Istituzione di un clinicamente rilevanti<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock chirurgia della cataratta modello per indagare epiteliale Wound Repair in un microambiente Native

Riepilogo

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduzione

La clinicamente rilevante, la chirurgia della cataratta finto, ex vivo epiteliale modello guarigione delle ferite qui descritto è stato sviluppato per fornire uno strumento per indagare i meccanismi che regolano la riparazione dei tessuti epiteliali in risposta ad un infortunio. Le caratteristiche principali che sono state finalizzate per nella creazione di questo modello inclusi 1) creare condizioni che strettamente replicato la risposta in vivo a ferire in un ambiente culturale, 2) la facilità di modulare gli elementi regolatori di riparazione, e 3) capacità di immagine il processo di riparazione, nella sua interezza, in tempo reale. La sfida, quindi, è stato quello di creare un modello di cultura in cui è stato possibile studiare e manipolare, riparazione della ferita epiteliale in microambiente nativo delle cellule. La disponibilità di questo modello ferita riparazione apre nuove possibilità per individuare gli spunti di segnalazione endogeni di matrice proteine, citochine e chemochine che regolano il processo di riparazione. Inoltre, il modello è ideale per l'esame come unn epitelio è in grado di muoversi come un foglio collettivo per ri-epithelialize della ferita ^2,3, e per la determinazione della stirpe di cellule mesenchimali capo sul bordo della ferita che funzionano nel dirigere la migrazione collettiva dell'epitelio feriti ^4. Questo modello offre anche una piattaforma con cui identificare terapie che potrebbero promuovere efficace la guarigione delle ferite e prevenire ferita aberrante riparazione ^5.

Ci sono già un certo numero di modelli disponibili ferita riparazione, sia nella cultura e in vivo, che hanno fornito la maggior parte di ciò che si conosce il processo di riparazione delle ferite oggi. In modelli animali di lesioni, come cornea ^6-12 e ^13-17 della pelle, vi è la possibilità di studiare la risposta del tessuto al ferimento nel contesto di tutti i mediatori riparazione che potrebbero essere coinvolti nel processo, compresi i contributi dal vascolarizzazione e del sistema nervoso. Tuttavia, vi sono limitazioni per manipolare il expericondizioni mentali in vivo, e non è ancora possibile condurre studi di imaging della risposta di riparazione in vivo, continuamente nel tempo. Al contrario, la maggior parte dei modelli di coltura in vitro ferita riparazione, come la ferita graffiatura, possono essere facilmente manipolati e seguiti nel tempo ma mancano contesto ambientale di studiare guarigione delle ferite nel tessuto in vivo. Mentre ex vivo modelli offrono il vantaggio di studiare il processo di riparazione pregiudizio continua nel tempo nel contesto del microambiente delle cellule associata alla capacità di modulare i regolatori molecolari di riparazione in qualsiasi punto di tempo nel processo, ci sono alcuni modelli che si adattano questi parametri.

Qui è descritto una procedura per generare altamente riproducibile ex vivo epiteliali guarigione della ferita culture che riproducono la risposta di un tessuto epiteliale di un ferimento fisiologico. Utilizzando la lente pulcino embrione come fonte di tessuto, un ex vivo mocviene eseguita la chirurgia della cataratta k. L'obiettivo è un tessuto ideale da utilizzare per questi studi dal momento che è indipendente all'interno di una spessa capsula membrana basale, avascolare, non è innervato, e priva di qualsiasi stroma associato ^18,19. Nella malattia umana, chirurgia della cataratta Indirizzi perdita della vista a causa opacizzazione della lente, e comporta la rimozione della massa cellulare fibre lente, che comprende la maggior parte della lente. Dopo visione chirurgia della cataratta viene ripristinata mediante l'inserimento di una lente intraoculare artificiale. La procedura di chirurgia della cataratta, attraverso la rimozione di cellule di fibre, induce una risposta lesioni nell'epitelio lente adiacente, che risponde riepitelizzazione dell'area posteriore della capsula del cristallino che era stato occupato dalle cellule della fibra. Nella chirurgia della cataratta, come nella maggior parte delle risposte di riparazione della ferita, si verifica talvolta un esito fibrotico aberrante risposta guarigione della ferita, associata alla comparsa di miofibroblasti, che nella lente è noto come posteriore capsule opacizzazione ^20-22. Per generare il modello guarigione delle ferite chirurgia della cataratta, una procedura di chirurgia della cataratta è imitato in lenti rimosso dall'occhio pulcino embrione per produrre una lesione fisiologica. Rimozione microchirurgica delle fibre lente risultati cellule in una ferita circolare molto consistente circondata dalle cellule epiteliali lente. Questa popolazione di cellule rimane fermamente attaccata alla membrana capsula del cristallino seminterrato ed è ferito dalla procedura chirurgica. Le cellule epiteliali migrano sulla zona dissodata della membrana basale endogena per guarire la ferita, guidata da una popolazione di cellule mesenchimali ricche di vimentina noti nel processo di riparazione come cellule capo ^1. Con questo modello la risposta di un epitelio di lesione può essere facilmente visualizzata e seguita con il tempo nel contesto del microambiente delle cellule. Le cellule sono facilmente accessibili per le modifiche dell'espressione o l'attivazione di molecole che dovrebbero svolgere un ruolo nella riparazione delle ferite. Una potente funzione di thè il modello è la capacità di isolare e studiare i cambiamenti specifici di migrazione nel quadro di guarigione della ferita. La capacità di preparare un gran numero di ex vivo cicatrizzanti culture abbinati invecchiato per studi è un altro vantaggio di questo modello. Così, questo modello di sistema offre l'opportunità unica di prendere in giro a parte i meccanismi di riparazione delle ferite e terapie di prova per il loro effetto sul processo di guarigione delle ferite. Il finto modello ex vivo chirurgia della cataratta dovrebbe avere ampia applicabilità, fornendo una risorsa fondamentale per lo studio dei meccanismi di riparazione del pregiudizio.

Protocollo

Il seguente protocollo è conforme alle Istituzionale Animal Care and Use Committee linee guida Thomas Jefferson University e con la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Vision Research.

1. Configurazione e preparazione di lenti per la Cultura Ex Vivo Wound

1. Mettere tre 100 piatti mm Petri in una, cappa a flusso laminare sterile. Riempire due dei piatti petri metà con tampone Tris / destrosio (buffer TD; 140 mM NaCl, KCl 5 mM, 0,7 mM Na ₂ PO _4, 5 mM D-glucosio, 8,25 mM Tris Base, pH a 7,4 con HCl) a RT , lasciando il terzo vuoto. Terreni di coltura pre-caldo (Media 199 integrato con, 1% di L-glutamina e 1% di penicillina / streptomicina) a ³⁷ ° C.
   Nota: La ferita norma di guarigione di coltura è senza siero, come avviene in vivo; tuttavia, le culture ferita di riparazione possono essere coltivate con successo in condizioni di media definiti che includono siero o altri fattori.
2. Rimuovere fertile d embrionaleay 15 bianco Livorno pulcino uovo da incubatrice (tenutasi a 37,7 ° C, con dolce dondolio)
3. Inserire uovo selezionato nella cappa a flusso laminare e pulita all'esterno della scocca con etanolo al 70% da una bottiglia di lavaggio. Condurre tutte le procedure qui di seguito, in condizioni asettiche in cappa a flusso laminare, con soluzioni e strumenti sterili.
4. Crack uova e posizionare il contenuto in 100 millimetri Petri vuota. Decapitare embrione con pinze standard e forbici sottili. Mettere la testa pulcino embrione in una capsula di Petri contenente tampone TD e smaltire il resto dell'embrione. Opzionalmente evitare che le testine di embrione di pollo in tampone TD per un breve periodo di tempo, non più di 15 min.
5. Mettere la testa embrionali di pollo su un coperchio capsula di Petri. Utilizzando pinze alta precisione, rimuovere l'obiettivo insieme al suo vitreo allegata dall'occhio nella seguente sequenza. Pizzicare la parte posteriore dell'occhio con la pinza per creare una piccola apertura nella parte posteriore dell'occhio.
6. Quindi, cogliere l'umore vitreo wesimo pinze e tirare delicatamente il vitreo, con un moto di rollio, il vitreo con l'obiettivo montato saranno sloggiati dall'occhio. Luogo obiettivo / vitreo nella capsula di Petri rimanente contenente tampone TD. Lasciare le lenti di rimanere in tampone TD per non più di 30 minuti.
7. Spostare la lente per un nuovo coperchio Petri sotto un microscopio da dissezione. Da questo punto in poi eseguire tutti i passaggi sotto un microscopio da dissezione. Con pinze ad alta precisione lavarsi attentamente tutta corpo ciliare (cellule pigmentate) che sono stati sloggiato con la lente utilizzando il bordo della pinza, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto dell'obiettivo.
   Nota: Rimozione del corpo ciliare assicura che i tipi di cellule che non sono endogeni alla lente non sono inclusi nella cultura riparazione della ferita.
8. Separare l'obiettivo dalla vitreo con una pinza ad alta precisione pizzicando fuori dal corpo vitreo dalla sua associazione con la capsula posteriore.
9. Usando l'alta precisione Pinza trasferire l'obiettivo in una piccola gocciadi tampone TD (circa 200 ml) in un piatto di coltura di tessuti 35 mm.

2. Esecuzione Mock chirurgia della cataratta

1. Orientare la lente nella goccia di tampone TD nel piatto da 35 mm, con la faccia anteriore della lente rivolta verso l'alto.
   Nota: Il anteriore della lente è facilmente identificabile dalla presenza di un anello denso nel tessuto che rileva il confine tra anteriore e regione equatoriale dell'epitelio lente. Al contrario, vi è una mancanza di marcature sul posteriore della capsula del cristallino a cui le cellule di fibre lente sono allegati.
2. Utilizzando due pinze alta precisione fanno una piccola incisione (circa 850μm) al centro della capsula anteriore della lente, la membrana basale spessa che circonda il tessuto dell'obiettivo, e la sua associata epitelio della lente anteriore, afferrando il tessuto con una pinza in ogni mano e tirando delicatamente in direzioni opposte.
3. Rimuovere la massa cellulare fibra, che costituisce la maggior parte del tessuto dell'obiettivo, dislodging dai suoi allegati al epitelio lente e circostante capsula del cristallino da idro-eluizione (un approccio utilizzato nella chirurgia della cataratta classico, modellato in Figura 1A).
4. Riempire una siringa da 1 ml con una punta dell'ago 27,5 G con 300 ml di tampone TD. Inserire la punta dell'ago nella incisione fatta nella capsula anteriore del cristallino, e circa a metà strada nella lente.
5. Deprimere delicatamente la siringa per iniettare il buffer di TD nella massa cellulare fibra lente. Iniettare fra 50 e 200 microlitri TD, e mai più di 300 microlitri. Osservare la massa cellulare fibra stessa allentando dalla capsula epitelio e la lente.
6. Utilizzando pinze ad alta precisione, rimuovere la massa cellulare fibra allentato dalla lente attraverso il sito di incisione anteriore.
   Nota: Questa procedura lascia il posteriore della lente membrana basale capsula per cui le cellule della fibra erano stati allegati denudati delle cellule, e di un epitelio lente infortunato proprio adiacente a questo sito.

3. Preparing dell'obiettivo Ferito per Ex Cultura Vivo

1. Appiattire il sacco capsulare obiettivo che risulta dalla chirurgia della cataratta sopra descritto sul piatto di coltura, lato della cella su, facendo cinque tagli nella faccia anteriore del sacco capsulare.
2. Tagliare perpendicolare al sito di incisione originale attraverso all'equatore della lente. Appiattire le risultanti cinque "sportelli" di capsula del cristallino con epitelio attaccato sul lato cultura piatto capsula giù, cellula verso l'alto. Nota la lente ex vivo ferito ora dovrebbe assumere una stella o una forma a fiori (vedi Figura 1B).
3. Per fissare la capsula al piatto, premere dolcemente con le pinze in ogni punto della stella. Questo farà una piccola rientranza a cinque punte più esterne del espianto e il risultato in attacco sostenuto al piatto.
   Nota: È possibile danneggiare la capsula durante questa procedura e quindi è importante garantire la capsula al piatto più vicino alle punte del flaps possibile, così da rendere il minor numero di punti di fissaggio come possibile (in genere due, massimo di tre per falda).
4. Rimuovere il buffer TD dal piatto 35mm e sostituirlo con 1,5 ml di mezzi di pre-riscaldato. Coprire il piatto 35 millimetri con il suo coperchio e posto in incubatrice (37 ° C, 5% di CO _2).

4. Separazione della centrale migrazione Zone (CMZ), dove riepitelizzazione dell'Area ferito della capsula posteriore si verifica, dal Attachment Originale della Zona (OAZ) delle cellule epiteliali lente, per l'analisi quantitativa.

Nota: le cellule iniziano a muoversi nella regione CMZ immediatamente in risposta al danno. Di giorno una cultura abbastanza cellule migrano attraverso la CMZ per l'analisi molecolare e biochimica, dopo la separazione della CMZ e la OAZ da micro-dissezione ^23. Questo protocollo comporta la rimozione di un lembo (OAZ) alla volta dalla zona ferita della capsula.

1. Osservare una demarcatione, chiaramente visibili al microscopio da dissezione, tra OAZ e CMZ (vedi Figura 2A). Utilizzando due pinze alta precisione, afferrare con entrambe le pinze a bordo della linea OAZ / CMZ, quella appena adiacente all'altra, su entrambi i lati della linea (vedere la Figura 2A, B, freccia).
2. Usando una mano / una pinza sul lato CMZ continuano a tenere su la cultura feriti, mentre con l'altra mano / pinza, tirare delicatamente il OAZ lungo la linea OAZ / CMZ. La CMZ separa facilmente dalla OAZ lungo questa linea. Continuare lungo questa linea intorno all'intera cultura finché le due regioni sono completamente separati.
3. Studiare i separati OAZ e CMZ frazioni per l'analisi molecolare, come ²⁴ o biochimica analisi di RNA-Seq quali Western Blot o co-immunoprecipitazione ^23,25.

Risultati

Ex Vivo Modello creato per studiare il processo di guarigione delle ferite nei microambiente nativo le cellule '

Per studiare i meccanismi coinvolti nella regolazione guarigione delle ferite di un epitelio all'interno microambiente nativo delle cellule, un clinicamente rilevante ex vivo finto modello chirurgia della cataratta è stato creato. Questo modello è stato creato da tessuto lente che offre molti vantaggi per le sue proprietà intrinseche: 1) l'obiettiv...

Discussione

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140 mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5 mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at 0.7 mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5 mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25 mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35 mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope