Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

Özet

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

Özet

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

Giriş

Gzms özel CTL lizozomlar ve NK hücrelerinin ¹ lokalize yüksek ölçüde homolog serin proteaz ailesidir. Bu katil hücreler ve sitotoksik zerreler, aynı zamanda ortadan kaldırılması ^2,3 için olan bir hedef hücrenin tanınması üzerine Gzms ile eşzamanlı olarak serbest bırakılır membran kesintiye proteinleri PFN ve GNLY içerir. (- G, K, M ve N GzmA), insanlarda (GzmA, B, H, K ve M,), beş Gzms ve farelerde 10 Gzms vardır. GzmA ve GzmB en bol ve yaygın insan ve farelerde ¹ çalışılmıştır bulunmaktadır. Ancak, daha yeni çalışmalar hücre ölümü yollar yanı sıra sağlık ve hastalık ⁴ diğer, sözde yetim Gzms aracılık ettiği ek biyolojik etkilerini araştırmak başladı.

PFN ^5,6 hedef hücrelere verilebilir olduğunda Gzms en iyi bilinen işlevi, GzmA ve GzmB, özellikle de memeli hücrelerinde programlanmış hücre ölümü meydana gelmesidir. AncakDaha yeni çalışmalar da PFN ^7,8 bağımsız Sitozolik teslimat, bağışıklık düzenleme ve inflamasyon üzerinde derin etkisi olan Gzms dışı etkilerini göstermiştir. Gzms sitozolik girmesinden sonra verimli öldürüldüğü hücrelerin spektrumu yakın zamanda bakterilerin ^9,10 ve hatta bazı parazitler ¹¹ memeli hücrelerinden genişletilmiştir. Bu yeni keşifler Gzm araştırmacılar için yepyeni bir alan açtı. Bu nedenle, maliyet-etkin, yüksek verim memeli sentezleme sistemi önemli ölçüde o gelecek çalışmalar için yol kolaylaştıracaktır.

Ana insan, fare ve sıçan Gzms başarılı bir CTL ve NK hücre hatları ^12-14 granül fraksiyonundan saflaştırılmıştır. Bununla birlikte, elimizdeki tür saflaştırma tekniklerinin verimi daha az, 0.1 mg / L hücre kültürü (yayınlanmamış gözlem ve ¹²⁾ aralığındadır. Bundan başka, tasarımlarıyla ile kirlenme olmadan, tek bir GZM kromatografik çözünürlüğür Gzms ve / veya granül halinde de mevcut proteinler (yayınlanmamış veriler ve ^12,14) meydan okuyor. Rekombinant Gzms hatta HEK 293 ^18,19 gibi memeli hücrelerinde bakteriler ^15, maya ^16, böcek hücreleri ¹⁷ ve üretildi. Sadece, memeli ekspresyon sistemleri nativ sitotoksik protein aynı translasyon sonrası modifikasyonlar ile, rekombinan enzimler meydana potansiyeli taşımaktadır. Posttranslasyonel değişiklikler endositoz belirli alımı ve hedef hücrelerin ^20-22 içinde proteaz hücre içi lokalizasyonu ile suçlanmıştır. Bu nedenle, pHLsec ²³ kullanılarak Gzm ifade plazmid omurgası olarak (Radu Aricescu ve Yvonne Jones, Oxford, UK Üniversitesi bir tür hediye), biz yüksek verim protein üretimi için basit, zaman ve maliyet-etkin bir sistem kurdu HEK293T hücreleri. pHLsec tavuk Β-aktin promoteri ile bir CMV artırıcı birleştirir; Birlikte, bu elemanlar gösterilerted çeşitli hücre hatlarında ²⁴ güçlü promotör aktivitesi. Buna ek olarak, plazmid, bir tavşan Β-globin intronu, optimize edilmiş bir Kozak ve sekresyon sinyalleri, bir Lys-6xHis-tag ve bir poli-A sinyali içerir. Uçlar sekresyon sinyali ve uygun N-terminal etki alanları yoksun proteinler için uygun bir ifade ve sekresyon etkinliğin sağlanması Lys-6xHis etiketi (Şekil 1) arasında uygun bir klonlanabilir. Gzms ekspresyonu sağlamak için, böylece EK tedavisi salgılanan Gzms (aktif Gzms N-terminali ile başlayan aktive bir enterokinaz (EK) Alanı (DDDDK) ve ardından vektör tarafından sağlanan salgılama sinyal ile endojen salgılama sinyal dizisi yerine amino asit sekansı IIGG ^25). Buna ek olarak, bu yöntem için lehine HEK293T hücreleri, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) gibi düşük fiyatlı bir ortam içinde hızlı bir şekilde büyümesi ve maliyet-etkin bir kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi için de uygundur.

Protokol

Sentezleme plasmidi pHLsec-Gzm 1. Üretim

1. Insan NK hücrelerinden manufacturer` izlenerek uygun bir RNA izolasyon yöntemi ile ve bir birinci tür cDNA sentez kiti kullanılarak ters transkribe ⁽²⁶ ya da beş, insan Gzms ifade NK hücre hattı NK-92 gibi hazırlanmıştır birincil hücreler) ve toplam RNA'nın hazırlanması s önerileri. ²³ (Radu Aricescu Yvonne Jones, Oxford Üniversitesi, İngiltere tür bir hediye) 'de tarif edildiği gibi Gzm cDNA Agel ve Kpnl sitesi (Şekil 1) kullanılarak pHLsec PCR ve klon kullanılarak yükseltin.
   Not: Tablo 1 'de gösterilen aşağıdaki primerler kullanın.
2. Dizileme ile doğru ekler onaylayın. DH5α hücrelerinde ifade plasmidlerini genişletin ve bir endotoksin içermeyen plazmid izolasyon kiti kullanılarak arındırmak ve üreticinin talimatlarına uyun.
3. Unti -20 ° C 'de 2 mg / ml ve saklamak bir konsantrasyonda endotoksin içermeyen, steril su içinde yeniden süspanse edilen saflaştırılmış plasmidler,l kullanımı.

HEK293T hücrelerinde Gzms 2. İfade

1. Reaktiflerin hazırlanması
   1. Standart kültür ortamı hazırlayın. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içeren, yüksek glikoz (25 mM), Glutamax (4 mM), sodyum piruvat (1 mM) (standart fetal buzağı serumu (FCS), penisilin (100 birim / ml), streptomisin ve% 10 ilave 100 ug / ml).
   2. Transfeksiyon ortamı hazırlayın. Penisilin-Streptomisin olmayan kültür ortamına 25 ug / ml miktarında klorokuin katılımının (-20 ° C'de saklanan PBS 1,000x hisse senetleri, gelen transfeksiyon gününde taze olarak ilave) ekleyin.
   3. Serumsuz kültür ortamı hazırlayın: serumsuz ortam için HEK293 hücreleri glutamin (4 mM), penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve 2,5 mg / L amfoterisin B add
   4. Kullanmadan önce, bir 0.45 um filtre ile Tablo 2 ve filtre açıklanan çözümler hazırlayın:
2. HEK293T hücreleri genişletme
   1. 20 ml kült HEK293T hücreleri büyütün150 x 25 mm doku kültürü yemekleri kullanarak ure orta.
   2. % 80 confluency Split hücreleri (1 split oranı: 4, genellikle her ^3. gün). Hücreler gevşek mekanik olarak titizlikle yukarı ve aşağı pipetleme tripsinleme olmadan ayrılabilir, ekleyin.
   3. Levha hücreleri, transfeksiyondan önceki gece transfeksiyonu (tohum ekme yoğunluğu ~ 2 x 10 ⁵ hücre / ml) günde% 60-70 konfluense elde edildi. Bir zamanki hazırlık boyutu 20-25 kültür kaplarına oluşmaktadır.
3. Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu
   1. Transfeksiyondan önce 1 saat, 20 ml transfeksiyon ortamı, standart kültür ortamı değiştirin. Bu 1 saat inkübasyon aşamasının sonuna doğru, 10.95 mi GKD ₂ 0 ve 50 ml tüpler içinde 2M _CaCl2 1.55 ml (1 tüp / 5 yemekler) ile plazmid DNA, 400 ug karıştırın.
   2. 1 transfeksiyondan önce, en az 2, DNA-kalsiyum çözeltisinin 12.5 ml 12.5 mi 2x HBS ekleyin tüpler ters çevirme ile karıştırın ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edilir.
   3. Th ekleE karışımı doğrudan hücreleri (tabak başına 5 mi), damla damla ortama 2.3.2 hazırlandı. Biraz turuncu renk orta dönüm tüm alana eşit serpin.
   4. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 7-11 saat (37 ° C,% 5 nemlendirilmiş hava içinde _CO2) için kültür kaplarına inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ince bir çökelti görülebilir. Önceden ısıtılmış PBS ile dikkatle yıkayın, transfeksiyon Ortamı çıkarın ve 2.1.3 hazırlanmış 20 mi serumsuz kültür ortamı ilave edin. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 72 saat süreyle inkübe edilir.
   5. SDS-PAGE üzerinde hücre yüzer bir numunesi (~ 20 ul) çalışan ve bir granzim bant görselleştirmek için Coomassie Brillant Blue ile soylara ile transfeksiyonu ve ekspresyonudur etkinliğini analiz edin.
4. Nikel IMAC ile kültür süpernatanından Gzms saflaştırılması
   1. Kuluçkadan sonra, 250 ml tüpler içine hücre kültürü süpernatanları süzün ve santrifüj ile temiz. İlk bir spin yürütmek (400 xg, 10 dak, 4 °Müstakil hücrelerden orta silinir C). Kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için 4 ° C sıcaklıkta 4000 x g'de, 30 dakika taze 250 ml tüpler ve spin süpernatant aktarın.
   2. 5 M NaCl 5 mi, temizlenmiş süpernatan, 250 ml başına 0.25 M N'nin ₄ 6,25 2 M Tris-Base (pH 8) içinde çözdürülür ve 1 ml ilave edilir. 500 ml Vakum filtre ünitesi (0.45 mm) kullanılarak süpernatant süzün.
   3. Uygun bir FPLC sistemi kullanılarak His-bağlama tamponu A (10 kolon hacim, CV) bir nikel-IMAC sütunu dengelenmesi.
   4. 4 ° C de, 0.5 ml / dk'lık bir akış oranında dengelenen kolona süpernatant uygulanır.
   5. Süpernatan tatbik edilmesinden sonra UV emilimi temel (genellikle 10 CV) ulaşana kadar, His-bağlama tamponu ile kolondan yıkanır.
   6. Elute Gzms 0.5 ml bir akış hızında doğrusal bir 20 ml'lik gradyanı (0-250 mM imidazol) ile 2 ml / dakika-fraksiyonlar toplanırken. SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile elüsyon fraksiyonları analiz edin.
5. Enterokinaz (EK)işleme ve katyon değişim kromatografisi ile son temizlik
   1. ≤10 MWCO bir dializ tüpü içinde kısımlar içeren havuz Gzm. Ön-EK kontrol olarak -20 ° C'de küçük bir örnek saklayın.
   2. Diyaliz tüpü içinde doğrudan toplanmış fraksiyonuna 0.02 birim / ilk süpernatan 50 ml EK ekleyin ve O / N EK-tampon maddesi içinde oda sıcaklığında (en az 16 saat) (4 L, bir kez değiştirme tamponu) diyaliz.
   3. Ertesi gün, EK, SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile ön-EK kontrol ile karşılaştırıldığında Gzms tedavi analiz eder.
   4. N-terminal işlem tamamlandığında, bir (4 L) tampon S diyaliz tamponu değiştirmek ve oda sıcaklığında bir 4 saat diyaliz. Filtre diyalizat (0.45 mikron).
   5. 4 ° C de, 0.5 ml / dk'lık bir akış oranında sütunun üzerinde örnek kuvveti S tampon maddesi A ile S-sütunu dengelenmesi.
   6. UV absorbans taban (10 CV) ulaşılana kadar numunesi yüklemesinden sonra, S tampon A ile bir sütun yıkayın. 30 mi lineer gradyan (150 ila 1000 mM NaCI) ile Gzms yıkayın. GzmA E~ 750 mM NaCl'de ~ 700 mM NaCI ve GzmM de ~ 650 mM NaCI, GzmB de dolgu maddeleri.
   7. SDS-PAGE ve kolorimetrik analizler (aşağıya bakınız) ile elüsyon fraksiyonları analiz edin. Gzms ve konsantre içeren havuz kısımlar (yaklaşık 30 kat, 100 uM bir konsantrasyona kadar), eğirme filtresi (15 mi, 10 MWCO). -80 ° C 'de konsantre edilir Gzm preparatlar ve mağaza kısım.

3. Test Gzm etkinliği

1. Reaktiflerin hazırlanması
   1. 50 mM Tris-Base, pH 7: kolorimetrik deney tamponu hazırlayın.
      1. GzmA ölçülmesi için, 0.2 mM ve 5,5'-ditiyo-bis (2-nitrobenzoik asit) 'in bir nihai konsantrasyona kadar deney tamponu Na-CBZ-L-lisin tiyobenzil ester (S-Bzl) (BLT) ekleyin 0.22 mM bir konsantrasyona kadar (DTNB). GzmB için, 0.2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) ve 0.22 mM DTNB bulunmaktadır. GzmM için, 0.2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (pNA) (AAPL) içerir. Sentetik peptidler DMSO içinde (uygun ana çözeltilerden ilave edilmiştir, stored taze tahlil önce tampon -20 ° C).
   2. Klivaj deneyi tamponu hazırlayın: 100 mM NaCI, 50 mM Tris-baz, pH 7.5
2. Kolorimetrik analizler
   1. 96-gözlü düz dipli plakalarda elüsyon fraksiyonları küçük Gzm örnekleri (<5 ul) veya konsantre stok dağıtın. Bir pozitif kontrol (test edilen Gzm müstahzarlar ya da ham olarak NK hücre lizatları) ve bir negatif kontrol (sadece tampon) içerir.
   2. (Bir çok kanallı pipet kullanarak) her bir oyuğa, deney tamponu içinde 100 ul ekle. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin. Mikroplaka okuyucu içinde 405 nm'de OD'yi ölçün.
3. Klivaj deneyi
   1. Seri seyreltme ile; - saflaştırılmış maddeleri kullanarak bölünme tahlilleri için, (verimli Gzm yüzeylerde birkaç örnek bu bölümün sonundaki sonuç bölümünde ve notta sunulmuştur 400 nM doğal veya rekombinant, 100) bir protein substrat ko-inkübe Bir GZM çeşitli kez deney tamponu (400 nM'de başlayarak).SDS-PAGE ve Coomassie ya da gümüş lekeleme ile analiz; ya da Batı spesifik antikorlar kullanılarak kurutma.
   2. Hücre lizatları kullanılarak klivaj deneyleri için, 37 ° C olmak üzere üç kez, bir etanol / kuru buz banyosunda ve eritme dondurma ile deney tamponu ve parçalanmasıyla, 1 ml, 10 ⁶ HeLa hücreleri (ya da herhangi bir uygun tümör hücre hattı) askıya. (4 ° C'de 10 dakika boyunca 15,000 x g) santrifüj uygulanarak hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır.
   3. Yukarıdaki gibi çeşitli konsantrasyonlarda ve zaman zaman Gzms ile temizlenir lizat Co-kuluçkaya yatmaktadır. Yarılma uygun antikorlar kullanılarak imünolekeleme ile tespit edilir.
      Not: iyi niyetli alt tabakalar bir kaç örnekleri ticari antikorlar mevcuttur: Teklif (BH3 etkileşen etki ölüm agonisti) ve GzmB ^27,28 parçalanabilen kaspaz 3; GzmA ²⁹ ile parçalanabilen çok heterojen bir çekirdek ribonükleoprotein (hnRNPA1, A2 ve U); GzmM ³⁰ ile sitomegalovirüs phosphoprotein 71.

Sonuçlar

Aşağıdaki bölümde yöntemi aydınlatmak için bir GzmA hazırlık tam bir dokümantasyon sunacak. Ayrıca başarılı saflaştırma etkinliği ve aktivitesi ile ilgili olarak benzer sonuçlar üreten GzmB ve GzmM saflaştırılmıştır. Ancak, bu daha sonraki hazırlıkları sadece verilerin birkaç seçilmiş parçaları gösterecektir. Mevcut protokolü takip eden 293T hücrelerinden elde GzmB preparatları çeşitli biyolojik deney sistemlerinde ^9,29,31-34 etkinliklerini vurgulayarak Yayınlanmış b...

Tartışmalar

GzmA ve GzmB klasik ve yaygın olarak çalışılan bir rol gözenek oluşturucu protein PFN ¹ kendi sitosolik doğumdan sonra memeli hücrelerinde apoptosisin olduğu. Son zamanlarda, Gzms sitotoksik spektrumu bakteri ^9,10, ve de bazı parazitler ¹¹ için memeli hücrelerinden önemli ölçüde genişletildi. Ayrıca, GzmA ve GzmB olmayan klasik, hücre dışı fonksiyonları yanı sıra çeşitli yetim Gzms biyolojik önemi hala karanlıktır. Bu protokol tarafından sağlanan nedenle,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596-026	Total RNA isolation kit
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530L
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells	Sigma	14571C
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	31966-021
SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO	Thermo Scientific	68100
Enterokinase from bovine intestine	Sigma	E4906	recombinant, ≥20 units/mg protein
HisTrap Excel 5 ml column	GE Healthcare	17-3712-06	Nickel IMAC
HiTrap SP HP 5 ml column	GE Healthcare	17-1152-01	S column
N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)	Sigma	C3647	GzmA substrate
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)	MP Biomedicals	2193608 _10mg	GzmB substrate
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)	Bachem		GzmM substrate
5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)	Sigma	D8130	Ellman`s reagent