JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Özet

Burada sunulan teknik, bir sinyal yolunun bileşenleri ile etkileşime girer, biri bir hedef proteini ya da alternatif olarak, küçük bir molekül adım analiz etmeyi sağlar. yöntem dayanır, bir yandan, belirli bir proteinin endüklenebilir ifadesi üzerindeki seçilen sinyalleşme kademeli olarak tanımlanmış ve önceden tespit edilmiş bir aşamada bir sinyal olayını gerçekleştirmek için kullanılır. Ifade edilen hedef proteinin aktivitesi elde edilen sinyal yolunun okumaya bağlı olarak, yukanya doğru yer alan veya başlatılan sinyal olayının alt baş halinde birlikte ifadesi, diğer yandan, söz konusu genin, sonra araştırmacı değerlendirmelerini sağlar. Burada, apoptotik kaskad protokolü özelliğe göstermek için belirli bir sinyal yolu olarak seçilmiştir. Böyle Coxiella burnetii gibi patojenik bakteriler, hücre içinde bakteri hayatta kalmasını sağlamak için konak hücreye konak hücre ölümü indüksiyon müdahale efektör proteinleri yerini değiştirmek ve geliştirmek için onlarınOrganizmada yaygınlaştırılması. C. burnetii'nin efektör protein, CaeB etkili bir UV ışığı veya staurosporin ile apoptoz indüksiyonu sonrasında konakçı hücre ölümünü engeller. Adım CaeB apoptotik sinyalin yayılma müdahale ettiği daraltmak için, iyi karakterize edilmiş, pro-apoptotik etkinliğe sahip seçilen proteinler doksisiklin indüklenebilir bir şekilde geçici olarak ifade edilmiştir. CaeB Bu proteinlerin yukarı hareket ederse, apoptoz engelsiz devam edecektir. CaeB aşağı hareket ederse, hücre ölümü önlenir. seçilen test proteinleri büyük cellat proteazıdır mitokondri düzeyi ve kaspaz 3, en davranır Bax idi. CaeB Bax ifadesi ile indüklenen hücre ölümü engeller, ama kaspaz 3 sentezlenmesiyle. CaeB, bu şekilde, bu iki protein arasında apoptotik kaskad ile etkileşime girer.

Giriş

birçok Gram-negatif bakteriyel patojenlerin hastalık oluşturma ökaryotik konakçı hücreleri kaçırmak için özel bir salgı sistemleri bağlıdır. Bakteriler hücresel ve biyokimyasal çeşitli aktiviteler modüle edilmesi için bir ev sahibi hücre içerisine bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri (efektörler) enjekte etmek için, bu salgılama sistemleri kullanırlar. efektör proteinlerin çalışma konak / patojen etkileşimleri temel yönlerini içine değil, aynı zamanda ökaryotik hücreler 1 temel biyoloji içine olağanüstü bir fikir vermiştir sadece. Konakçı hücre, apoptoz modülasyonu birçok hücre içi patojenler için önemli bir virülans mekanizma olduğu gösterilmiştir, ve apoptoz modüle efektör protein bir dizi 2-9 tespit edilmiştir. Bununla birlikte bir aktivite bunların kesin moleküler mekanizmalar birçok durumda halen mevcuttur.

Apoptoz, programlanmış hücre ölümü olup, enfeksiyon 10 immün yanıtlarda önemli bir rol oynamaktadır. Apoptoz giden iki ana yollar vartespit edilmiştir: plazma zarı (dışsal apoptosis) hücre ölümü reseptörleri aracılığıyla mitokondri (içsel apoptosis) ya da sinyal iletimini doğrudan hedef. intrinsik veya mitokondri aracılı hücre ölüm yolunu hücre içi sinyaller ile tetiklenir ve Bax ve Bak, Bcl-2 ailesine ait iki pro-apoptotik üye aktivasyonunu içerir edilir. Bu aile hücre ölümü 11-14 kontrol pro- ve anti-apoptotik düzenleyici protein oluşmaktadır. Bax ve Bak sitoplazmaya sitokrom C salınımı ile sonuçlanan, mitokondriyal dış membran daha sonra permeabilization ardından apoptoz aktivasyonu oligomerizasyonu yol açar. Sitokrom C salma apopitozom 15 kaspaz 9 aktivasyonu yoluyla efektör kaspaz 3 ve 7 aktivasyonunu başlatır. Bu diğerlerinin yanı sıra, hücre yüzeyi 16 fosfatidilserin maruz sonuçlanır, seçilen alt-tabakaların proteoliz yol açar ve CH fragmanları özel bir DNaz boşaltırromatin 17,18.

Bağımsız bir efektör protein, müdahale eden apoptotik kaskad içinde indüklenebilir bir ekspresyon sistemi 19 kullanılmıştır belirlemek amacıyla. Transgenlerin koşullu ifadesi için düzenleyici sistemler hücre içinde bir proteinin fonksiyonunu veya doku, organ ve organizma gelişimi için önemini, hem de inisiyasyon, ilerlemesi ve hastalık 20-23 bakımı sırasında analiz değerli bir araç olmuştur. Tipik haliyle, örneğin Tet sistemi Burada kullanılan 24 indüklenebilir kontrol sistemleri, yapay bir transkripsiyon birimi (Şekil 1 e bakınız) oluşturur. Bir bileşen, transkripsiyonel aktivasyonu veya 24,26 susturulması aracılık eden bir memeli protein etki bakteriyel transkripsiyon bastırıcı TetR 25 füzyonu ile oluşturulan tTA (tetrasilin bağımlı transkripsiyon aktivatörü) olarak adlandırılan bir yapay tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüdür. İkinci bileşen, bir melezpromoteri, en az bir TATA-kutu ve bir transkripsiyon başlatma bölgesi içeren, bir ökaryotik minimal promotör aşağıdakilerden oluşan, TRE (tetrasiklin-duyarlı öğesi) olarak adlandırılan TetR, teto 24,25 için aynı kökenli DNA bağlanma sitesi birden fazla kopyası katıldı. Üçüncü bileşen TetR, tetrasiklin ya da anhydrotetracycline veya doksisiklin 25 bunun türevleri, biri doğal bir liganddır. Kültür ortamına ligand ilave edilmesinden sonra, TetR teto için afiniteye kaybeder ve TRE ayrışmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, hedef genin transkripsiyonu kaldırılmıştır. Transgen ekspresyonu, bu nedenle sıkı bir şekilde her iki hücre kültüründe, bir zaman ve doza bağlı bir şekilde ve hayvanların 20,23,24 kontrol edilebilir. TTA'nın ile, transgen ekspresyonu, tetrasiklin varlığında dışında, yapısal olarak ortaya çıkar. Tetrasiklin transgen expressio önce sistemden çıkarılması gerekir, bu sitotoksik veya onkojen protein çalışmada bir dezavantaj olabilirN oluşur ve hücre hedef proteinin etkisi izlenebilir. Bu zaman alıcı olabilir ve özellikle transgenik hayvanlarda 27, her zaman tam değil olabilir. Bu sınırlama çözmek için, doksisiklin varlığına ters yanıt veren bir TetR mutant yeni bir transkripsiyon faktörü üretmek için kullanıldı, rtTA 28 (tTA ters). Sadece TRE bağlanan ve eş zamanlı olarak, doksisiklin varlığında transkripsiyonu aktive eder. Sistem, örneğin, kalıntı leakiness. TRE-bağlanmış transkripsiyon faktörünün yokluğunda transgen ekspresyonu, bir genomik entegrasyon sahasında pozisyon etkilerinden ya (i) menşeli, (ii) TRE kendisinin 29, ya da (iii) dan -spesifik tTA / rtTA 28 bağlanmasını, ek bir transkripsiyonel susturucu getirerek hitap etti, sisteme (tetrasiklin bağımlı transkripsiyon susturucu) 30 TTS adlandırılan. Bu rtTA (Şekil 1 e bakınız) ile birlikte bir ikili regülatörü ağı oluşturur.Doksisiklin yokluğunda TTS TRE bağlanan ve aktif bir diğer transkripsiyon kapanır. Doksisiklin varlığında TTS TRE ayrışmaktadır ve rtTA aynı zamanda, hedef genin ekspresyonunu indükleyen bağlar. Sıkılık Bu ek tabaka, yüksek ölçüde aktif, sitotoksik proteinleri 31-34 ifade etmek çoğu zaman gereklidir.

Bu sıkı bir şekilde kontrol çift regülatör sistemi kullanarak, apoptotik kaskad verilen efektör protein, apoptosisin engelleyebilir olmadığı analize izin tanımlanmış bir adımda başlatılabilir. Bu yöntem, yalnızca bakteriyel efektör protein, anti-apoptotik aktivitesi çalışma için kullanılan hem de pro-apoptotik ya da toksik proteinlerin uyanlabilir ifadesi için ya da diğer sinyal yollarının parazit kesme için mümkün değildir.

Protokol

Ilgi konusu proteini eksprese eden kararlı hücre soyları 1. Üretim

  1. Isı ile inaktive edilmiş FCS ve% 1 penisilin / streptomisin eklenmesi ile ortamı hazırlamak ticari olarak temin edilebilen Dulbecco's GlutaMAX-I, piruvat, ve 4.5 g / L D-glükoz ile takviye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) Modifiye etmek.
  2. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de ortam içinde HEK293 hücrelerinin geliştirin. Her üç günde bir hücrelerini Alt yetiştirmek. Ortamı çıkarın ve 15 ml taze medya hücrelerin tekrar süspansiyon. Yeni 75 cm 2 hücre kültürü şişesi içine pipetle 1 ml 14 mi ortamı eklenir.
  3. Hemasitometre kullanarak hücre sayısını analiz.
  4. Oyuk başına 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plaka içerisinde tohum HEK293 hücreleri, 24 saat süre ile inkübe edilir.
  5. Transfeksiyon için transfeksiyon reaktif üreticisi tarafından sağlanan protokolünü kullanır. Transfeksiyon ayıracı kullanılarak pEGFP-C2 ya da pEGFP-C2-CaeB olan hücreleri transfekte. Kullanmak transfeksiyon extra pure ısınmak için önceent ve RT için gerekli ortam. DNA transfeksiyon reaktifi: 1 oranını 3 kullanın.
    1. Ayrıntılı olarak, bir pipet ile doğrudan serumsuz DMEM ortamı içinde 50 ul transfeksiyon reaktifi 1.5 ul. Kompleks oluşumu için, transfeksiyon reaktifi ihtiva eden karışıma kodlayan DNA, GFP ya da GFP-CaeB 0.5 mg pipet ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
    2. Bir damla damla bir tarzda, reaksiyon karışımı ekleyerek hücreleri transfekte ve 24 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
  6. 1 mg ekleme /% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de GFP-pozitif klonların seçilmesi için geneticin'e ml.
  7. : 1 oranında 6 gün sonra, 1, orta ve HEK293 süpernatan barındıran bir 96-çukurlu plaka içinde sıralama akış sitometrisi ile, tek hücrelerin izole eder. 4966 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj edildi kültürlenmiş konfluent HEK293 hücrelerinden HEK293 süpernatant oluşturur.
  8. Ertesi gün, ortam 1,5 ihtiva eden kültür ortamı yerine0 mg / ml genetisin. Haftada bir kez medya değiştirin. Hücreler konfluent tek tabaka oluşturmak için, bir 24-çukurlu plaka aktarın. 1.5 mg / ml genetisin içeren ortamda 5: 1 arasındaki bir oranda, haftada iki kez hücreleri alt yetiştirirler. Son olarak, bağışıklık beneklenme analizi ile GFP-pozitif hücrelerin yüzdesi analiz etmek ve akış sitometrisi.

Bağışıklık beneklenme analizi ile kararlı hücre kuşaklarının 2. analizi

  1. Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C 'de 5 ila 95 ° C'de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri.
  2. % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 4 hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın.
  3. PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0 gözenek boyutu.Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde 45 um).
  4. PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar.
  5. MPT 4 ml anti-GFP antikorunun 4 ul seyreltilir ve 4 ° C'de membranlar O / N inkübe edin.
  6. 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları.
  7. MPT 4 ml yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor, 0.8 ul membranlar inkübe edin.
  8. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (2.6 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın.

3. Bir Akış Sitometreyi Kullanarak Hücreleri analiz edin.

  1. PBS hücrelerin tekrar. Ileri sc ayarlamak için negatif kontrol olarak HEK293 hücreleri kullanınardıl (FSC) ve yan dağılım (SSC) hücreleri ölçekte böylece. Hücre çiftleri, agrega ve hücre artıkları dışlayarak canlı hücrelerin üzerinde bir kapı çizin.
  2. Lekesiz hücreler çok FL1 kanalı (488 nm argon lazer) için histogram soldaki böylece photomultiplier tüp (PMT) kazanç ayarlayın.
  3. HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinin floresan yoğunluğu analiz etmek FL1 kanalının histogram açıp kapı nüfus 10.000 olayları kazanır.
  4. Ticari FACS analiz yazılımı kullanarak verileri analiz.

Uyarımlı Ekspresyon Vektör Sistemi ile Sabit bir Hücre Serisinin 4. transfeksiyonu

  1. Tohum HEK293 hücreleri / oyuk 1 x 10 5 hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bir plaka içerisinde GFP ya da GFP-ifade eden CaeB.
  2. 19 saat sonrası tohumlama, regülatör plazmid ve tepki plazmid ya kodlayan Bax veya aktive kaspaz 3 ile hücreleri co-transfect.
    1. Stabil HEK293 hücrelerinin birlikte transfekte edilmesipWHE125-P regülatörü plazmid 100 ng (Şekil 2) ve yanıt plazmid pWHE655-hBax ya pWHE655-revCasp3 (Şekil 3) ve polietilenimin 0.4 ul, 100 ng.
    2. Opti-MEM ortamı 75 ul DNA ve polietilenimin transfeksiyon reaktifi, her hazırlama ve oda sıcaklığında tam olarak 5 dakika boyunca inkübe edin. Kompleks oluşumu için, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca her iki karışımları birlikte inkübe edilir.
  3. Polietilenimin / DNA solüsyonu damla damla hücrelere ilave edin ve% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.

Apoptoz 5. İndüksiyon

  1. Post-transfeksiyon 5 saat, kültür ortamına 1 ug / ml doksisiklin ilavesiyle pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu indükler. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 18 saat inkübe hücreleri.

İmmünoblot Analizi Ana Hücre Apoptoz 6. Analizi

  1. H öncesinde hücrelerin kontrol edinışık mikroskobu altında arvesting hücre ölümü indüksiyonu için kontrol edin. Apoptotik hücreler ölüyor hücreyi çevreleyen apoptotik cisimlerin varlığıyla algılanabilir vardır.
  2. Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C 'de 5 ila 95 ° C'de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri.
  3. % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 4 hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın.
  4. Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0.45 um gözenek boyutu).
  5. PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar.
  6. 4 μ seyreltinMPT 4 ml anti-ayrıldı poli ADP-riboz polimeraz (PARP) antikorun L ve 4 ° C de O / N inkübe edin.
  7. 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları.
  8. 4 mi MPT içinde seyreltilmiş 0.8 ul yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor ile membranlar inkübe edin.
  9. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (6.7 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın.
  10. 7 mi Western Blot Sıyırma Tamponu ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek suretiyle bağlanan antikorlar çıkarın.
  11. PBS ile üç yıkamadan /% 0.05 (6.7 de tarif edildiği gibi), Tween 20 sonra, 4 ° C'de MPT O / N 4 ml anti-aktin antikor 4 ul membranlar prob.
  12. (6.7 de tarif edildiği gibi) MPT üç yıkama aşamasından sonra, ho, 0.8 ul membranlar inküberseradish peroksidaz-konjuge sekonder antikor MPT 4 ml seyreltilmiştir.
  13. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra,% 0.05 / PBS ile membranlar 6.7 de tarif edildiği gibi Tween 20 (üç defa yıkamak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için bir film gelişimi için standart donanım uygulayın.
    Not: Tüm bekletme işlemleri, belirtilen süre ve sıcaklıkta, bir plaka karıştırıcısı üzerinde gerçekleştirilmiştir.

Sonuçlar

İlk olarak, bir GFP füzyon proteini olarak kararlı bir şekilde ilgi (CaeB) proteinini eksprese eden HEK293 hücre soyları kurulmuştur. Bir kontrol olarak, kararlı bir şekilde GFP eksprese eden HEK293 hücre hatları da oluşturulmuştur. GFP ve GFP-CaeB sentezlenmesi bağışıklık beneklenme analizi ile doğrulanmıştır. Örnek immünoblot (Şekil 4A), GFP ve GFP-CaeB istikrarlı ve net bir şekilde tespit edilebilir ifadesi gösterilmiştir. Tüm hücreleri GFP veya GFP-CaeB ifade edip Anca...

Tartışmalar

Birçok patojen bakteri salgılar veya konakçı hücreye bakteri efektör proteinleri yerini değiştirmek için salgılama sistemleri liman. Bu efektör proteinler bakteriler hayatta ve ilgili hücre içi niş içinde kopyalanmasına olanak tanıyan, konakçı hücre süreçleri ve yolların modüle kapasitesine sahiptir. Biyokimyasal faaliyetler ve efektör proteinlerin moleküler mekanizmaların anlaşılması patojenite daha iyi anlaşılmasına yönelik yardımcı olacak ve bu hastalıkla mücadele için yeni teda...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMlife technologies31966-021
FCSBiochromS0115
Pen/Streplife technologies15140-122
OptiMEMlife technologies51985
X-tremeGENE 9Roche6365752001
GeneticinRothCP11.3
PolyethyleniminePolyscienes23966
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad170-3940
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Scientific26616
PVDF membraneMilliporeIPVH00010
anti-GFP life technologiesA6455
anti-cleaved PARPBD Bioscience611038
anti-actinSigma AldrichA2066
Mouse IgG (H+L)-HRPODianova111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPODianova111-035-045
ECL Western Blotting SubstrateThermo Scientific32106
Restore Plus Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46428

Referanslar

  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

EnfeksiyonSay 100ApoptozBaxKaspaz 3Coxiella burnetiiDoksisiklinefekt r proteinnd klenebilir ifadedengeli h cre izgisiTet sistemiTip IV salg lama sistemi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır