誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

要約

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

要約

ここに提示された技術は、いずれかの標的タンパク質、あるいは小分子ステップれる分析することができ、シグナル伝達経路の構成要素と相互作用します。この方法は、選択されたシグナル伝達カスケードで定義され、所定のステップでシグナル伝達事象を開始するために、一方では、特定のタンパク質の誘導性発現に基づいています。一方、目的の遺伝子の同時発現は、その後発現される標的タンパク質の活性が上流または開始シグナル伝達事象の下流で、得られたシグナル伝達経路の読み出しに依存する場合、治験責任医師が評価することができます。ここでは、アポトーシスカスケードは、プロトコル機能性を実証するために定義されたシグナル伝達経路として選択しました。例えば、 コクシエラバーネッティなどの病原性細菌は、細胞内の細菌の生存を確保するために、それらのを促進するために宿主細胞において、宿主細胞死の誘導を妨害するエフェクタータンパク質を転生物における普​​及。 C.バーネッティエフェクタータンパク質CaeBを効果UV光を伴うまたはスタウロスポリンでのアポトーシスの誘導後に宿主細胞の死を阻害します。 CaeBはアポトーシスシグナルの伝達を妨害するステップで絞り込むには、十分に特徴付けられたプロアポトーシス活性を有する選択されたタンパク質は、ドキシサイクリン誘導性の方法で一時的に発現させました。 CaeBはこれらのタンパク質の上流に作用する場合、アポトーシスが妨害されずに続行されます。 CaeB下流に作用する場合、細胞死が阻害されます。選択した試験タンパク質は、主要な執行プロテアーゼであるミトコンドリアのレベルで作用バックス、およびカスパーゼ3でした。 CaeBはBax発現により誘導される細胞死を妨害ではなく、カスパーゼ3発現による。 CaeBは、したがって、これら2つのタンパク質間のアポトーシスカスケードと相互作用します。

概要

多くのグラム陰性細菌病原体の毒性は、真核生物宿主細胞をハイジャックするための特殊な分泌系に依存します。細菌は細胞および生化学のさまざまな活動を調節するために宿主細胞への細菌の病原性タンパク質（エフェクター）を注入するために、これらの分泌系を使用しています。エフェクタータンパク質の研究では、ホスト/病原体相互作用の基本的な側面にも真核細胞¹の基本的な生物学に顕著な洞察を提供しているだけではなく。宿主細胞のアポトーシスの調節は、多くの細胞内病原体のための重要な病原性機構であることが示されており、アポトーシスを調節するエフェクタータンパク質の数は^2-9同定されています。しかし、活性のそれらの正確な分子機構は、多くの場合、とらえどころのないままです。

アポトーシス、プログラム細胞死の形態は、感染¹⁰に対する免疫応答に重要な役割を果たしています。アポトーシスに導く二つの主要な経路は、持っています特定されて：原形質膜（外因性アポトーシス）で細胞死受容体を介したミトコンドリア（内因性アポトーシス）または信号の直接伝達を標的とします。真性またはミトコンドリア媒介性の細胞死経路は、細胞内シグナルによってトリガーされ、BaxおよびBakの、のBcl-2ファミリーの2プロアポトーシスメンバーの活性化が関与しているされています。このファミリーは、細胞死^を制御^11-14プロおよび抗アポトーシス調節タンパク質で構成されています。アポトーシスの活性化はBaxおよびBakののオリゴマー化につながる細胞質へのシトクロムCの放出をもたらす、ミトコンドリア外膜のその後の透過処理が続きます。シトクロムcの放出は、アポトソーム¹⁵におけるカスパーゼ9の活性化を介してエフェクターカスパーゼ3および7の活性化を開始します。これは、とりわけ、細胞表面¹⁶上のホスファチジルセリンの暴露をもたらす、選択された基質のタンパク質分解をもたらし、CHをフラグメント専用のDNアーゼを解放します^17,18 romatin。

アポトーシスカスケード内の個々のエフェクタータンパク質が干渉を決定するために、誘導可能な発現系は^19を使用しました。導入遺伝子の条件式のための規制システムは、細胞内のタンパク質の機能や組織、器官および生物開発のための重要性だけでなく、開始、進行および疾患^20-23のメンテナンス時の解析に貴重なツールとなっています。典型的には、このようなここで使用のTetシステム²⁴と誘導制御システムは、（ 図1参照）人工的な転写単位を形成します。一方の成分は、転写活性化または^24,26のサイレンシングを媒介する哺乳動物タンパク質ドメインに細菌転写抑制のTetR ²⁵の融合によって形成されたtTA（テトラサイクリン依存性転写活性化因子）と呼ばれる人工的に操作した転写因子を、あります。第二成分は、ハイブリッドでありますプロモーター、真核生物の最小プロモーターからなる、TRE（テトラサイクリン応答性エレメント）と呼ばれる、少なくともTATAボックスおよび転写開始部位を含む、のTetR、 のtetO ^24,25用の同族のDNA結合部位の複数の反復に接合。第三成分がのTetR、テトラサイクリンまたはそのようなアンヒドロやドキシサイクリン²⁵その誘導体、の1の天然リガンドです。培地へのリガンドを添加すると、のTetRはのtetOに対するその親和性を失い、TREから解離します。その結果、標的遺伝子の転写が廃止されています。導入遺伝子の発現は、このように、しっかりと両方の細胞培養および動物^20,23,24における時間および用量依存的に制御することができます。 tTAをして、導入遺伝子の発現は、テトラサイクリンの存在を除いて、構成的に発生します。テトラサイクリンは、最初の導入遺伝子の前に、システムから除去されなければならないので、これは細胞毒性または発癌性タンパク質の研究で不利であることができるexpressionが起こると、細胞上の標的タンパク質の効果をモニターすることができます。これは時間がかかり、特にトランスジェニック動物において、常に²⁷完了していないことができます。この制限に対処するために、ドキシサイクリンの存在に逆応答とのTetR変異体は、新しい転写因子を生成するために使用された、rtTAの^28（tTAをリバース）。それはTREに結合し、同時に、ドキシサイクリンの存在下で転写を活性化するのみ。残留システムの漏れやすさ、 すなわち 、TRE結合転写因子の非存在下での導入遺伝子の発現は、ゲノム組み込み部位での位置効果から（I）のいずれかを発信し、（ii）のTRE自身^29、または（iii）からの非から固有のtTA / rtTAの²⁸の結合、追加の転写サイレンサーを導入することによって対処された、システムに（テトラサイクリン依存性転写サイレンサー^）30のtTSと呼ばれます。これは、rtTAの（ 図1参照）と一緒に二重の調節ネットワークを形成します。ドキシサイクリンの非存在下では、TTSはTREに結合し、積極的に残りの転写をシャットダウンします。ドキシサイクリンの存在下では、TTSはTREから解離したrtTAを同時に標的遺伝子の発現を誘導結合します。ストリンジェンシーのこの追加の層は、高活性の細胞毒性タンパク質^31〜34を発現することがしばしば必要です。

この厳密に制御デュアルレギュレータ方式を使用して、アポトーシスカスケードは、与えられたエフェクタータンパク質は、アポトーシス誘導を妨害することができるかどうかの分析を可能にする定義された段階で開始することができます。この方法は、細菌のエフェクタータンパク質の抗アポトーシス活性を研究するために使用されるだけでなく、プロアポトーシスまたは毒性タンパク質の誘導性発現のために、または他のシグナル伝達経路との干渉を解剖するためのすることはできません。

プロトコル

目的のタンパク質を発現する安定な細胞株の1世代

1. 熱不活性化FCSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することによって、メディアの準備は、市販のダルベッコのグルタマックスI、ピルビン酸、および4.5グラム/ LのD-グルコースを補充したイーグル培地（DMEM）を改変します。
2. 5％CO ₂中、37℃で培地中でHEK293細胞を育成。二日おきに細​​胞をサブ養います。メディアを取り出し、そして15mlの新鮮な培地で細胞を懸濁します。新しい75cm ^2の細胞培養フラスコにピペット1ミリリットルと14ミリリットルのメディアを追加します。
3. 血球計数器を用いて細胞数を分析します。
4. ウェルあたり2×10 ⁵細胞の密度で6ウェルプレート中のHEK293細胞をシードし、24時間インキュベートします。
5. トランスフェクションのためにトランスフェクション試薬の製造業者によって提供されるプロトコルを使用しています。トランスフェクション試薬を使用したpEGFP-C2かのpEGFP-C2-CaeBで細胞をトランスフェクトします。使用前に、トランスフェクションREAGを温めますENTとRTに必要なメディア。 DNAにトランスフェクション試薬の1の比率：3を使用してください。
   1. 具体的には、ピペットトランスフェクション試薬1.5μlの直接無血清DMEM培地50μlの中へ。複合体形成のために、トランスフェクション試薬を含有する混合物にDNAをコードするGFPまたはGFP-CaeB0.5μgのピペットを、室温で15分間インキュベートします。
   2. 滴下様式で、反応混合物を添加することにより細胞をトランスフェクトし、24時間、5％CO ₂中、37℃でインキュベートします。
6. 1 mgの追加/ 5％CO ₂中37℃でGFP陽性クローンの選択のためのゲネチシンミリリットル。
7. 1比：6日後、1媒体及びHEK293上清を保有する96ウェルプレートでのソート、フローサイトメトリーにより単一細胞を単離します。 4966×gで15分間遠心分離し、培養し、コンフルエントHEK293細胞からのHEK293上清を生成します。
8. 次の日に、1.5を含む培地で培地を交換し0; mg / mlのジェネティシン。週に一度メディアを変更します。細胞がコンフルエントな単層を形成する場合は、24ウェルプレートに移します。 1.5 mg / mlのジェネティシンを含む培地中で5：1の割合で週二回の細胞をサブ養います。最後に、免疫ブロット分析によってGFP陽性細胞の割合を分析し、フローサイトメトリー。

イムノブロット分析により安定な細胞株の2分析

1. 上清を除去し、温かいPBSで一度付着した細胞を洗浄します。 2×Laemmliサンプルバッファー、95℃で5分間加熱し、-20℃で保存100μlの細胞を再懸濁します。
2. 負荷12％SDS-PAGEゲル上でサンプル当たり約4×10 ⁴細胞。また、分子量マーカーとして市販のタンパク質ラダーの負荷6μL。 1×レムリランニング緩衝液で45〜60分間、180 Vの定電圧下でのゲル電気泳動システムでゲルを実行します。
3. PVDF膜上にブロットタンパク質（0の細孔サイズ。トランスブロットSDセミドライトランスファーセルを用いて60分間、16 Vの定電圧で45ミクロン）。
4. 室温で1時間、PBS / 0.05％のTween 20（MPT）中の5％脱脂粉乳の10ミリリットルのブロック膜。
5. MPTの4mlに抗GFP抗体の4μLを希釈し、4℃で膜をO / Nインキュベート。
6. 10mlのPBS / 0.05％Tween 20で3 10分間の洗浄工程を実行します。
7. MPTの4ミリリットル中に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を0.8μlの膜をインキュベートします。
8. RTで1時間インキュベートした後、PBS / 0.05％Tween20で膜を3回洗浄する（2.6参照）と製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出します。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。

3.フローサイトメーターを用いて細胞を分析します。

1. PBSで細胞を再懸濁します。フォワード皮下調整する陰性対照としてHEK293細胞を使用してatter（FSC）および側方散乱（SSC）は、細胞スケールであることになります。細胞ダブレット、凝集体および細胞破片を除くことにより、生細胞にゲートを描きます。
2. 未染色細胞がはるかにFL1チャネル（488 nmのアルゴンレーザー）のヒストグラムの左側にあるように、光電子増倍管（PMT）のゲインを調整します。
3. HEK293-GFP及びHEK293-GFP-CaeB細胞の蛍光強度を分析するためにFL1チャネルのヒストグラムを開き、ゲーテッド集団に10,000事象を獲得します。
4. 商業FACS分析ソフトウェアを用いてデータを分析します。

誘導性の発現ベクター系で安定細胞株の4トランスフェクション

1. シードHEK293細胞を安定/ウェルの1×10 ⁵細胞の密度で12ウェルプレート中でGFPまたはGFP-CaeBを発現します。
2. 19時間後播種、レギュレータプラスミドと応答プラスミドエンコードのBaxまたは活性化カスパーゼ3のいずれかで細胞を同時トランスフェクト。
   1. 安定したHEK293細胞を共トランスフェクトpWHE125-Pレギュレータプラスミド（ 図2）と応答プラスミドpWHE655-hBaxまたはpWHE655-revCasp3（ 図3）とポリエチレンイミンの0.4μlと100 ngの100 ngのと。
   2. のOpti-MEM培地の75μlのDNAおよびポリエチレンイミントランスフェクション試薬をそれぞれ調製し、室温で正確に5分間インキュベートします。複合体形成のために、室温で15分間、両方の混合物を一緒にインキュベートします。
3. ポリエチレンイミン/ DNA溶液を滴下細胞を追加し、5％CO ₂中、37℃でインキュベートします。

アポトーシスの誘導5。

1. トランスフェクション後5時間では、培養培地への1 / mlのドキシサイクリンを添加することによって、プロアポトーシスタンパク質の発現を誘導します。 5％CO ₂中、37℃で18時間、細胞をインキュベートします。

イムノブロット分析によって宿主細胞のアポトーシスの6分析

1. 時間の前に細胞を検査細胞死誘導を確認するために、光学顕微鏡下でarvesting。アポトーシス細胞は死にかけのセルを囲むアポトーシス体の存在によって検出可能です。
2. 上清を除去し、温かいPBSで一度付着した細胞を洗浄します。 2×Laemmliサンプルバッファー、95℃で5分間加熱し、-20℃で保存100μlの細胞を再懸濁します。
3. 負荷12％SDS-PAGEゲル上でサンプル当たり約4×10 ⁴細胞。また、分子量マーカーとして市販のタンパク質ラダーの負荷6μL。 1×レムリランニング緩衝液で45〜60分間、180 Vの定電圧下でのゲル電気泳動システムでゲルを実行します。
4. トランスブロットSDセミドライトランスファーセルを用いて60分間、16 Vの定電圧でPVDF膜上にブロットタンパク質（孔径0.45μmの）。
5. 室温で1時間、PBS / 0.05％のTween 20（MPT）中の5％脱脂粉乳の10ミリリットルのブロック膜。
6. 4μを希釈MPTの4ミリリットル中の抗切断ポリADPリボースポリメラーゼ（PARP）抗体のLと4℃でO / Nインキュベート。
7. 10mlのPBS / 0.05％Tween 20で3 10分間の洗浄工程を実行します。
8. 4ミリリットルMPTで希釈した0.8μ​​lの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を有する膜をインキュベートします。
9. RTで1時間インキュベートした後、PBS / 0.05％Tween20で膜を3回洗浄する（6.7参照）と製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出します。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。
10. 7ミリリットルウエスタンブロットストリッピング緩衝液で室温で30分間のインキュベーションによって結合した抗体を除去します。
11. PBS / 0.05％のTween 20（6.7を参照）で3回洗浄した後、4℃でMPT O / N 4ml中の抗アクチン抗体4μlので膜をプローブ。
12. MPT（6.7で説明したように）で3回の洗浄工程の後、ホの0.8μlの膜をインキュベートrseradishペルオキシダーゼ結合二次抗体は、MPTの4ミリリットルに希釈しました。
13. 室温で1時間インキュベートした後、0.05％/ PBSで膜を6.7に記載されているようにトゥイーン20を（3回洗浄し、製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。
    注：全てのインキュベーションステップは示された時間および温度で、プレートシェーカー上で実施しました。

結果

まず、GFP融合タンパク質として安定に関心（CaeB）のタンパク質を発現するHEK293細胞株を樹立しました。対照として、安定的にGFPを発現するHEK293細胞株も作製しました。 GFPおよびGFP-CaeBの発現は、免疫ブロット分析によって確認しました。代表的なイムノブロット（ 図4A）は、GFPおよびGFP-CaeBの安定と明確に検出可能な発現を示しています。しかし、このアッセイは、全ての細胞?...

ディスカッション

多くの病原性細菌は、宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の分泌または転位する分泌系を保有します。これらのエフェクタータンパク質は、細菌が生存し、それらのそれぞれの細胞内ニッチ内で複製することができ、宿主細胞内でプロセスおよび経路を調節する能力を有します。生化学的活性およびエフェクタータンパク質の分子機構を理解することは、病原性のより良い理解に向?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	life technologies	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Strep	life technologies	15140-122
OptiMEM	life technologies	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polyethylenimine	Polyscienes	23966
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26616
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
anti-GFP	life technologies	A6455
anti-cleaved PARP	BD Bioscience	611038
anti-actin	Sigma Aldrich	A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Scientific	32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	46428