Bir Klinik İlgili kurulması<em&gt; Ex Vivo</emYerli mikroçevresinin Epitelyal Yara Tamir incelenmesi için&gt; Mock Katarakt Cerrahisi Modeli

Özet

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Özet

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Giriş

klinik olarak anlamlı, sahte katarakt cerrahisi, burada açıklanan ex vivo epitel yara iyileşmesi modeli bir yaralanma tepki olarak epitel dokuların onarımını düzenleyen mekanizmaları araştırmak için bir araç sağlamak için geliştirilmiştir. Bu modeli oluştururken için amaçlanmıştır Temel özellikler, yakından onarma işlemini bir kültür ayarı, 2), tamir düzenleyici unsurları modüle kolaylığı yaralama in vivo cevabı çoğaltılmış ve görüntü 3) yeteneği 1) sağlayan koşullar dahil gerçek zamanlı olarak bütünüyle içinde. meydan, bu nedenle, hücrelerin doğal mikroçevresinin, epitel yara onarımı incelemek mümkün olduğu bir kültür modeli oluşturmak ve işlemek için oldu. Bu yara onarım modelinin mevcudiyeti onarım sürecini düzenleyen matriks proteinleri, sitokinler ve kemokinlerin endojen sinyal ipuçları belirlenmesi için yeni olanaklar açar. Buna ek olarak, bir model incelenmesi için idealdir nasıln epitel yara alan ^2,3, reepitelizasyonu için kolektif bir levha olarak ve yaralı epiteli ⁴ kolektif göç yönetmenlik işlev yara kenarında mezenkimal lideri hücrelerinin soy belirlemek için hareket edebilmektedir. Bu model de etkili yara iyileşmesini teşvik etmek ve anormal yara onarım ⁵ engelleyebilir terapötikleri belirlemek için bir platform sağlar.

Mevcut yara tamir modelleri bir dizi kültürü ve günümüzde yara onarım süreci hakkında bilinenlerin çoğu sağladı vivo, hem de zaten vardır. Böyle kornea ^6-12 ve cilt ^13-17 gibi hayvan modellerinde yaralanma, olarak, katkıları da dahil olmak üzere süreçte yer olabilir tüm tamir arabulucuların bağlamında yaralama doku yanıtını incelemek için fırsat var damarlar ve sinir sistemi. Ancak, bu deneyimlerden manipüle sınırlamalar vardırin vivo olarak zihinsel koşullar ve zaman içinde sürekli olarak, in vivo olarak onarım yanıtı görüntüleme çalışmaları yürütmek üzere henüz mümkün değildir. Bunun aksine, örneğin çizilmeye yara çok in vitro yara onarımı kültürü modelleri, kolayca manipüle edilebilir ve zaman içinde takip ancak in vivo dokusunda yara iyileşmesinin okuyan çevresel bağlamı yoksundur. Ex vivo modeller sürecinde herhangi bir zaman noktasında onarım moleküler regülatörleri modüle yeteneği ile birleştiğinde hücrelerin mikroçevresinin bağlamında zamanla sürekli yaralanma onarım işlemini okuyan avantajı sunarken, bu uygun birkaç model var parametreleri.

İşte fizyolojik yaralama bir epitel dokusunun yanıtını yeniden kültürleri şifa yüksek tekrarlanabilir ex vivo epitel yara oluşturmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Bir doku kaynağı, bir ex vivo moc olarak civciv embriyo lens kullanarakk katarakt cerrahisi yapılmaktadır. Lens avasküler, innerve ve eşlik eden stroma ^18,19 serbest değil, o kendi kendine yeten bir kalın bazal membran kapsül içinde olduğundan bu çalışmalar için kullanılacak ideal bir dokudur. İnsan hastalıkta, katarakt cerrahisi nedeniyle lensin opasifikasyon için görme kaybı giderir ve lens toplu içermektedir lens fiber hücre kitlesinin, kaldırılmasını içerir. Aşağıdaki katarakt cerrahisi görme yapay göz içi lensi yerleştirilmesi yoluyla geri yüklenir. katarakt ameliyatı prosedürü, lif hücrelerinin çıkarılması, Fiber hücreleri tarafından işgal edilmiş olan mercek kapsülünün arka bölgenin yeniden epitelizasyon ile yanıt verir bitişik lens epitelyum, bir yaralanma tepkisini indükler. Katarakt cerrahisi, çoğu yara tamir yanıtları gibi, bazen lens Arka Capsu olarak bilinen miyofibroblastlar ortaya çıkması ile ilişkili yara iyileşmesi yanıt bir anormal fibrotik sonucunu ortaya çıkmaktadırle Opasitesi ^20-22. Katarakt ameliyatı yara iyileşmesi modeli oluşturmak için, katarakt cerrahisi prosedürü fizyolojik bir yaralanma üretmek için civciv embriyo göz kaldırılır lenslerde taklit edilir. Mercek epitelyal hücreleri tarafından çevrelenmiş bir çok tutarlı dairesel bir yara bölgesinde lens elyaf hücrelerinin sonuçları Mikrocerrahi çıkarılması. Bu hücre popülasyonu sıkıca mercek bazal membran kapsüle bağlı kalır ve cerrahi prosedür ile yaralandı. epitel hücreleri lider hücreleri ¹ olarak onarım sürecinde bilinen vimentin zengin mezenkimal hücre popülasyonu tarafından yönetilen yara, iyileşmek için endojen bazal membran arındırılır alan üzerine göç ederler. Bu model ile yaralanma bir epitel yanıtı kolaylıkla görülebilir ve hücrelerin mikroçevresinin bağlamında zamanla izledi. Hücreler ifadesi ya da yara iyileşmesi bir rol oynaması beklenmektedir moleküllerin aktivasyonu modifikasyonlara kolaylıkla temin edilebilir. Th bir güçlü özelliğiModel izole etmek ve yara iyileşmesi çerçevesinde göç özgü değişiklikleri incelemek için yeteneğidir olduğunu. çalışmalar için yaş uyumlu ex vivo olarak yara iyileşme kültürler çok sayıda hazırlanması için yeteneği, bu modelin bir diğer avantajdır. Böylece, bu model sistemi yara iyileşme süreci üzerindeki etkisi yara onarım mekanizmalarını ve test terapötik ayrı kızdırmak için eşsiz bir fırsat sunuyor. ex vivo sahte katarakt cerrahisi modeli yaralanma tamir mekanizmaları çalışmak için kritik bir kaynak sağlayarak, geniş uygulama olması bekleniyor.

Protokol

Aşağıdaki protokol Thomas Jefferson Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Bildirimi ile uyumludur.

Ex Vivo Yara Kültür Lensler 1. Kurulum ve Hazırlık

1. Steril, laminer akış başlığı içinde üç adet 100 mm petri kapları yerleştirin. Oda sıcaklığında, yarım Tris / Dekstroz tamponu ile petri kutularının iki (140 mM NaCI, 5 mM KCI, 0.7 mM _Na-2 PO _4, 5 mM D-glikoz, 8.25 mM Tris baz, HCI ile 7.4'e pH td tamponu) doldurun Üçüncü boş bırakarak. Ön sıcak kültür ortamı 37 ^o C ye (Ortam 199,% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş)
   Not: in vivo meydana geldiği gibi kültür ortamı iyileşme, standart bir yara, serumsuz olduğu; Bununla birlikte, yara onarımı kültürleri serum ya da diğer faktörleri de tanımlanmış ortam koşullarında başarıyla yetiştirilebilir.
2. Bereketli embriyonik d kaldıray inkübatör 15 beyaz leghorn civciv yumurta (hafif hafif sallanarak 37.7 ° C'de tutulan)
3. Bir yıkama şişesinden laminar akış çeker ve% 70 etanol ile kabuğun temiz bir dış seçilen yumurta yerleştirin. Steril çözümleri ve araçları kullanarak, laminer akış kaputu aseptik koşullarda aşağıda tüm prosedürleri yürütün.
4. Boş 100 mm petri içine yumurta ve yer içeriğini Crack. Standart forseps ve ince makas kullanılarak embriyo başını kesmek. TD tampon içeren bir petri civciv embriyo baş koyun ve düzgün embriyonun geri kalan atmayın. İsteğe bağlı, 15 dakika daha uzun, kısa bir süre için TD tamponda civciv embriyo başlarını tutun.
5. Bir petri kapağı üzerinde civciv embriyo başını yerleştirin. Yüksek hassasiyetli forseps kullanarak, aşağıdaki sırayla göz ekli vitreus ile birlikte lensi çıkarın. Gözün arkasında küçük bir açıklık oluşturmak için forseps ile gözün arka sıkıştırın.
6. Sonra, w vitreus mizah kavramaki forseps ve yavaşça bir yuvarlanma hareketi ile vitreus römorkör, ekli lens ile vitreus göz yerinden edilecektir. TD tampon içeren kalan petri vitreus yerleştirin objektif /. Lensler artık 30 dakika için TD tamponu içinde kalmasına izin verir.
7. Bir mikroskop altında yeni bir petri kapak lensi hareket ettirin. Bu noktada bir mikroskop altında tüm adımları uygulayın. Yüksek hassasiyetli forseps dikkatle mercek dokusuna zarar vermemeye dikkat alarak forseps kenarı kullanılarak lens ile yerinden edilmiş herhangi siliyer cisim (pigmentli hücreler) uzakta fırça ile.
   Not: siliyer gövde çıkarılması lens endojen olmayan hücre tipleri, yara onarımı kültürü dahil olmasını sağlar.
8. Arka lens kapsülü ile dernekten vitreus vücudu kapalı kısma yüksek hassasiyetli forseps ile vitreus mercek ayırın.
9. Yüksek hassasiyet kullanarak küçük bir damla içine lensi transferi forsepsbir 35 mm doku kültürü çanağı içinde TD tamponu (yaklaşık 200 ul).

2. Sahne Mock Katarakt Cerrahisi

1. Yukarı bakacak şekilde lensin ön yönü ile 35 mm çanak TD tampon damla lensi yönlendirin.
   Not: merceğin ön kolay lens epitelyum ön ve ekvator bölgesi arasındaki sınır notlar dokuda yoğun halkasının mevcudiyeti ile tanımlanır. Bunun aksine, mercek elyaf hücrelerinin bağlı olduğu mercek kapsülünün arka işaretlerin yokluğu vardır.
2. , Her el bir forseps ile doku tutarak iki yüksek hassasiyetli forseps ön lens kapsülü, objektif dokusunu çevreleyen kalın bazal membran ve ilişkili lens ön epitel merkezinde küçük bir kesi (yaklaşık 850μm) yapmak kullanma ve yavaşça karşıt yönlerde asılarak.
3. Lens dokusu, dislod kısmını oluşturan lif hücre kütlesi, KaldırLens epitel eklerinde onu ging ve (Şekil 1A modellenmiş klasik katarakt cerrahisinde kullanılan bir yaklaşım,) hidro-elüsyon lens kapsülü çevreleyen.
4. TD tampon 300 ul bir 27.5 g bir iğne ucu ile bir 1 ml şırınga doldurun. Anteryor mercek kapsülünün yapılan kesi içine iğne ucu yerleştirin ve yaklaşık yarım lens içine.
5. Yavaşça mercek fiber hücre kitlesinin içine TD tampon enjekte şırınga basınız. 50 ila 200 ul TD, ve asla fazla 300 ul enjekte edilir. Epitel ve lens kapsülünün kendisini gevşeterek lif hücre kütlesi gözlemleyin.
6. Yüksek hassasiyetli forseps kullanarak, ön kesi sitesi aracılığıyla objektiften gevşetti lif hücre kütlesi kaldırın.
   Not: Bu yordam, bu siteye sadece komşu lif hücreleri ekli hücrelerin soyulmuş edilmişti posterior lens bazal membran kapsülü ve bir yaralı lens epitel bırakır.

3. PreparinEx Vivo Kültür g Yaralı Objektif

1. Kapsül çanta ön yüzünde beş kesim yaparak, kültür tabağına yukarıda açıklanan katarakt cerrahisi, hücre tarafı yukarı kaynaklanan objektif kapsül çanta düzleştirin.
2. Lensin ekvatora kadar orijinal kesi dik kesin. Aşağı kültür çanak kapsül tarafında takılı epiteli hücre tarafı yukarı ile mercek kapsülünün sonuçtaki beş "flep" dümdüz. Bir yıldızın ya da flowerlike şekli (Şekil 1B bakınız) almalı şimdi ex vivo yaralı lensi unutmayın.
3. Yıldızın her noktada usulca aşağı forseps ile, çanak basın kapsülü sabitlemek için. Bu eksplant beş en dış ucunda küçük bir girinti yapmak ve yemek için sürekli eki neden olur.
   Not: Bu işlem sırasında kapsül zarar mümkündür ve böylece fla uçlarına yakın çanak kapsülü sabitlemek için önemlidirmümkün olduğunca PS yanı sıra mümkün olduğunca emniyet noktalarının en az miktarda yapmak için (genellikle iki, flep başına üç maksimum).
4. 35 mm çanak TD tamponunu çıkarın ve önceden ısıtılmış ortam 1,5 mi ile değiştirin. Inkübatör, kapağı ve yer ile 35 mm çanak Kapak (37 ° C,% 5 _CO2).

Arka Kapsül Yaralı Alanı Yeniden epitelizasyon Kantitatif Analiz Lens Epitel Hücreleri Orjinal Ek Zonu (OAZ), dan, oluşuyor Orta Göç Bölgesi (CMZ), 4. ayrılması.

Not: hücreler, hasara tepki olarak, hemen CMZ bölgeye doğru hareket etmeye başlar. Kültürde günden yeterince hücrelerin mikro diseksiyon ²³ ile CMZ ve Oaz ayrılması sonrasında, moleküler ve biyokimyasal analiz için CMZ genelinde göç vardır. Bu protokol, kapsülün yaralı bölgeden bir seferde bir kanat (OAZ) kaldırılmasını içerir.

1. Bir Demar gözlemleyinkatyondur, OAZ ve Cmz arasında mikroskop altında açıkça görülebilir (Şekil 2A). İki yüksek hassasiyetli forseps kullanılarak, çizginin her iki tarafında, OAZ / CMZ hattı, başka bir hemen yanında bir kenarına, her iki forseps ile kavramak (Şekil 2A, B, ok).
2. Bir elinizi kullanarak / CMZ tarafta bir forseps Öte yandan / forseps ile yavaşça OAZ / CMZ hattı boyunca Oaz çekerken, yaralı kültüre tutunmaya devam ediyor. CMZ kolayca bu hat boyunca Oaz ayrılır. Iki bölge tamamen ayrılır kadar tüm kültür etrafında bu çizgi boyunca devam edin.
3. Örneğin Western blot veya ko-immünopresipitasyon ^23,25 gibi RNA Dizi ²⁴ veya biyokimyasal analizler gibi moleküler analiz için ayrıldı OAZ ve CMZ fraksiyonlar incelenmesi.

Sonuçlar

Ex Vivo Model hücrelerin doğal mikroçevresinin yara iyileşme sürecini incelemek için oluşturulan

Hücrelerin doğal mikroçevresinin içinde epitel yara iyileşmesini düzenleyen katılan mekanizmalarını araştırmak için, klinik olarak anlamlı ex vivo sahte katarakt cerrahisi modeli oluşturuldu. Bu model nedeniyle yapısal özellikleri konusunda pek çok avantajlar sunmaktadır mercek dokularından oluşturulur: 1) objektif mercek kapsülü olarak adlandırıla...

Tartışmalar

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140 mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5 mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at 0.7 mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5 mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25 mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35 mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope