포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템

요약

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

초록

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

서문

Gzms 전문 CTL의 리소좀과 NK 세포 ¹ 지역화 높은 상동 세린 프로테아제의 가족입니다. 이러한 킬러 세포의 세포 독성 과립은 제거 ^2,3 향하는 표적 세포의 인식에 Gzms와 동시에 출시되는 막 방해 단백질 PFN 및 GNLY가 포함되어 있습니다. (- G, K, M과 N GzmA) 인간 (GzmA, B, H, K와 M)에서 다섯 Gzms 및 마우스에서 10 Gzms이 있습니다. GzmA과 GzmB이 가장 풍부하고 광범위하게 인간과 생쥐 ^한 연구이다. 그러나, 최근의 연구들은 세포 사멸 경로뿐만 아니라 건강과 질환 ⁴ 다른, 소위 고아 Gzms에 의해 매개되는 생물학적 효과를 추가로 조사하기 시작했다.

^5,6- PFN에 의해 표적 세포 내로 전달 된 경우 Gzms의 가장 잘 알려진 함수와 GzmA GzmB의 특히 포유 동물 세포에서 프로그래밍 된 세포 사멸을 유도한다. 그러나더 최근의 연구는 또한 PFN ^7,8 독립적으로 세포질 전달, 면역 조절 및 염증에 깊은 영향을 Gzms의 세포 외 효과를 보여 주었다. Gzms의 세포질 기입 한 후 효율적으로 살해 세포의 스펙트럼은 최근 박테리아 ^{9, 10,} 심지어 특정 기생충 ⁽¹¹⁾ 포유 동물 세포에서 확대되었다. 이러한 최근의 발견은 GZM 연구원에 대한 완전히 새로운 분야를 열었다. 따라서, 비용 효율적인, 고 수율 포유 동물 발현 시스템은 크게 그 미래 연구에 대한 방법을 완화합니다.

네이티브 인간, 마우스 및 래트 Gzms 성공적 CTL 및 NK 세포 라인 ^12-14의 과립 분획으로부터 정제 하였다. 그러나, 우리의 손에 이러한 정제 기술의 수율은 0.1 ㎎ / ℓ, 세포 배양 (미공개 관측 및 ^12)의 범위이다. 또한, 인접하여 오염이없는 단일의 GZM 크로마토 해상도R Gzms 및 / 또는 과립 형태로도 존재하는 단백질 (게시되지 않은 데이터와 ^{12, 14)에} 도전하고있다. 재조합 Gzms 심지어 이러한 HEK 293 ^18,19 같은 포유 동물 세포에서 세균 ^{15, 16,} 효모, 곤충 세포 및 ^17에서 제조 하였다. 만 포유류 발현 시스템은 원시 세포 독성 단백질과 동일한 번역 후 변형으로 재조합 효소를 생산할 수있는 가능성을 부담. 번역 후 변형은 엔도 사이토 시스에 의해 특정 흡수 및 표적 세포 ^20-22 내의 단백질 분해 효소의 세포 내 현지화에 연루되어있다. 따라서, pHLsec ^(23)를 사용하여 GZM 발현 플라스미드 백본 (라두 Aricescu과 이본 존스, 옥스포드, 영국의 대학의 일종 선물), 우리는 높은 수율 단백질 생산을위한 간단하고, 시간과 비용 효율적인 시스템을 구축 HEK293T 세포. pHLsec는 닭 Β-액틴 프로모터와 CMV 증강을 결합; 함께, 이러한 요소는 demonstra테드 다양한 세포 라인 ^(24)에서 가장 강력한 프로모터 활성. 또한, 플라스미드는 토끼 Β-글로빈 인트론, 최적화 된 코작과 분비 신호리스 - 6xHis 태그 및 폴리 신호가 포함되어 있습니다. 삽입이 분비 신호와 적절한 N- 말단 도메인을 부족한 단백질에 대한 최적의 발현과 분비 효율을 보장리스 - 6xHis 태그 (그림 1) 사이에 편리하게 복제 할 수 있습니다. Gzms의 발현을 위해, 우리는되도록 EK 치료 분비 Gzms는 (활성 Gzms는 N - 말단으로 시작 활성화 된 엔테로 키나제 (EK) 사이트 (DDDDK) 뒤에 벡터에 의해 제공 분비 신호 내인성 분비 신호 서열로 대체 아미노산 서열 IIGG ^25). 또한이 방법에 대한 찬성, HEK293T 세포는 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)로, 저가의 매체에 빠른 속도로 성장하고, 비용 효율적인 칼슘 포스페이트 형질 전환 방법에 적합하다.

프로토콜

발현 플라스미드 pHLsec-GZM 1. 생산

1. 인간 NK 세포로부터 manufacturer` 다음 적합한 RNA 분리 방법을 이용하여 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성 키트를 사용하여 스크립트 작성 역방향 ⁽²⁶ 또는 다섯 인간 Gzms 발현 NK 세포주 NK-92에서와 같이 제조 차 전지), 총 RNA를 준비 의 권장 사항. ²³ (라두 Aricescu과 이본 존스, 옥스포드, 영국의 대학 종류의 선물)에 설명 된대로 GZM cDNA를 AgeI과 KpnI으로 절단 부위 (그림 1)를 사용하여 pHLsec으로 PCR 및 복제를 사용하여 증폭.
   참고 : 표 1의 다음 프라이머를 사용합니다.
2. 순서에 의해 올바른 삽입을 확인합니다. DH5α 세포에서 발현 플라스미드를 확장하고 독소가없는 플라스미드 분리 키트를 사용하여 정화하고 제조업체의 지침을 따르십시오.
3. 된 unti -20 ° C에서 2 ㎎ / ㎖ 저장의 농도로 내 독소가없는 멸균 수에 정제 된 플라스미드를 재현 탁L 사용.

HEK293T 세포에서 Gzms 2. 표현

1. 시약의 조제
   1. 표준 배지를 준비합니다. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 함유하는 고 글루코스 (25 mM)을 루타 (4 mM)을 위해, 피루브산 나트륨 (1 mM)을 (표준 소 태아 혈청 (FCS), 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신의 10 %를 추가 100 μg의 / ㎖).
   2. 형질 매체를 준비합니다. 페니실린 - 스트렙토 마이신이없는 배지에 25 μg의 / ㎖ 클로로퀸 (-20 ℃에서 보관 PBS에서 1000 배 주식에서 형질의 날에 갓 추가)를 추가합니다.
   3. 무 혈청 배지를 준비 : 무 혈청 배지에 HEK293 세포 글루타민 (4 mM)을, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖) 및 2.5 ㎎ / L의 암포 테리 B. 추가하세요
   4. 사용하기 전에 0.45 μm의 필터를 표 2와 필터에 설명 된 솔루션을 준비합니다 :
2. HEK293T 세포 확대
   1. 20 ㎖ 숭배에 HEK293T 세포를 성장150 X 25mm 조직 배양 접시를 사용하여 URE 매체.
   2. 80 %의 포화 상태에서 분할 세포 (1 분할 비율 : 4, 일반적으로 매 3 ^일째). 세포는 느슨하게 그들은 기계적으로 엄격로 pipetting 아래로 트립신하지 않고 분리 할 수​​ 있습니다 연결합니다.
   3. 플레이트 세포 형질 감염 전날은 형질 감염 (시딩 밀도 ~ 2 × ¹⁰⁵ 세포 / ml)의 날 60~70%의 생장을 얻었다. 평소 준비 크기는 20-25 배양 접시로 구성되어 있습니다.
3. 칼슘 - 포스페이트 형질
   1. 형질 감염 전에, 1 시간에 20 ml의 형질 감염 배지로 표준 배지를 변경. 이 1 시간 배양 단계의 끝 부분, 10.95 ML의 DDH ₂ 0 50 ml의 튜브 2M 염화칼슘 _2의 1.55 ㎖ (1 관 / 5 요리)와 플라스미드 DNA의 400 μg의 혼합.
   2. (1) 형질 전환 이전에 최소 2, DNA-칼슘 용액 12.5 ml의 12.5 ml의 2 배 HBS를 추가 튜브의 반전에 의해 혼합하고 실온에서 30 초 동안 품어.
   3. 일 추가E 혼합물을 직접 세포 (접시 당 5 ㎖)에 적가 매체에 2.3.2에서 제조. 약간 오렌지 색상으로 매체를 회전, 전체 영역에 걸쳐 고르게 뿌린다.
   4. 조직 문화 인큐베이터에서 7-11 시간 (37 ℃, 5 % 가습 공기 중 CO _2)의 배양 접시를 품어. 배양 후, 미세한 침전물을 볼 수 있습니다. 미리 예열 PBS로 조심스럽게 씻어, 형질 매체를 제거하고 2.1.3에서 제조 된 20 ml의 무 혈청 배지를 추가합니다. 조직 문화 인큐베이터에서 72 시간 동안 품어.
   5. SDS-PAGE에 세포 상층 액의 샘플 (~ 20 μL)를 실행하고, 그랜 자임 밴드를 시각화 쿠마 브릴리언트 블루로 염색하여 형질 전환 및 발현 효율을 분석 할 수 있습니다.
4. 니켈 IMAC에 의해 배양 상층 액에서 Gzms의 정제
   1. 배양 후, 250 ml의 튜브에 세포 배양 상층 액을 가만히 따르다 및 원심 분리하여 취소합니다. 첫 번째 스핀을 수행 (400 XG, 10 분, 4 °분리 된 세포에서 매체를 취소합니다 C). 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 4 ° C에서 4,000 XG, 30 분에서 신선한 250 ml의 튜브와 스핀에 뜨는을 전송합니다.
   2. 5 M NaCl을 5 ㎖, 삭제 상층 액 250 ml의 당 0.25 M 니소 ₍₄₎ 6.25 2 M 트리스 자료 (PH 8) ml의 1 ML을 추가합니다. 500㎖의 진공 필터 유닛 (0.45 mm)를 사용하여 상청액을 필터.
   3. 적절한 FPLC 시스템을 사용하여 그분의 결합 버퍼를 (10 열 볼륨, CV)와 니켈 - 아이맥 열 평형.
   4. 4 ℃에서 0.5 ㎖ / 분의 유속으로 칼럼을 평형화 클리어 상등액을 적용한다.
   5. 상등액을 도포 한 후 UV 흡광도가 기준선 (통상 10 CV)에 도달 할 때까지, 그의 결합 완충액으로 칼럼을 세척 하였다.
   6. 용출 Gzms 0.5 ml의 유속으로 20 ㎖의 선형 구배 (0 ~ 250 mM의 이미 다졸)로 / 분 ML-2 분획을 수집한다. SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 용출 분획을 분석한다.
5. 엔테로 키나제 (EK)치료 및 양이온 교환 크로마토 그래피에 의한 최종 정리
   1. ≤10와 MWCO 투석 튜브 함유 분획을 풀 GZM. 사전 EK 제어와 같은 -20 ° C에서 작은 샘플을 저장합니다.
   2. 투석 튜브에서 직접 풀링 부분에 0.02 단위 / 초기 상층 액 50 ㎖에 EK을 추가하고 O / N EK-버퍼에 실온에서 (최소 16 시간) (4 L, 한 번 변화 버퍼를) 투석.
   3. 다음날, EK는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 사전 EK 제어에 비해 Gzms 처리 분석.
   4. N 말단 처리가 완료되면 (4 L)를 버퍼 S 투석 완충액을 변경하고 다른 RT에서 4 시간 동안 투석. 필터 투석​​액 (0.45 μm의).
   5. 4 ℃에서 0.5 ㎖ / 분의 유속으로 칼럼에 샘플을로드 S 버퍼 A. 가진 S-열 평형.
   6. UV 흡광도 기준 (약 10 이력서)에 도달 할 때까지 샘플로드 한 후, S 버퍼와 열을 씻는다. 30 ml의 선형 구배 (150 mM의 NaCl을 1000)와 Gzms을 용출. GzmA 전자~ 750 mM의 염화나트륨에서 ~ 700 mM의 염화나트륨과 GzmM에서 ~ 650 mM의 NaCl을, GzmB에서 류트.
   7. SDS-PAGE 및 비색 분석 (아래 참조)에 의한 용출 분수를 분석합니다. Gzms과 농축액을 함유하는 분획을 풀 (약 30 배 이상, 약 100 μM의 농도로)에서의 스핀 필터 (15 ㎖, 10 MWCO). -80 ° C에서 집중 GZM 준비 및 저장 나누어지는.

3. 테스트 GZM 활동

1. 시약의 조제
   1. 50 mM 트리스 - 자료, pH가 7 : 비색 분석 버퍼를 준비합니다.
      1. GzmA의 측정을 위해, 0.2 mM 내지 5,5'- 디티 오 - 비스 (2- 니트로 벤조산)의 최종 농도로 검정 완충액에 나트륨-CBZ-L- 라이신을 thiobenzyl 에스테르 (S-BZL) (BLT)를 추가 0.22 mm의 농도 (DTNB). GzmB를 들어, 0.2 mM의 BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL (AAD) 및 0.22 mM의 DTNB을 포함한다. GzmM 들어, 0.2 mM의 SUC 닐 -Ala-Ala-Pro-의 Leu-35㎕를 PNA () (AAPL)를 포함한다. 합성 펩티드는 DMSO에 (적절한 재고 솔루션에서 추가, STOR에드 갓 분석하기 전에 버퍼에 -20 ℃)​​에서.
   2. 절단 분석 완충액 준비 : 100 mM의 염화나트륨, 50 mM 트리스 - 자료, pH가 7.5
2. 비색 분석
   1. 96 웰 평면 바닥 판에서 용출 분수에서 작은 GZM 샘플 (<5 μL) 또는 집중 주식을 배포합니다. 양성 대조군 (GZM 시험 제제 또는 조질 NK 세포 용 해물) 및 음성 대조군 (전용의 버퍼)를 포함한다.
   2. (멀티 채널 피펫을 사용하여) 각 웰에 분석 완충액 100 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. 마이크로 플레이트 리더에서 405 nm에서 OD를 측정한다.
3. 분열 분석
   1. 희석액과 - 정제 된 기판을 사용하여 절단 분석법 (효율적인 GZM 기판의 몇 가지 예는이 섹션의 끝에 결과 섹션과 주에 제시 400 nM의 네이티브 또는 재조합, 100)을 단백질 기질을 공동 배양 GZM의 다양한 시간에 대한 분석 버퍼 (400 nm에서 시작).SDS-PAGE 및 쿠마 또는 실버 염색으로 분석; 또는 웨스턴하여 특정 항체를 사용하여 블 롯팅.
   2. 세포 용 해물을 사용하여 절단 분석법, 37 ° C 세번에서 에탄올 / 드라이 아이스 배스 융해에서 동결 세이 버퍼를 Lyse 1 ㎖에서 ¹⁰⁶ HeLa 세포 (또는 가능한 종양 세포주)를 일시. (4 ° C에서 10 분 동안 15,000 XG)을 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다.
   3. 위와 같이 다양한 농도와 시간에 Gzms와 클리어 해물을 공동-품어. 쪼개짐은 적절한 항체를 사용하여 면역 블에 의해 검출된다.
      참고 : 선의의 기판의 몇 가지 예하는 상업 항체가 사용할 수 있습니다 입찰 (BH3-상호 작용 도메인 죽음 작용제)와 GzmB ^27,28에 의해 절단 카스파 제 3; GzmA ^(29)에 의해 절단 여러 이기종 핵 리보 (hnRNPA1, A2 및 U); GzmM ^(30)에 의해 거대 세포 바이러스 인 단백질 (71).

결과

다음 섹션에서 우리는 방법을 조명 GzmA 준비의 전체​​ 문서를 발표 할 예정이다. 또한 성공적으로 정화 효율 및 작동에 대해서는 유사한 결과를 생성하고 GzmB GzmM 정제. 그러나, 그 후 준비에서 우리는 데이터의 몇 선택한 조각을 보여줍니다. 현재 프로토콜 다음 293T 세포로부터 GzmB 제제는 다양한 생물학적 분석 시스템 ^9,29,31-34 그들의 활동을 강조 여러 발표 된 연구에 사용 하였다.

토론

GzmA 및 GzmB의 고전과 광범위하게 연구 역할은 기공 형성 단백질 PFN ^1로 그들의 세포질 배달 후 포유 동물 세포에서 세포 사멸의 유도이다. 최근 Gzms의 세포 독성 스펙트럼 세균 ^9,10뿐만 아니라 특정 기생충 ^(11)에 포유류 세포에서 현저하게 확대시켰다. 또한, GzmA 및 GzmB의 비 고전적, 세포 외 기능뿐만 아니라 다양한 고아 Gzms의 생물학적 중요성은 여전히​​ 불분명하다. 이 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596-026	Total RNA isolation kit
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530L
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells	Sigma	14571C
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	31966-021
SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO	Thermo Scientific	68100
Enterokinase from bovine intestine	Sigma	E4906	recombinant, ≥20 units/mg protein
HisTrap Excel 5 ml column	GE Healthcare	17-3712-06	Nickel IMAC
HiTrap SP HP 5 ml column	GE Healthcare	17-1152-01	S column
N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)	Sigma	C3647	GzmA substrate
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)	MP Biomedicals	2193608 _10mg	GzmB substrate
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)	Bachem		GzmM substrate
5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)	Sigma	D8130	Ellman`s reagent