A High Yield e custo-eficiente sistema de expressão de Granzimas Humanos em células de mamíferos

Resumo

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

Resumo

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

Introdução

Os Gzms são uma família de serina-proteases altamente homólogas localizadas nos lisossomas especializados de CTL e as células NK ^1. Os grânulos citotóxicos destas células assassinas, também contêm as proteínas de membrana de desregulação e PFN GNLY que são libertadas em simultâneo com as Gzms no reconhecimento de uma célula alvo destinado à eliminação ^2,3. Existem cinco Gzms em seres humanos (GzmA, B, H, K e M), e 10 em ratos (Gzms GzmA - G, K, M e N). GzmA e GzmB são os mais abundantes e extensivamente estudados em humanos e ratos ^1. No entanto, estudos mais recentes começaram a investigar os percursos de morte celular, bem como os efeitos biológicos adicionais mediadas pelos outros, os chamados Gzms órfãos na saúde e na doença ^4.

A função mais conhecida das Gzms, em particular de GzmA e GzmB, é a indução de morte celular programada em células de mamífero quando entregue nas células alvo por PFN ^5,6. Porém, Estudos mais recentes também demonstraram efeitos extracelulares dos Gzms com profundo impacto sobre a regulação imune e inflamação, independentemente da entrega cytosolic pela PFN ^7,8. O espectro de células que são mortos de forma eficiente após a entrada cytosolic dos Gzms também foi recentemente alargado a partir de células de mamíferos para ^9,10 bactérias e até mesmo certos parasitas ^11. Estas descobertas recentes abriu um novo campo para pesquisadores GZM. Portanto, um, de alto rendimento do sistema de expressão de mamífero custo-eficiente irá facilitar significativamente o caminho para esses estudos futuros.

Humanos, ratos e de camundongos Gzms nativas foram purificados com sucesso a partir da fracção de grânulos de CTL e células NK linhas ^12-14. No entanto, nas nossas mãos o rendimento de tais técnicas de purificação está na gama de menos do que 0,1 mg / L de cultura de células (observação não publicada e ^12). Além disso, a resolução cromatograf ica de um único GZM sem contaminação por outrr Gzms e / ou proteínas que também estão presentes nos grânulos é um desafio (dados não publicados) e ^12,14. Gzms recombinantes foram produzidas em bactérias, leveduras ^{15 16 17,} células de insecto e em ainda em células de mamífero, tais como células HEK 293 ^18,19. Apenas os sistemas de expressão de mamífero suportar o potencial para produzir enzimas recombinantes com modificações pós-tradução idêntica à proteína nativa citotóxico. Modificações pós-tradução têm sido implicados com a captação especifica por endocitose e a localização intracelular da protease dentro das células alvo ^20-22. Portanto, usando pHLsec ²³ (um presente tipo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, da Universidade de Oxford, Reino Unido) como a espinha dorsal do plasmídeo para a expressão GZM, foi estabelecido um sistema simples, tempo e custo-eficiente para a produção de proteínas de alto rendimento em HEK293T células. pHLsec combina um intensificador de CMV com um frango Β-actina promotor; juntos, esses elementos demonstrated a actividade do promotor mais forte em várias linhas de células ^24. Além disso, o plasmídeo contém um intrão de coelho Β-globina, os sinais de secreção e de Kozak optimizada, um-6xHis-tag Lys e um sinal poli-A. As inserções podem ser convenientemente clonados entre o sinal de secreção e a-6xHis-tag Lys (Figura 1) assegurar a expressão óptima e eficiência de secreção para proteínas que não possuem domínios N-terminais adequados. Para a expressão das Gzms, que substituiu a sequência de sinal de secreção endógena com o sinal de secreção fornecida pelo vector, seguido por uma enteroquinase (EK) local (DDDDK), de modo que o tratamento EK activou a Gzms secretadas (Gzms activas começar com o N-terminal sequência de aminoácidos IIGG ^25). Além disso, em favor deste método, as células HEK293T crescer rapidamente em baixa preço-médio, como meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), e são adequados para o método de transfecção com fosfato de cálcio eficiente em termos de custo.

Protocolo

1. Produção do plasmídeo de expressão pHLsec-GZM

1. Preparar ARN total a partir de células NK humanas (células primárias preparadas como no ²⁶ ou a linha celular NK NK-92 expressando os cinco Gzms humanos) utilizando um método de isolamento de ARN adequada e transcrever reversa usando um kit de ADNc de primeira cadeia a sintetizar seguintes manufacturer` s recomendações. GZM amplificar ADNc utilizando PCR e o clone em pHLsec como descrito em ²³ (presente tipo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, Universidade de Oxford, Reino Unido) utilizando os locais AgeI e KpnI (Figura 1).
   NOTA: Use os seguintes iniciadores indicados na Tabela 1.
2. Confirme inserções corretas por sequenciação. Expandir os plasmídeos de expressão em células DH5a e purifica-se utilizando um kit de isolamento de plasmídeo isento de endotoxinas e seguir as instruções do fabricante.
3. Ressuspender os plasmídeos purificados em meio isento de endotoxina, água estéril a uma concentração de 2 mg / ml e armazenar a -20 ° C until uso.

2. Expressão de Gzms em células HEK293T

1. Preparação de reagentes
   1. Prepare meio de cultura padrão. Para Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo glucose elevada (25 mM), de GlutaMax (4 mM), piruvato de sódio (1 mM), adicionar 10% de padrão de soro de vitelo fetal (FCS), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina ( 100 ug / mL).
   2. Prepare meio de transfecção. Para meio de cultura sem penicilina-estreptomicina adicionar 25 ug / ml de cloroquina (adicionar fresco no dia da transfecção de 1000X existências em PBS, armazenado a -20 ° C).
   3. Prepare meio de cultura isento de soro: para meio isento de soro para células HEK293 adicionar glutamina (4 mM), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 ug / ml), e 2,5 mg / L de anfotericina B.
   4. Preparar as soluções descritas na Tabela 2 e filtro com um filtro de 0,45 um antes da utilização:
2. Expansão de células HEK293T
   1. Cultivar células HEK293T em 20 ml de cultoforma ure utilizando 150 x 25 mm pratos de cultura de tecidos.
   2. Dividir células a 80% de confluência (split-proporção de 1: 4, normalmente todos os dias ^3ª). Células vagamente anexar, eles podem ser destacadas mecanicamente, sem tripsinização rigorosamente pipetando para cima e para baixo.
   3. Células da placa a noite antes da transfecção para dar 60-70% de confluência no dia da transfecção (densidade de sementeira de 2 x 10 ~ ⁵ células / mL). Um tamanho habitual de preparação consiste em 20 a 25 placas de cultura.
3. Transfecção com fosfato de cálcio
   1. 1 h antes da transfecção, mudar o meio de cultura padrão de 20 ml de meio de transfecção. Perto do final deste passo de incubação 1 h, misturar 400 ug de ADN de plasmídeo com 10,95 ml DDH ₂ 0 e 1,55 ml de _CaCl2 2M em tubos de 50 ml (um tubo / 5 pratos).
   2. 1-2 minutos antes da transfecção, adicionar 12,5 mL 2x HBS a 12,5 ml da solução de ADN-cálcio, misturar por inversão dos tubos e incubar durante 30 segundos a temperatura ambiente.
   3. Adicionar the mistura preparada em 2.3.2 directamente para as células (5 ml por placa), gota a gota para o meio. Polvilhe uniformemente sobre toda a área, transformando a forma de uma cor ligeiramente laranja.
   4. Incubar as placas de cultura de 7 a 11 horas numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO ₂ em ar humidificado). Após a incubação, um precipitado fino é visível. Remover o meio de transfecção, lavar cuidadosamente com PBS pré-aquecido e adicionar 20 ml de meio de cultura isento de soro preparado em 2.1.3. Incubar durante 72 h numa incubadora de cultura de tecidos.
   5. Analisar a eficiência de transfecção e expressão executando uma amostra (~ 20 ul) do sobrenadante das células em SDS-PAGE e coloração com Azul Brilhante de Coomassie para visualizar uma banda granzima.
4. A purificação do Gzms do sobrenadante de cultura por níquel-IMAC
   1. Após a incubação, decanta-se os sobrenadantes de cultura de células em tubos de 250 ml por centrifugação e clara. Realizar uma primeira rotação (400 xg, 10 min, 4 °C) que irá limpar o meio de células isoladas. Transferir o sobrenadante em tubos frescos e 250 ml de centrifugação a 4000 xg, 30 min a 4 ° C para remover todos os restos de células remanescente.
   2. Adicionar 5 ml de NaCl 5 M, 6,25 mL de 2 M de Tris-Base (pH 8) e 1 ml de 0,25 M de _NiSO4 por 250 ml de sobrenadante clarificado. Filtra-se o sobrenadante utilizando uma unidade de filtro de vácuo de 500 ml (0,45 mm).
   3. Equilibrar a coluna de Níquel-His-IMAC, com tampão de ligação A (10 volumes de coluna, CV), utilizando um sistema de FPLC adequado.
   4. Aplicar o sobrenadante clarificado para a coluna equilibrada a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min a 4 ° C.
   5. Depois o sobrenadante foi aplicado, lavagem da coluna com tampão A de ligação até que a absorvância de UV de linha de base é atingido (geralmente 10 CV).
   6. Eluir com uma Gzms linear 20 ml de gradiente (0 a 250 mM de imidazole), a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min durante a recolha de 2 ml-frações. Analisar as fracções de eluição por SDS-PAGE e coloração com Coomassie.
5. Enteroquinase (EK)tratamento e limpeza final por cromatografia de permuta catiónica
   1. Piscina GZM contendo frações em um tubo de diálise com ≤10 MWCO. Armazenar uma pequena amostra a -20 ° C como controlo pré-EK.
   2. Adicionar EK a 0,02 unidades / 50 ml de sobrenadante inicial directamente para a fracção combinada no tubo de diálise e diálise O / N (pelo menos 16 horas) à temperatura ambiente em tampão de EK-(4 L, tampão de mudança, uma vez).
   3. No dia seguinte, analisar EK Gzms tratados em comparação com o pré-EK controlo por SDS-PAGE e coloração com Coomassie.
   4. Quando o processamento N-terminal está completa, a mudança de tampão de diálise S tampão A (4 L) e dializar durante mais 4 horas à temperatura ambiente. Filtrar dialisado (0,45 um).
   5. Equilibrar a coluna de S-S com tampão A. Colocar a amostra na coluna com a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min a 4 ° C.
   6. Após o carregamento da amostra, lava-se a coluna com tampão A até S absorvância de UV de linha de base é atingido (cerca de 10 CV). Eluir os Gzms com um gradiente linear de 30 ml (150 a 1000 mM de NaCl). GzmA ealaúdes em ~ 650 mM de NaCl, GzmB na ~ NaCl e GzmM mM 700 a ~ 750 mM de NaCl.
   7. Analisar as fracções de eluição por SDS-PAGE e ensaios colorimétricos (ver abaixo). Piscina fracções contendo Gzms e concentrado (cerca de 30 vezes, a uma concentração de cerca de 100 uM) em filtros de spin (15 ml, 10 MWCO). Alíquota os preparativos GZM concentrados e armazenar a -80 ° C.

3. Teste de atividade GZM

1. Preparação de reagentes
   1. Preparar tampão de ensaio colorimétrico: 50 mM de base Tris, pH 7.
      1. Para a medição de GzmA, adicionar Na-CBZ-L-Lisina tiobenzilo éster (S-Bzl) (BLT) para o tampão de ensaio até uma concentração final de 0,2 mM e 5,5'-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) a uma concentração de 0,22 mM. Para GzmB, incluem 0,2 mM de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl mM de DTNB (DAA) e 0,22. Para GzmM, incluem 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilida (pNA) (AAPL). Os péptidos sintéticos são adicionados a partir de soluções de reserva apropriadas (em DMSO, storEd a -20 ° C) para a memória intermédia de fresco antes do ensaio.
   2. Preparar tampão de ensaio de clivagem: 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-Base, pH 7,5
2. Ensaios colorimétricos
   1. Distribuir pequenas amostras GZM (<5 ul) de fracções de eluição ou de estoque concentradas nos 96 poços de fundo plano de placas. Incluir um controlo positivo (GZM preparações testadas em bruto ou lisados ​​de células NK) e um controlo negativo (tampão apenas).
   2. Adicionar 100 ul de tampão de ensaio a cada poço (com uma pipeta multi-canal). Incubar durante 10 min a 37 ° C. Medir OD a 405 nm num leitor de microplacas.
3. Ensaio de clivagem
   1. Para os ensaios de clivagem utilizando substratos purificados, co-incubação de um substrato proteico (nativo ou recombinante, 100-400 nM; alguns exemplos de substratos GZM eficientes são apresentados na secção de resultados e na nota no final desta secção) com diluições em série de um GZM (a partir de 400 nM) em tampão de ensaio para várias vezes.Analisar por SDS-PAGE e coloração com Coomassie ou prata; ou por western blotting utilizando anticorpos específicos.
   2. Para os ensaios de clivagem usando lisados ​​de células, suspender as células HeLa 10 ⁶ (ou qualquer linha de células de tumor disponível) em 1 ml de tampão de ensaio e lise por congelação em uma / banho de gelo seco e etanol descongelação a 37 ° C três vezes. Remover os detritos celulares por centrifugação (15.000 xg durante 10 min a 4 ° C).
   3. A co-incubação do ligado clarificado com Gzms a várias concentrações e tempos que anteriormente. A clivagem é detectada por imunotransf erência utilizando anticorpos apropriados.
      NOTA: Alguns exemplos de substratos de boa fé para a qual anticorpos comerciais estão disponíveis: Licitação (BH3-interagindo agonista morte de domínio) e caspase 3 clivada por GzmB ^27,28; vários ribonucleoproteínas nucleares heterogêneos (hnRNPA1, A2 e U) clivada por GzmA ^29; citomegalovírus phosphoprotein 71 por GzmM ^30.

Resultados

Na seção seguinte, vamos apresentar uma documentação completa de uma preparação GzmA para iluminar o método. Nós também purificado com sucesso GzmB e GzmM, produzindo resultados semelhantes em relação à eficiência e atividade purificação. No entanto, a partir dessas preparações posteriores só vamos mostrar algumas peças seleccionadas de dados. Preparações GzmB de células 293T seguintes actual protocolo foram utilizados em vários estudos publicados, com destaque para a sua actividade em vários sis...

Discussão

O papel clássico e extensivamente estudada de GzmA e GzmB é a indução de apoptose em células de mamífero após a sua entrega por citosólico da proteína formadora de poros PFN ^1. Recentemente, o espectro citotóxica dos Gzms foi alargado significativamente a partir de células de mamíferos para bactérias ^9,10, bem como para certos parasitas ^11. Além disso, as funções não clássicos, extracelulares de GzmA e GzmB, bem como a significância biológica dos vários Gzms órfãos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596-026	Total RNA isolation kit
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530L
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells	Sigma	14571C
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	31966-021
SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO	Thermo Scientific	68100
Enterokinase from bovine intestine	Sigma	E4906	recombinant, ≥20 units/mg protein
HisTrap Excel 5 ml column	GE Healthcare	17-3712-06	Nickel IMAC
HiTrap SP HP 5 ml column	GE Healthcare	17-1152-01	S column
N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)	Sigma	C3647	GzmA substrate
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)	MP Biomedicals	2193608 _10mg	GzmB substrate
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)	Bachem		GzmM substrate
5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)	Sigma	D8130	Ellman`s reagent