aydınlatma min / max 3 mm, duyarlılık ayarlayın örnekleme yoğunluğu.
8. FMT Taramayı başlatmak için "Scan" 'ı tıklayın "yeniden kuyruğuna eklemek" ve. Daha uzun maruz bırakma süreleri daha kalın nesneler için gereklidir, çünkü bu boyut ve fare kalınlığına bağlı olarak, yaklaşık 5-15 dakika sürer. Cihaz hipotermi önlemek için ısıtılmış bir görüntüleme odası bulunmaktadır.
9. Taramadan sonra, baş aşağı fare dahil fare yatak çevirmek ve başka bir tarama kazanır. Bu floresan yeniden inşası için ek veri sağlar.
10. UCT ve FMT-taramalar tamamlandı ve fare anestezi uyanır zaman dolaşmak veya sternal yatma korumak için, örneğin yeterli bilince, kazanmış kadar, bu sahipsiz bırakmayın.

6. Görüntü Fusion ve İmar

NOT: MesaiÇalışmanın sonunda uCT-FMT tarama, örneğin, tamamlanması, elde edilen veriler otomatik görüntü füzyon ve floresan yeniden etkinleştirmek için sıralanması gerekiyor.

1. Daha ileri işlemler için taramalar sıralamak için, çalışma için bir klasör oluşturun. Her uCT-FMT tarama için, ismini fare kimliği ve zaman gelin gibi., M01_02h içeren tek alt klasör oluşturun.
2. Her uCT-FMT tarama için .fmt dosyaları olarak FMT taramaları (yukarı ve aşağı) ihracat ve "_up.fmt" veya "_down.fmt" ile biten dosya adlarını kullanarak alt klasör içine kaydedin. Her .fmt dosya edinilen ham veriyi içeren, yani bu tür pozlama süreleri olarak kamera, metadata, edindiği uyarma ve emisyon görüntüleri ve FMT tarafından oluşturulan floresan rekonstrüksiyonu.
3. UCT yazılımı kullanarak, izotropik voksel boyutu 35 mikron olan bir yeniden oluşturun. Düzgün bir imar çekirdek (T10) seçin. Böylece görüş alanını ayarlamabelirteçleri dahil olmak üzere tüm fare yatağı kaplı olduğunu. Çıkış biçimi olarak MIFX / RAW seçiniz ve yeniden başlatın. Yeniden yapıldıktan sonra, uCT-FMT tarama alt klasör içine uCT imar dosyaları taşıyın.
4. Tüm taramalar için uCT ve FMT veri ihracat. Her alt klasör iki .fmt (yukarı ve aşağı) dosyalarını ve MIFX / RAW formatta uCT yeniden içerdiğinden emin olun. Bütünlüğü denetlemek için> Menü-> CT-FMT- seçin Imalytics Preklinik yazılımını kullanarak bütünlüğü ile kontrol edin. Hataların listesi gibi dosyaları veya uCT rekonstrüksiyonu .fmt eksik gibi görünebilir. Hataları düzeltmek ve tüm hatalar giderilinceye kadar eksiksiz olup olmadığını kontrol edin.
5. Menü-> CT-FMT-> Ayarlar kullanarak, Definiens yazılımı sunucu adını kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Varsayılan http: // localhost: 8184, Definiens yazılım aynı bilgisayarda yüklü olduğunu varsayarak. Definiens yazılımı au gerçekleştirmek için bir sonraki aşamada gerekli olanFare yatak ve belirteçlerin tomated segmentasyon.
6. Tüm çalışma için otomatik uCT-FMT füzyon gerçekleştirmek için Imalytics Preklinik yazılımında Menü-> CT-FMT-> Sigorta grubunu tıklatın. UCT-FMT tarama ve çalışma klasörüne eki "Paket" paralel bir klasörde sonuçları başına bu birkaç dakika sürer. Bu dosyalar daha fazla analiz için ilgili (uCT veri ve erimiş satıcı tarafından sağlanan FMT rekonstrüksiyonu) daha küçük bir alt kümesini içerir.
7. Haritaların ¹³ emilim nesil de dahil olmak üzere ve saçılma floresan yeniden gerçekleştirmek için Imalytics Preklinik yazılımında Menü-> CT-FMT-> yeniden yapılandırma grubu (FMT) tıklayın. Işlem GPU hızlandırmalı ²⁰ olsa da, her imar farenin büyüklüğüne bağlı olarak 1 ila 4 saat gerektirir. Sonuçlar paket klasöründe saklanır. Not: Daha yüksek verim sağlamak için, şu anda 56 GPU'lar ile GPU kümesinde bu rekonstrüksiyon gerçekleştirin.

7. Görüntü Analizi

NOT: görüntü verilerinden kantitatif ölçümler ayıklamak için, lezyonların ve organların segmentasyon gereklidir.

1. Bir kez setleri kaynaşmış ve yeniden tüm veri, Imalytics Preklinik yazılımını kullanarak tarama her uCT-FMT bir segmentasyon oluşturun.
2. Altlık olarak uCT dosyası ve kaplama olarak floresan dosyasını yükleyin. Basın "3D" volume rendering açmak ve veri kümesi incelemek için.
3. Segmentinde akciğer için, Menü> sınıflar,> sınıf ekleyin ve "tmp" adında bir sınıf oluşturmak tıklayın. Bu da bağlam menüsü aracılığıyla yapılabilir. Yeni bir sınıf oluşturma otomatik sonraki segmentasyon işlemleri için çıkış sınıfı olarak ayarlar.
   1. Segment uCT veri seti düşük yoğunluğu ile tüm bölgeleri bir eşikleme işlemi gerçekleştirin (tıklayın Aşağıda Menü-> Bölümlendirme> Thresholding-> ve girin 600). Şimdi tmp sınıfı mo dışarıdaki havayı içeriraynı zamanda akciğer dokusunun kullanımı.
   2. Bir "Akciğer" sınıf oluşturun. Bir "Bölge Fill" işlemi gerçekleştirin dış havadan akciğer ayırmak için, (> bölgede doldurun sınırsız bölgeyi doldurun> akciğere sağ tıklayın ve menü seçin).
   3. Artık gerekli değil çünkü tmp sınıfı silin.
4. Segmenti dışbükey bölgeler, örneğin., Mesane, karalamak modunu kullanın. Öncelikle sınıf "Mesane" yaratmak.
   1. F1 tuşuna basın, tüm karalamalar silmek için.
   2. Bilgisayar fare kullanarak, mesane sınırlarını belirginleştiren karalamalar çizin.
   3. F3 tuşuna basın kırmızı kaplama olarak görünür geçici bir maske ile karalamalar çevrelediği bölgeyi doldurmak için. Yinelemeli (herhangi bir dilimleme yönde) daha karalamalar ekleyebilir ve yeterli bir doğruluk elde edilene kadar F3 tuşuna basın. Tipik haliyle, 10 dilim Scribbles yeterlidir.
   4. F4 tuşuna basın "Mesane" geçici maskeyi saklamak için.
   5. Segmente böyle devam edinKalp ve böbrek gibi diğer dışbükey bölgeler. Birçok bölge, örneğin., Mide veya karaciğer, birkaç dışbükey bölgelerde yaklaşık olarak hesaplanabilir.
5. Bölüm omurga için öncelikle bir "Kemik" sınıf oluşturmak.
   1. Tüm parlak vokseller sınıflandırmak için bir eşik işlemi gerçekleştirmek için ContextMenu-> Thresholding-> Above seçin (örneğin., 1600 yukarıda) "Kemik" olarak.
   2. Bu iskeletin birçok yerinde, örneğin., Kaburga ile bağlı olduğu için bir bölge dolum işlemi segmentine omurga başarısız olur. Iteratif karalamalar, çizim ve kafatası, kaburga ve sakral kemik omurga ayırmak için F2 tuşuna basarak birkaç kesme işlemleri gerçekleştirin.
   3. Son olarak, bir sınıf "Omurga" oluşturmak ve omurga almak için bir bölge doldurma işlemini gerçekleştirin (omurga içine sağ tıklayın ve ContextMenu- seçin> Bölge- Fill> sınırsız bölgeyi doldurun).
6. Th içinde bir dosya olarak segmentasyon kaydetuCT-FMT taramanın e alt klasör. Toplu işlem etkinleştirmek için, organs.seg, örneğin, tutarlı bir ad kullanın.
7. Ortalama floresan yoğunluğu, hacim ve her sınıf için toplam miktarı (ortalama ve hacim ürün) içeren bir elektronik tablo oluşturmak için,> Sınıf istatistikleri (overlay) Menü-> Istatisitikler seçin.
8. Tüm uCT-FMT tarar tüm bölgeler için değerleri içeren tek bir elektronik tabloyu oluşturmak için,> Batch-> Toplu istatistiklerini Menü-> Batch-> Set toplu ayarlarını tıklatın ve sonra da menu- tıklatın. Bu, yani her uCT-FMT tarama için bir, yaratma ve birçok elektronik tablo dosyalarının birleştirilmesi çaba önler.

8. Prob Kalibrasyon

1. Prob bilinen farklı miktarlarda gerekli olan bir prob için kalibrasyon faktörü hesaplamak için, birden fazla uCT-FMT fantom taramalar, örneğin (adım 1.4)., 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol ve 0 pmol ile.
2. De tarif edildiği gibi hayalet taramaFMT bölümler 4 ve hayali taramalar için de 5., yukarı ve aşağı tarar gereklidir.
3. Veri ihracat ve 6. bölümde açıklandığı gibi füzyon ve rekonstrüksiyon gerçekleştirin.
4. Segment (1,200 üzerinde) eşikleme her tarama için uCT verileri kullanılarak içerme ve bölgesi doldurma.
5. Ölçülen floresan miktarları ile bir elektronik tablo oluşturun ve bilinen miktarlarda fonksiyonu olarak çiziniz. Doğrusal regresyon uyum eğimini hesaplayınız. Bu prob için kalibrasyon faktörü olduğunu.

Sonuçlar

Biz hidroksiapatite bağlanan hedeflenen sonda, OsteoSense, bir biodistribution değerlendirmek için açıklanan protokol uygulandı. 3 fareleri (C57BL / 6 apoE - / - Ahsg - / - iki nakavt fareleri, 10 haftalık) görüntülenmiştir önce ve 15 dakika, 2 saat, 4 saat, 6 saat ve 2 nmol OsteoSense iv enjeksiyonundan 24 saat sonra. Bizim yazılım otomatik modlu fare yatağa yerleşik belirteçlerin tespit (Şekil 1, Şekil 2A, B) FMT (Şekil 2C, D) tarafından gerçekleştirilen floresan rekonstrüksiyonu ile anatomik uCT verilerinin füzyonu etkin. OsteoSense mesanede bir düşük molekül ağırlıklı, hızlı bir renal atılım ve bu nedenle, yüksek sinyalli bir prob olduğu tahmin edilmektedir. FMT floresan yeniden füzyonu gibi mesane (Şekil 2C, D) dışında yanlış sinyal olarak sorunları ortaya çıkardı. FMT fare gerçek şeklini bilmek ve bir blok şekli kabul etmez, çünkü bu sorunlar oluşur. Our yeniden uCT verilerinden doğru şeklini belirler ve saçılma üretir ve emilim mesane (Şekil 2E, F) için özellikle belirgindir daha iyi sinyal lokalizasyonu, daha doğru bir floresan yeniden etkinleştirmek için ^13. eşler.

Uygun bölgelere yeniden floresan atamak için, biz interaktif bizim yazılım (Şekil 3) kullanılarak çeşitli organları segmentli. 18 taramalar her biri için, 7 bölge uCT verilerine yani., Kalp, akciğer, karaciğer, böbrekler, omurga, bağırsak ve mesane göre segmente edildi. Daha sonra, program 126 bölgelerin her biri için ortalama floresan yoğunluğunu hesaplamak için kullanılmıştır. Neyse ki, yazılım tüm değerleri hesaplar ve tek e-tabloda bunları kaydeder bir toplu modunu sağlar.

Floresan dağılımı görselleştirmek için, 3D kaplamalar her zaman noktası için üretilmiş,karşılaştırılabilir pencere ayarını (Şekil 4A-F) kullanarak. Sayısal Organ değerlerini kullanarak, biyolojik dağılım üç fareden (Şekil 4G) üzerinden Organ değerlerinin ortalaması alınarak hesaplanmıştır. enjeksiyon öncesi edinilen ön taramalar, ihmal edilebilir arka plan sinyalini gösterdi. 15 dakika enjeksiyonundan sonra, en güçlü sinyali nedeniyle hızlı böbrek atılımı, idrar kesesi ortaya çıktı. Sonraki zaman noktalarında kalan sonda kemik ve eklemlerde biriken etmişti.

Şekil 1. Multimodal Fare Yatak. (A) multimodal fare yatak sıkıca tutun fare iki akrilik cam plakalar içerir. sıkma iki vidayı kullanarak ayarlanır. Fare yatak görüntü füzyonu için belirteçleri (boş delikler) içerir. Anestezik gaz t ile sabitlenmiş esnek bir tüp kullanılarak verilirmaymun. (B) fare yatakta bir metal tutucu takılı ve dönen uCT Portalın merkezinde tutulur. Aksi halde, belirteçler yanlış doğru füzyon giden tahsis edilebilir, çünkü (Cı), fare Oda ve metal tutucusu ile aralarında bir boşluk kaçının. anestezik gaz tüp tüp konnektörü eklenmelidir. (D) fare yatağı doğru otomatik füzyon sağlamak için ön ile ilk FMT takılmalıdır. (E) belirteçleri otomatik işaretleyici tespiti ve füzyon için kullanılan FMT kamera görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Görüntü Fusion ve Yeniden. (A, B) İşaretleyiciler ve mou dış şekliSE otomatik bölütleme algoritması ile tespit edilir. (C, D) OsteoSense enjeksiyonundan sonra 15 dakika prob önemli bir miktarda daha önce mesane içine atılır edilmiştir. UCT verilerle satıcı tarafından sağlanan yeniden eritme sonra, sorunlar görünür hale gelir. Sinyalin Çoğu mesane çevresindeki değil mesane içinde görünen ve bazı sinyal bile havada görünür. FMT bir blok şeklinde fare varsayar çünkü bu olur. UCT verilerinden türetilen fare şeklini kullanarak (E, F) Bizim gelişmiş floresan rekonstrüksiyonu, mesane içindeki floresan daha iyi lokalizasyon sonuçları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Figürün 3. Etkileşimli Organ Segmentat. iyon (A) floresan dağılımını ölçmek için çeşitli organlar segmente edilmiş: Kalp (kırmızı), akciğer (pembe), karaciğer (kahverengi), mide (bej), omurga (mor), böbrekler (sarı), bağırsak (yeşil) ve idrar kesesi (altın). (B) güçlü çevre doku ile karşılaştırıldığında tezat olan akciğer, eşikleme ve bölgesi doldurma kullanılarak parçalı edilir. Mesane, böbrekler ve kalp gibi (C) Yuvarlak organları, "karalamalar" seçeneğini kullanarak segmentlere ayrılırlar. Daha karmaşık bir şekil, örneğin, karaciğer ve mide ile (D) organlar aşamalı karalamalar kullanılarak segmente edilir. Omurga segmenti için, yüksek bir eşik segmentine tüm kemikleri uygulanır. Sonra bazı kemikler, örneğin. Omurga kalır kadar, kaburga, uzak kesilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

sayfa içinde
Şekil 4. Biyodistribüsyon. Biodistribution değerlendirmek için, fareler çeşitli zaman noktalarında (AF) ile taranır. (A) ön tarama, enjeksiyon öncesi, 750 nm kanalında küçük bir arka plan sinyalini gösterir. (B) 15 dakika enjeksiyonundan sonra, prob önemli bir miktarda idrar torbasının içinde zaten. Fare dışında bazı floresan ile sonuçlanır (C), 2 saat zaman noktasında, fare idrar vardı. Daha sonra zaman noktalarında (DF), sinyal omurga ve diz, kemik ve eklem, yani. Ağırlıklı olarak görünür. (G) sayısallaştırılmış floresan konsantrasyonu seçilen organlar için gösterilir.

Tartışmalar

Biz açıklamak ve multimodal uCT-FMT görüntüleme için bir protokol uygulanır. ^{17,21 -} Ticari olarak mevcut ve yaygın olarak kullanılan FMT ve uCT cihazları ^3,11,15 kullanın. Protokol belirli FMT gerektirir, uCT örneğin benzer işlevler ve karşılaştırılabilir Tarama parametrelerinin, bir başka uCT ile ikame edilmiş olabilir, görüş alanı belirteçleri içeren bir fare yatak karşılamak için yeterince büyük olmalıdır.

FMT uCT veya MRI ²¹ ile birleştirilmeden biyolojik dağılım analizi için kullanılmıştır, ancak, anatomik veriler bölütleme uCT verileri ¹⁰ görülebilir, organ sınırları dayalı olabilir, çünkü tekrar elde edilebilirliğini arttırmak için de faydalıdır. Entegre uCT-FMT cihazları ^2,7 geliştirilmiş olmasına rağmen, bunlar henüz ticari olarak mevcut değildir. Ayrıca, iki ayrı cihazların kullanımı boru, izin verir yani., Bir sonraki fare caİlk fare verimini artırmak için, FMT hala iken n uCT de görüntülü.

Manuel iş yükünü azaltmak için, otomatik işaretleyici algılama ve füzyon gerçekleştirin. Bundan başka, fare şekil otomatik bölümlere ve bu bilgi önemli ölçüde floresans yeniden ^11,13,22 artırır. Nicel floresan yeniden inşası için, emme ve saçılma haritalar ^13,23 ihtiyaç vardır. Biz uCT verilerinin otomatik segmentasyon ve çeşitli doku tiplerinin bilinen saçılma katsayıları atama (akciğer, kemik, deri, yağ ve kalan yumuşak doku) ²⁴ tarafından saçılma haritası elde. Daha sonra, bu tür, kalp ve karaciğerde ^13,20 yanı sıra perfüze organlar için özellikle önemli olan, optik ham verilerden bir emme ilk yeniden.

Birden çok zaman noktalarında çok fareler tarama hızlı veri sayıda sonuçlanır analiz edilecek olan ayarlar. BIODIS içinda¤ çalışmaları, çeşitli organların her biri uCT-FMT tarama için Parçalara gerekmektedir. Fare yeni defalarca fare yatağa konumlandırılmış çünkü ne yazık ki, segmentasyonları, yeniden edilemez. Biz burada Enstitümüzde geliştirilen interaktif segmentasyonu için bir araç kullanmak, ancak, diğer araçları da ²⁵ uygun olabilir. Bu tür elips ve küpler ²⁶ gibi basit şekiller daha karmaşık organlara daha iyi maç, çünkü voksel bilge segmentlerini oluşturur. Otomatik tüm hayvan segmentasyon daha sonra manuel iş yükünü azaltmak için ²⁷ yararlı olacaktır, ama bir interaktif segmentasyon aracı hala segmentasyon hataları düzeltmek için gerekli olacaktır. Ayrıca, otomatik segmentasyon araçları gibi doğru patolojiler gibi özel durumları pek tahmin edebilirsiniz. Biz yerli uCT taramaları kullanmak için, örneğin dalak gibi bazı organların bile elle segmentinde çok zordur. Kontrast maddeler yardımcı olacağını, ancak tolere ile ilgili sorunlar var ve maintai zoruzunlamasına görüntüleme boyunca na sürekli kontrast madde dağılımı.

Bizim fantom çalışması floresans rekonstrüksiyon için şekil bilgileri kullanılarak, sinyal lokalizasyonu geliştirilmiş olduğunu göstermektedir. İn vivo koşullarında, benzer bir gelişme erken zaman noktası için prob büyük bir miktarda halihazırda (enjeksiyondan 15 dakika sonra), belirgindir idrar torbası. hidroksiapatit bağlayıcı prob kemik ve eklemlerde birikir. Bu, yani sinyal zaten enjeksiyondan sonra omurga 15 dk açıkça görülebilir, meydana kadar hızlı dikkat çekiyor. Bu muhtemelen, hedef bölgelerine hızlı bir ekstravazasyonu ve difüzyon sağlar prob, düşük molekül ağırlığına neden olur. Prob, hedef hidroksiapatite kovalent bağlanan ve bağlanmamış prob atılır. Daha sonra zaman noktalarında için, 6 saat ve enjeksiyondan sonra 24 saat arasında, omurga sinyal yoğunluğu, muhtemelen, nispeten sabit kalır neredeyse hiç ışık yeniden çünküfloresan ağartmak için derin fare içine ağrıyor. Çalışmamızda için, enjeksiyon öncesi edinilen taramalar için belirgin olarak düşük eşiğe sonuçlanır 750 nm kanalı kullandı. Daha düşük dalga boylarında, daha fazla arka plan sinyali ²⁸ beklenebilir.

Özetle, biz ticari olarak mevcut FMT ve uCT cihazlar için multimodal görüntüleme protokol açıklar. Biz kombinasyon floresan yeniden inşası için fayda sağladığını göstermektedir. Biz biodistribution eğrileri interaktif organıdır segmentasyonu ve toplu işleme yoluyla görüntü verilerinin büyük miktarda çıkarılır nasıl göstermek. Biz bu standartlaştırılmış iş akışı, ilaç geliştirme ve floresan etiketli problar kullanılarak diğer görüntüleme çalışmaları için yararlı olabileceğine inanıyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX	PerkinElmer	FMT2000	Device for fluorescence molecular tomography
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo	CT Imaging GmbH	Tomoscope Duo	Device for micro computed tomography
Multimodal Mouse Bed	CT Imaging GmbH	Experimental builder	Partially transparent animal holder
IsoFlo (isoflurane, USP)	Abbott	05260-05	Isoflurane Inhalation anesthesia
Small animal anesthesia system	Harvard apparatus	726419	Complete Isoflurane Table-Top System
Chlorophyll-free mouse food	Ssniff	E15051	low chlorophyll / low fluorescence food
OsteoSense 750EX	PerkinElmer	NEV10053EX	Animal FMT contrast agent
Portex Fine Bore Polythene Tubing	Smith medical	800/100/120	Tube for injection catheter
Sterican 30g	BBraun	4656300	Hypodermic needle for catheter
Imeron	Altana pharma	INLA F.1/0203/3.5337.69	CT contrast agent for the phantom inclusions
Agarose	Sigma	90-12-36-6	Agarose for phantom production
TiO2	Applichem	A1900,1000	Titanium oxyde as phantom scattering agent
Trypan blue	Fluka	93595	Trypan blue to adjust phantom light propagation
Cy7	Lumiprobe	15020	Fluorochrome for the phantom inclusions
Lipovenoes 20%	Fresenius Kabi	3094740	Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents
Definiens Developer XD Server	Definiens AG	Server XD	Software platform for automated segmentation
Imalytics Preclinical	ExMI/Gremse-IT	Version 2.0.1	Software for image fusion, reconstruction and analysis
NVIDIA Geforce Titan	Asus	GTXTITAN6GD5	High end computer graphics card, 6GB Memory