Kemirgen Beyin Mikroenjeksiyon Moleküler Alt Tabakalar Motive Davranış Eğitim için

Özet

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Özet

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Giriş

Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli^1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions⁴. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry^3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways^7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry^1,11,12.

While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,¹³ which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,¹⁴ which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles¹⁵ or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.^16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,^18-20 these procedures will not be covered here.

We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.^21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. ^21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,^21,24 we will focus mainly on practical concerns.

Protokol

Hayvan denekleri Prosedürler Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu'na uygun oylandı.

Önceki Cerrahisi ve Mikroenjeksiyon için ımplements 1. hazırlanması

1. Materyal hazırlama için ayarlayın:
   1. 26 G kanül boru, 33 G obturator tel, 33 G mikroenjeksiyon iğnesi boru, mikroenjektör plastik boru (PE20 veya eşdeğeri), iki adet orta ağırlıklı doğrusal hemostatlar, laboratuar bant, cetvel, kalıcı bir kalem,% 70 etanol elde edilir (h / h), depolama küçük şişeler (örneğin, 20 ml'lik cam sintilasyon), süper yapıştırıcı, tekneler tartmak ve döner alet olmayan bir ağır kesme disk ile donatılmış.
      Not: aracı yükseltir olarak kayışları veya bant kullanarak pipet kutusuna döner aracı emniyete, yararlıdır. Göz koruması giyen bir döner aracını kullanırken yaralanma önlemek için önemlidir.
   2. Bir parça takıntezgah laboratuvarda veya otoklav bant.
2. Kanül hazırlanması:
   Not: En az iki kanül ikili enjeksiyon için fare başına gerekmektedir. Ek bir kanül, bir sonraki adımda kullanılır.
   1. Işaretleme ve kesme işlemi sırasında eğilmeleri önlemek için yeterli uzunluğa sahip bir kanül, borunun bir kesitini elde edin.
   2. Ince uçlu kalem kullanarak adım 1.1.2 den kaset üzerinde 15 mm'lik bir referans çizgi çizin. Bu keskin kalıcı bir kalem kullanarak boru üzerinde sıralı 15 mm kesitler işaretlenmesi için bir rehber görevi görecek.
   3. Boru çentik için döner aracı yavaş dönen kesme diski, işaretli noktalarda, kanül tüp dokunun. Kanülü döndürün 180˚ ve borunun karşı tarafı çentik. Bu tıkanıklığı yol açabilir, çünkü tamamen tüp aracılığıyla kesmeyin.
   4. Keskin ~ 15 mm bölüme kırmak için boru bükün.
   5. Cut-off dik kanül her kesim ucunu tutunbaşparmak ve işaret parmağı arasında disk. Kesme diski (yani, kenar) büyük ileri yüzeyine ucu dokunmadan süre kanül tüp döndürün. Bu körelmiş ucu oluşturur. Not: Bu bir off-site enjeksiyonunu verim verebilir için, kanül bükmeyin.
   6. Ream 26 G eğimli iğne (kahverengi hub) ile kanülün iki ucu her çapakları kaldırılmıştır emin olmak için ve kanül engelsiz olduğunu.
   7. ~ Kesme kanül aracılığı ile 35 mm hiçbir iç engel bulunmadığından emin olmak için obturator tel kesme bir örnek geçirin.
   8. Bireysel kelepçelenmemiş hemostat kullanarak her kanül Pick up ve uzunluğu tam 14 mm olduğundan emin olmak için bir cetvel ile tamamlanan her kanül ölçün.
3. Obtüratörlerden hazırlanması:
   1. Tek kanül orta ağırlıkta, düz hemostatlarla yaklaşık yarım boy kelepçe. Bankta kilitli hemostat yatırın. Kanül tezgah dik olmalıdır.
      Not: Bu kanülmuhtemelen bükülmüş olarak kilitli hemostat tarafından tutulduktan sonra cerrahi kullanılmamalıdır.
   2. Bu tezgah ulaşana kadar kanül içine obturator Telin bir ucu besleyin. Bir çapak tezgah ulaşmasını engelleyen emin olmak için kanül teli Sıçrama,. Örneğin, kanülün alt ulaştı. Tıkanmayı ve ek doku yaralanmasına önleyecektir uygun tıkaç uzunluğu.
   3. Viraj obturator ve tezgah arasındaki teması korurken ~ 30˚ açı elde edilinceye kadar parmaklarınızla sıkıştırarak tel. Viraj açısı bu kafa kapağı ile aynı hizaya ve aşırı zor sıçan kaldırmak için yapım, ileriye dönük böyle olduğundan emin olun.
   4. Kanül gelen kabloyu çıkarın ve küçük çapraz kesiciler (tel kesiciler) ile viraj gelen ~ 2.5 mm en fazla bölümünü kesti.
      Not: her bir implant kanülün bir tıkacı gerektirir en az iki obtüratörler, ikili bir enjeksiyon için sıçan başına gerekli olacaktır. Yaratmaktıkayıcı yoluyla ilave bir ~ 35˚ bükülme yarı yolda da hayvan tarafından uzaklaştırılmasının önlenmesine yardımcı olacaktır. Kanül ve kullanılana kadar% 70 etanol (h / h) ihtiva eden ayrı şişelerde Obturator (örn., 20 ml'lik bir cam sintilasyon), ama en azından O / N hem de muhafaza edin.
4. Hazırlık ve mikropüskürtücü test:
   1. ~ 1 m uzunluğunda mikropüskürtücü iğne boru parçası edinin.
   2. Dik kilitli düz hemostatlarla mikropüskürtücü hortumun bir ucunu tutun.
   3. Hemostata en az bir sefer sıkıca bobin tüp üzerindeki gerilimi tutarken hemostat çevirin.
   4. Mikropüskürtücü boru tersi, gevşek ucundan 32 mm ölçün ve ikinci bir düz, orta ağırlıkta hemostatla dik bu noktayı kavramak ve bunları kilitlemek için. 32 mm yan hemostatlarla mikroenjektör tüp gevşek sonuna kadar yerine yara telle hemostat yakın tarafında yakın işaretlemek kavrayın.
   5. BenHortumun üzerindeki gerilimi tutarken d boru ileri geri kopana kadar.
      Not: Tek bir keskin yukarı ve aşağı viraj mikroenjeksiyon istenen beyin bölgesi meydana sağlamak için arzu edilir bir künt mola üretecek.
   6. Her iki ucu düz ve iç çapı engelsiz olduğunu olduğundan emin olmak için mikroenjektör hortumunu kontrol edin.
   7. Bir mikropüskürtücü yaka üretimi için kullanılacak olan kanülün boru elde edin.
   8. Tedbir ve kalıcı bir kalem ve bant (adım 1.1.2) çizilmiş 5 mm referans hattı kullanarak kanül tüp sıralı 5 mm bölümleri işaretleyin.
      Not: Her bir mikropüskürtücü ise, bir yaka gerektirir. Yakalar mikroenjektör tel yapıştırılmış sadece kısa kanül vardır.
   9. Boru çentik için döner aracı yavaş dönen kesme diski, işaretli noktalarda, kanül tüp dokunun. Kanülü döndürün 180˚ ve borunun karşı tarafı çentik. Tamamen kesme boru occlude.
   10. Keskin~ 5 mm bölüme kırmak amacıyla viraj mikroenjektör yaka boru.
   11. Çapak çoğu kaldırılmış olmasını sağlamak için bir 26 G eğimli iğne (kahverengi hub) ile yakanın her iki ucunda iç çapını oyun. Bazı küçük çapak mikroenjektör tel kapmak ve böylece yapışması yardımcı olacaktır.
   12. ~ Her mikropüskürtücü tüpüne sonundan itibaren 2 cm tek yaka kaydırın.
   13. Küçük tartmak tekne köşesinde süper yapıştırıcı küçük bir havuz oluşturun.
   14. Mikroenjektör tüp süper yapıştırıcı küçük bir miktar uygulamak ~ kesilmiş 25 mm hurda kanül tüp kullanın ~ bir ucundan 5 mm. Bu mikroenjeksiyon tüp ucundan ~ 1 mm olacak şekilde Sonraki, bu süper yapıştırıcı boncuk üzerine yaka kaydırın. Yapıştırıcı ile yaka iki ucunu kapatın.
       Not: mikroenjektör etrafında sızdırmazlık plastik boru önleyecek şekilde, yaka süper yapıştırıcı büyük bir birikimi kaçının. Bu yapacak şekilde, mikropüskürtücü Hortumun açık ucundaki süper yapıştırıcı almamak için önemli olmakla birlikteboşluk (non-enjekte) hacmi en aza indirmek için mümkün olduğunca kullanılamaz mikroenjektör, sonuna kadar yakın yaka kaydırmak için de önemlidir.
   15. Yukarı yaka tarafı başka bir küçük tartın teknenin dışına tamamlanmış Mikroenjektör Yalın ve 24 saat kurumasını bekleyin.
   16. Mikropüskürtücü plastik boru bir ~ 8 cm parça elde edilir (PE20 veya eşdeğeri), 1 steril su ile doldurulmuştur ml'lik şırınga ve 26 G eğimli bir iğne (kahverengi merkezi).
   17. Tüp delmek değil sağlanması, şırınga ve iğne üzerine kesme boru kaydırmak için bir 26 G (kahverengi merkezi) iğne takın.
   18. Kurutulmuş, tam mikroenjektör yaka ucuna plastik boru kaydırın.
   19. Patensisi test etmek için su dolu şırınga pistonu sıkıştırın.
       Not: Su çok uzak ve düz mikropüskürtücü ucu dışarı sprey gerekir. Dere düz değilse, enjeksiyon yeri doğru olmayacaktır. Bir yana ya da yaygın sprey kaynağı fakir bir mola (adım 1.4.5) 'dir. Bir mikropüskürtücü gerekir hayırSprey yanlara veya yaygın ise t kullanılabilir. Bu mikroenjektör veya iğne tıkayabilecek gibi Tuzlu Su, kullanılmamalıdır.
   20. Mikroenjektör su çıkarmak için geri şırınga çekin. Örneğin, 20 ml'lik bir cam sintilasyon şişesi, kuru, ağzı kapalı bir şişe içinde depolayın.
       Not: mikroenjektörler en süper yapıştırıcı ile imalat, ³¹ sonra otoklava olabilir, ancak bu ampirik olarak tespit edilmelidir. Alternatif sterilizasyon teknikleri, etilen oksit ve gama ışınlama bulunmaktadır.

2. Hazırlanma ve Sahne Microinjections

1. Tamamlanan mikropüskürtücü elde edilir, mikroenjektör plastik boru (PE20 veya eşdeğeri), mikroenjeksiyon pompası, küçük bir iki ağırlığında tekneler, steril su,% 70 etanol (h / h), aseton, kör bir iğne kullanarak (25 g) iki gaz geçirmez 1 ul bir cam şırıngalar pamuk ahşap aplikatörler, yedek Obturator, 1 ml şırınga uçlu, 26 G (kahverengi merkezi) iğne, küçük kavisli forseps (stil 7. tavsiye edilir) ve laboratuvar wIpes.
2. Enjeksiyon için mikroenjektörler hazırlanması:
   1. İkisi arasındaki açı ~ 95˚ böylece viraj 15 mm yaka uç karşısındaki Mikroenjektör tamamladı.
      Not: Bir kesin viraj konumu doğru enjeksiyon yeri için zorunludur. 7. forseps kullanma (veya benzeri) Mikroenjektör kapmak ve yukarı bükme yararlıdır. Daima microinjections gerçekleştirmeden önce uzunluğunu yeniden ölçün.
   2. Mikropüskürtücü yaka üzerindeki plastik boru (PE20) için ~ 70 cm ve slayt kesin.
      Not: İki farklı çözümler enjekte özellikle enjeksiyonlar tamamlarken mikroenjektör ve gevşek ucu hem yakın bir plastik tüpe bant sekmeleri ekleme yararlıdır. Onlar enjeksiyon sırasında hantal olmak gibi Sekmeler her iki tüpler için tavsiye edilmez.
3. Microinjections için pompayı hazırlanması:
   1. Pompanın açın.
   2. Mikroenjeksiyon iğne çapı, istenilen infüzyon hızı ayarlayın ve enjeksiyon hacmi hedef.
      Not: İnfüzyon sıçane ve enjeksiyon hacmi Deney talep bağlıdır. Bu Tartışma üzerine durulmuştur. Bazı pompalarda şırınga tabloları önceden yüklenmiş bulunmaktadır. Değilse, bir şırınga masası imalatı sitesinde (ler) üzerinde bulunabilir.
   3. Kesin bir hacim otomatik olarak teslim edilir ve böylece 'Cilt' Pompa modunu ayarlayın. 'Pump' modu yerine seçilirse, deneyci el pompayı durdurmak gerekir.
   4. Şırınga enjeksiyon hacmi artı ek 0.2 ul doldurmak için izin pompa arka desteği ayarlayın.
4. Enjeksiyon için mikroenjeksiyon şırınga ve Mikroenjektör hazırlanması:
   1. Mikroenjeksiyon pompanın rafa her gaz geçirmez mikroenjeksiyon şırınga kilitleyin.
   2. Tekne tartmak ve yavaşça iç tel yağlamak için pistonu flutter küçük içerdiği steril suya gaz geçirmez şırınga ucu yerleştirin. Eşit su ile doldurmak için pompa üzerindeki Geri döndürmez için pistonu çekin.
   3. Eş PE20 boru Slidesteril su ile doldurulmuş olan bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 26 G (kahverengi merkezi) iğne üzerine (adım 2.2) mikroenjektör için nnected. Mikroenjektör yoluyla steril su püskürtün ve sprey modeli ve mesafeyi kontrol edin.
      Not: Su çok uzak ve düz mikropüskürtücü ucu dışarı sprey gerekir. Dere düz değilse, enjeksiyon yeri doğru olmayacaktır.
   4. Steril alan üzerine sterilize Mikroenjektör yerleştirin.
   5. Ayrıca iğne ile hasarlı alanın altında boru kesim sırasında damlamasını su önlemek için dik mikroenjektör tüp tutarak, iğne kapalı boru kaydırın.
   6. Iğne üzerine (bu mikroenjektör bağlı olduğu) iğnenin ucunda bir damlacık oluşturma ve su dolu PE20 tüp kaydırmak için hafifçe öne mikroenjeksiyon şırınga pistonu itin.
      Not: Bu at oluşturacak olan yapışmasına neden olabilir yerinden uygun backpressure sağlayacak bir sıvı-sıvı bağlantısı yaratacakmikroenjektör ucu.
   7. Numune yükleme hazırlanmak ve hiçbir iz etanol mikroenjektör içinde kalmasını sağlamak için tamamen ileri pistonu itin.
   8. Temiz bir laboratuvara mikroenjektör ucunda oluşan birden çok kez silin olan su damlacığı dokunarak sızıntı olup olmadığını ayarlarını kontrol edin.
5. Not: laboratuara dokunurken silin tek ıslak nokta oluşturmalıdır. Daha fazla damla varsa, sistemde bir kaçak var.
6. Süper yapıştırıcı uygulaması (Adım 1.4.14) kontrol ederek ve keskin bir makas veya jilet PE20 boru herhangi bir bağlantı kaldırılır o her zaman birlikte PE20 boru kırparak sızıntıları önlemek. Ayrıca, tekrar sızıntısı giderilmesi için 2.4.8 ile 2.4.3 numaralı adımları.
7. 0.2 ul geri şırınga pistonu çekin; PE20 boru / mikroenjektör steril su ile çözelti arasındaki bir kabarcık oluşturma enjekte edilecek.
8. Not: Bu kabarcık enjekte edilecek seyreltme, su kirlenmesini önler ve izin verirEnjeksiyon işleminin izlenmesi için enjeksiyon sırasında hareket edecek çünkü. Tek bir katı kabarcık üretilmelidir. Kırık ise, bir kaçak söz konusu ya da mikroenjektör ucu tıkalı olduğu; bu adımı 2.4.8 (ve beraberindeki notu) gösteren tekrarlanmalıdır.
9. Reaktifi içine mikropüskürtücü enjekte edilecek koyun ve yavaşça Geri döndürmez için şırınga pistonu çekin.
10. Enjeksiyon için hayvan hazırlanması:
11. Deneycinin göğsüne karşı sıçan göğsünü tutun. % 70 etanol batırılmış bir pamuk aplikatör ile kanüller çevresini temizleyin (v / v).
12. Not: Uygun taşıma ile fareler hafifçe bir kupa elinde ölçülü edilebilir. Aksi takdirde, scruffing gerekebilir.
13. % 70 etanol ile tartın tekne içine küçük forseps ve yer kullanarak Obturator çıkarın (v / v).
14. Enjeksiyonları Sahne:
15. Kanül içine dolduruldu Mikroenjektör (adım 2.4.10) yerleştirin. Mikroenjeksiyon pompa ve monitör kabarcık hareketi basın başlangıç.
16. Not: may mikroenjektörler kaldırmayın emin olmak için hafif basınç uygulamak gerekebilir. Kabarcık (adım 2.4.9 oluşturulan) üniform ilerlemek ve mikroenjektör girmek tamamen gerekmektedir.
17. Kanül mikropüskürtücü çıkarın ve Enjeksiyon tamamlandığında ve sonrası enjeksiyon difüzyon süresi geçtikten sonra, Obturator değiştirin.
18. Not: Tipik enjeksiyon sonrası difüzyon süreleri 2 olarak - farmakolojik reaktiflerin 4 dk ve 2 - virüslere karşı 10 dakika. Sonrası infüzyon dönemi sırasında Mikroenjektör bırakmak kanüller geri geri akışa ziyade doku içine yayılmasını önler Enjektat. Etanol dolu tartmak tekne tarafında Yeri obtüratörler etanol kanül içine takmadan önce boşalmasını sağlamak için.

3. Post-Enjeksiyon Clean Up

1. Steril su,% 70 EtOH ve aseton: bir küçük her flakon elde edilir.
2. Mikropüskürtücü ve mikroenjeksiyon şırınga temizlenmesi:
   1. Cam şırınga çıkarınCam şırınga pompa şırınga raf ve mikroenjeksiyon tüp s.
   2. Cam şırınga ayırın mikroenjektör boru ve 26 G iğnesi (kahverengi hub) üzerinden mikroenjektör boru steril su ile dolu bir 1 ml şırınga ekleyin. ~ 0.3 ml sınırdışı ileri 1 ml şırınga pistonu itin. Sonra, bir karşı mikroenjektör ucu dokunma laboratuara-silin ve geri mikroenjektör havayı çekin.
      Not: ihtiyatlı görülürse mikroenjektör ve boru benzeri deneyler için yeniden kullanılabilir.
   3. Steril su içine cam şırınga iğnesi yerleştirin ve tam geri pistonu çizin. Sonraki, temizlemek için tamamen öne doğru pistonu itin. Laboratuara cam şırınga ucu dokunun hiçbir sıvı kalmasını sağlamak için silin.
   4. Steril su, hava,% 70 EtOH ve aseton aşağıdaki sıraya göre yineleyin 3.2.3: steril su, steril su, hava, hava,% 70 EtOH,% 70 EtOH, hava, hava, aseton, aseton, hava, hava. Bu temizlik tüm adımları gerçekleştirme mikroenjeksiyon şırınga korumaya yardımcı olacaktır.
   5. Ambalaj içine mikroenjektör şırınga (ler) yerleştirin ve 0.05 ul geri pistonu çekin.
      Not: Bu önemli, herhangi bir tuz yatakları depolamadan sonra formu gerektiği oluşabilecek sıkışmış dalgıç çıkarmak için itti veya çekilmesine piston izin verdiği.

Motivasyon Testi 4. Programlama

1. Yönetici kimlik bilgileriyle Grafik Devleti oturum açın.
2. Seçin veya ilgili veritabanı oluşturun.
3. Ilerici oran takviye çizelgesi oluşturma:
   1. Seç Listeler> Veritabanı Seviye Listeleri> Olay Geçiş Parametre Listeleri.
   2. Seç 'Ekle'. Uygun liste numarasını (L #) ve açıklamasını girin.
   3. 'Olaylar Ekle' seçeneğini seçin.
   4. İlk takviye programı değerini girin ve 'Ekle' seçeneğini seçin. Tekrarlayın.
      Not: Değerler ilerici oranı tarifesi = 5e ^{(j * (güçlendirici) + 1 kazandı) -5} bir formül kullanılarak belirlenebilir ^7.Düzgün hipotezini test etmek için, bu denklem uyarlamak için, değer j deneysel olarak tespit edilmelidir ya da literatürden elde edilmiştir.
   5. 'Seçim Order' kutu içinde 'Amacıyla' seçeneğini seçin.
   6. 'Bitirdi' kutu içinde: '____ için = Değer tutun' seçeneğini seçin. Kadar yanıt bekleniyor aşıyor metin kutusuna takviye programı değerini girin. Listesi tükendi edildikten sonra bu sonraki tüm girişler için gerekli çaba olacaktır.
4. Deneysel protokol oluşturma:
   Not: Grafik Devlet çıkıldı ya zaman ya da performans kriterleri dayanır devletlerin bir dizi konuyu taşır. Uygun inceleme altındaki hipotezi test etmek '$' aşağıda işaretlenmiş tüm ayrık ve bağlamsal ipuçları ve parametreleri ayarlayın.
   1. Deney Protokolü Oluştur Dosya> seçin.
   2. Uygun metin kutusuna istenilen protokol numarası ve açıklama girin.
   3. 'Devlet Yaratılışı' seçeneğini seçin.
   4. Ve 'FIN - Biten Devlet' - 'Ready Devlet rdy' hem de tüm uyaranlara ayarlayın.
   5. 'Yeni Devleti' seçeneğini ve 'S2 isim - PR yanıt.
   6. 'Yeni Devleti seçin ve o isim' S3 -. PR güçlendiricidir ve Cue '
   7. 'Yeni Devleti' seçin ve isim 'S4 - Zaman Aşımı'.
   8. Vurgu 'S1' ve isim o 'S1 -. Alışma'
      1. Ekle seçeneğini seçin 'Zaman Git.'
      2. . Dakika gibi uygun zaman ($) ve tesisler ($) girin ve S açılan kutudan İÇİN dan 'S2' seçeneğini seçin. Veritabanı ilk oluşturulduğunda zaman birimi 'birimleri' belirlendi.
         Not: oluşturulan saatine geçiş [$ dakikada S2 TO =% 100 P GO] benzer okumalısınız Şekil 1 kez oluşturulan bu olayın bir örneğidir.

   
   Mevcut durum 2 (S2) devlet çıkmalısınız zaman Şekil 1. Temsilcisi programlama örneği # 1. Zaman sınırlanmış devlet gösterilmiştir Bu durumda hangi dakikada Burada gösterilen $ bir kullanıcı tanımlı değer, gösterir.

   9. Vurgulayın 'S2 - PR yanıt.
      1. Ekle seçeneğini 'Olay Git.'
      2. L $ (örn L1) olarak ilk metin kutusuna adımda 4.3 oluşturulan ilerici oran takvimi içeren liste adını girin, uygun operandum seçin (örneğin., Kol ya da burun gedikler) birinci 'açılan kutusunu ve Seçenek S TO adlı S3 'açılır kutusundan.
         Not: oluşturulan olay benzer okuyabilirsiniz [1 L $ IF - S3 İÇİN, Aktif GO P =% 100]. Tanımlayıcı 1 - Aktif veritabanı oluşturma sırasında belirlenmiştir. Burada, 1 - Aktifanahtar tek takılı operandum bahsetmektedir.
      3. 'Zaman Git ekleyin.' Seçeneğini seçin
      4. Açılan kutusunu, 'R' kutusunu işaretleyin uygun zaman ve tesisler ($) girin ve S TO gelen 'FIN' seçeneğini seçin.
         Not: oluşturulan zamanlı olay benzer okuyabilirsiniz [$ dakika FIN TO P =% 100 GO IF R (işaretli)]. Bu set eşik bundan sonra operandum hiçbir etkinlik varsa oturumu sona erecek olmasını sağlayacaktır;., Hayvan, ayarlanan süre için güçlendiricidir-eşleştirilmiş operandum yanıt withholds sonra, yani oturum zaman aşımı olur.
      5. Ekle seçeneğini 'Olay Git.'
      6. , 'R' kutusunu işaretleyin ilk metin kutusuna 1 girin, ilk açılan kutusunu uygun operandum salınımını seçin ve açılan S kutudan İÇİN dan 'S2' seçeneğini seçin.
         Not: oluşturulan olay benzer okuyabilirsiniz [R S2 İÇİN, $ [1] Aktif GO P =% 100 sonra (kontrol)]. Bu adım o operandum serbest bırakılması üzerine sağlarBöylece devlet Oturum zaman aşımı eşiği (4.4.9.4) sıfırlama, reentered olduğunu, (yukarıda parantez ile gösterilir). Listede yer alan ilerici oranı (Adım 4.4.9.2) ya da dışarı oturum süreleri (Adım 4.4.9.4) tamamlandığında bu noktada, devlet çıkılacak. Böylece, operandum etkin olduğunu her zaman ilerici oranı doğru sayar. . Ve, operandum inaktive olduğu her zaman, örneğin, kol bırakıldığında veya burun kurcalamak çıkıldı, Oturum zaman aşımı eşiği (Adım 4.4.9.4) 'dir sıfırlama Şekil 2' S2 için programlanmış tüm geçişler temsil - Yanıt PR.. '

   
   Şekil 2. Temsilcisi programlama örneği 2.. Burada devlet, iki kriterlerden birini üzerine çıkılır. L $ Adım 4.3 oluşturulan ilerici oran programı olduğunu. Zamanlama tamamlandıktan sonraion, devlet 3 (S3) Devlete çıkar. Bu kriter programı bu duruma her iniş üzerine tekrar başlayan ziyade ilerlemek için izin veren bir Ar, sahip olmadığını unutmayın. Devlet ayrıca '$' dakika sonra çıkış FIN devlet olabilir. Bu yanıt hayır bu pencere içinde oluşursa oturumu sona erecektir sonra önceden belirlenmiş zaman aşımı eşiğidir. Bu Tartışma daha da açıklanmıştır. Son olarak, Oturum zaman aşımı eşiği her operandum açıklaması üzerine sıfırlanır. Bu nedenle, [1] 'operandum salınımını gösterir' 1 '.

   9. Vurgulayın 'S3 - PR güçlendiricidir ve Cue.'
      1. Seç 'Ekle Zaman Git'
      2. S açılan kutusundan İÇİN dan 'S4' güçlendiricidir ($) teslim ve seçmek için uygun zaman ve birimleri girin.
         Not: oluşturulan zamanlı olay [S4 İÇİN, $ saniye P GO sonra =% 100] benzer okuyabilirsiniz.
   10. Vurgulayın 'S4 - Zaman Aşımı.'
       1. 'Zaman Git' Ekle seçeneğini
       2. Aktif olmayan bir durum ($) Aşağıdaki güçlendiricidir teslimat kalır ve S açılan kutusundan İÇİN dan 'S2' seçmek için uygun zaman ve birimleri girin.
          Not: oluşturulan zamanlı olay [S2 İÇİN, $ saniye P GO sonra =% 100] benzer okuyabilirsiniz. Devlet 'S4 - Zaman Aşımı' bütün tasarımları için gerekli olmayabilir.
   11. Seç giderilmesine devletler.
       Not: Bu protokol artık çalışmaya hazırdır.

Sonuçlar

Burada yukarıda belirtilen yöntemle elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Gösterilen ilk viral vektörler (Şekil 3) ile transfekte edilir tipik bir örnektir. Genel olarak, ~ 1 mm ³ bir transfekte hacmi striatal doku elde edilir. Transfekte bölgenin hacmi Cavalieri yöntemi kullanarak seri bölümleri arasında ölçülebilir ³² Önemli olarak, transfekte edilmiş hacmi, transfekte edilmekte olan dokuda tipi gibi birçok faktöre bağlıdır.; Viral serotip; promoteri; hızı ve hacim enjekte; enjekte parçacıkların sayısı; Enjektat pH; ve mannitol gibi hiperozmolar reaktifler, ister kullanılmıştır. ^33,34 Genellikle, 10 dakika boyunca ¹⁰ ila 12 parçacık / ml, 1 ul / yan Microinject ve Obturator değiştirilmesi ile 7 ek bir dakika önce izin verir. Ayrıca, Enjektat pH 8. Sonraki çevresinde genellikle, biz motivasyon ya transgen ifade tarafından manipüle edilebilir olduğunu göstermektedir (Şekil 4)ya da farmakolojik reaktif madde mikroenjeksiyon (Şekil 5).

Şekil 4, biz Münhasıran Tasarımcı Uyuşturucu (DREADDs) tarafından aktive Tasarımcı Reseptör dile getirdi. DREADD reseptör kodlayıcı bölgesi, bir ic ribosom giriş sitesi ve mCitrine kaseti izledi. MCitrine transfekte edilen hücrelerin uygun bir görselleştirme sağlar. DREADD heterotrimerik G-protein Gαq birleştirilmiştir. Astrositler, ^28,35 ve DREADD kendisini uyarabilir Gαq-bağlanmış DREADD aktivasyonu klozapin-N-oksit (CNO, 3 mg / kg, ip) sistemli uygulanması ile aktive edilebilir. ^14,22,36 Sıçanlar şekilde eğitildi kolu 3 kol presler 60 bitişik gün içinde günde 1 saat oturumları sırasında içmek için 1 şans verdi etanol takviye için yanıt. Sonra, fareler oruç zorlanan ve nükleus çekirdek astrositler akumbens içinde Gαq-birleştiğinde DREADDs ifade edildi. 3 hafta yoksunluk, kendini Adini motivasyon sonra Nister etanol kesme ile ölçülmüştür. çekirdeğinin ^21,27-30 aktivasyonu sistemik CNO uygulama yoluyla, yoksunluk, taşıyıcı ile karşılaştırılmıştır sonra etanol ile kendi kendilerine uygulamalarına devam etmek için farelerin motivasyon azalma çekirdek astrositler akumbens. Önemlisi, CNO yerine DREADD Yeşil Floresan Protein dile getiriyordu eşit eğitimli kohort etkisi olmamıştır.

Microinjected virüs tarafından transfekte Şekil 3. Örnek ventral striatal bölgesi. Bu görüntü çekirdeğinin bölgesi yukarıdaki yöntemi izleyerek transfekte edilmiştir astrositleri akkumbens göstermektedir. Veriler telif hakkı sahibinin izni ile Bull ve ^{ark., 13} yeniden basıldı edilir. Detaylar bu yayın ve beraberindeki ek malzeme bulunabilir."blank> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kendi kendine uygulamak etanole farelerin Şekil 4. Motivasyon çekirdeği çekirdek astrositler akumbensteki. Eksprese fazla virüs ifade etmek için bir hafta sonra, virüs izin mikroenjeksiyon ile enjekte edildi ve motivasyon kesme ile ölçülmüştür bir transgen aktive azaltılmıştır. Transgen Münhasıran Tasarımcı Uyuşturucu (DREADDs) tarafından Tasarımcı Reseptör Aktif edildi dile getirdi. Bir tek-yollu ANOVA (F (2,30) = 3.29, p = 0.04), bir post-hoc Scheffé ortaya takip ettiği klozapin-N-oksit sistemli uygulanması ile DREADD aktivasyonu (CNO, 3 mg / kg, ip ) önemli ölçüde yerine DR) CNO Yeşil Floresan Protein (GFP ifade edildi eşit eğitimli kohort hiçbir etkisi yoktu araca kıyasla yoksunluk sonra kendini administer etanole sıçanların motivasyon azalırEADD. Veriler telif hakkı sahibinin izni ile Bull ve ^{ark., 13} yeniden basıldı edilir. Detaylar bu yayın ve beraberindeki ek malzeme bulunabilir.

Şekil gap junction bloker 5. Mikroenjeksiyon perhiz sonrası etanol-yönetmek kendini sıçanların motivasyonunu arttırdı iki gap junction blokerler etanol-yönetmek kendini sıçanların (kesme yoluyla ölçülen) motivasyon üzerindeki etkileri açısından değerlendirildi. Meflokin ve 18- a-glisiretinik asit (18-α). Bir iki yönlü ANOVA çekirdeğin içine boşluk kavşak blokerlerin mikroenjeksiyon çekirdek perhiz sonrası etanol-yönetmek kendini sıçanların motivasyonunu arttırdı akumbens ortaya (F (3,40) = 5.56, p = 0.003). Veriler telif hakkı sahibinin izni ile Bull ve ^{ark., 13} yeniden basıldı edilir. Detaylar bu yayında bulunabilir veEkteki ek malzeme.

Tartışmalar

Burada sunulan prosedür mikroenjeksiyon kanül ve motive davranışının moleküler yüzeylerde durulaştırmada yardımcı olacak mikroenjektörler üretimi için verimli bir araçtır. Bu yöntem çeşitli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, kişinin kendi implantlar ve mikroenjektörler üreterek, yeni deneysel parametreler hızla optimize edilebilir; yani, bir gelmesi ısmarlama bileşenler için beklemenize gerek yoktur. İkinci olarak, kanülün çapının küçük nedeniyle, daha çok kanülleri eş zamanlı olarak implante edilebilir. Bu beka artırabilir gerekli cerrahi zamanı, kısaltır, hem de hayvan başına birden implantlar verir. Sabit bir oran paradigma hızla basitçe istenen takviye takvimi içeren bir olay geçiş parametre listesine uygulayarak ilerici oran paradigma dönüştürülebilir çünkü Üçüncüsü, edimsel odaları kontrol etmek için kullanılan yazılım kolayca ilerici oran programları barındırmaktadır.

Olmakgeniş kullanışlı, genel mikroenjeksiyon işlemi mevcut hemen hemen her reaktif mikroenjeksiyon için geniş uygulanabilir olmalıdır sunuldu. Sonuç olarak, biz bu tekniğin küçük değişiklik ile gelecekte benzer yüksek fayda olmaya devam edeceğini tahmin ediyoruz. Sadece birkaç değişken değiştirerek, bu yaklaşım, reaktifler geniş bir dizi uygulanabilir. En yaygın olarak manipüle edilebilir olacaktır parametreler mikroenjektör kanül çıkıntı yapan uzunluğu, enjeksiyon hacmi, ve enjeksiyon oranını içerir. Örneğin, tek bir enjektör genellikle kronik implant etrafında oluşturan glial skar önlemek için kanül ucundan daha çıkıntı isteyebilirsiniz. Buna ek olarak, daha büyük bir hacim enjekte etmek isteyebilir. Bu kullanım ile karşılaştırıldığında (10 dakika ek bir difüzyon süresi genellikle 7 - - 10 dakika artı 3) striatal virüsü mikroenjeksiyon için, 1 uL hacmi genellikle kullanılır ve bu hacmi genellikle daha uzun bir süre boyunca enjekte edilirFarmakolojik reaktif d (genellikle 0,3-3 dakika artı 1 - 2 - 0,5 ul 3 dk ek difüzyon süresi). Kullanıcı literatürüne başvurun ve / veya ampirik iyi kendi ihtiyaçları için uygun parametreleri belirlemek gerekir. Enjeksiyondan önce mikropüskürtücü püskürtme deseni 1) kanül uzunluğu, 2) mikroenjektör uzunluğu, 3) kalite ve 4) sistem bütünlüğü: Ne olursa olsun, bu prosedürün başarısı 4 değişkenlere bağlı kritik bağlıdır. Mikroenjeksiyon yeri mikroenjektör kanül çıkıntı derinliğine bağlı olduğundan hem kanüller (Adım 1.2.8) ve mikroenjektör uzunluğu (post-bükme, Adım 2.2.1) hem tam tüm bireyler arasında bilinen ve muntazam olduğunu, bu zorunludur . Bu kolayca kolayca herhangi final yeniden ölçüm de gerekli uzunluk değil uygulamak reddederek kontrol edilebilir. Bu kılavuz kanül hemen altında oluşur Ayrıca, eğer püskürtme konumu, sadece tahmin edilebilir. Böylece, herhangi bir mikroenjektör doe olduğuTest sırasında uzun, ince dere sprey s (Adımlar 2.4.6) reddedilmelidir. Kaliteli bir enjeksiyonu, enjeksiyondan önce sistem bütünlüğü ile ilgilidir. Birden noktalar laboratuarda-silin gözlenmektedir enjektör tüm su dağıtım sonra (önceki reaktif ile doldurulmadan), sonra bir kaçak (Adım 2.4.8 ile ilgili not) giderilmesini gerekiyor. PE20 boru su ilaçtan ayıran balonu (Aşama 2.4.9) bir değil, tek bir balon (reaktif ile mikroenjektör doldurulduktan sonra) ise, daha fazla, daha sonra enjektör kısmen tıkanmıştır. Bu yapışmasına neden önlemek veya enjeksiyon aktarmak olabilir ya. Bu da kolayca çözülebilir (Not adım 2.4.8 üzerine).

Üç alternatifler vardır hayvan stereotaksik çerçeve içinde iken Microinject isterseniz. Birincisi, kimse stereotaksik manipülatör tarafından sıkıca tutulur ve ayrıca PE20 boru bağlantı sağlamak için yeterince uzatmak edilecek şekilde mikropüskürtücü yaka uzunluğunu artırabilir. İkinci olarak,e zamansal bir kanül implant ve burada sunulan standart Mikroenjektör kullanabilirsiniz. Üçüncüsü, tek çizilmiş ve parlatılmış cam pipetler kullanın başladı. ^16,17

Burada sunulan yöntemin önemli bir sınırlama en iyi yordamı hakkında bilginiz iyi ele sıçanlarda yapılan olmasıdır. Aynı araştırıcı 2 aydan fazla bir süre günlük bazda sıçan ele çünkü sonuçları bölümünde açıklanan veriler için kullanılan sıçanlar özel taşıma prosedürleri gerekli. Bu, en az 2 hafta boyunca, cerrahi implant günlük gözlem ve manipülasyon dahildir. Bununla birlikte, hızlı bir şekilde fareler stres etkilenebilir ön darbe inhibisyon deneyi öncesinde için kullanılan bir dizi teknik ile alışmış edilebilir. Bu özel alışkanlık teknikleri güzel önceden ayrıntılı oylandı. ⁴³ bu işlemlerin yanı sıra, fareler kısaltılmış mikroenjektörler du kullanılan mikroenjeksiyon işlemi alışmış olması tavsiye edilirhalka 'sahte' enjeksiyonlar. Bu sahte enjeksiyonları sırasında, mikroenjektör doku hasarını sınırlamak amacıyla dokuya çıkıntı çok önemlidir. Diğer bir deyişle, mikropüskürtücü artık 14 mm'den daha kıvrık olmalıdır. Böylece, bu tekniğin iyi uygulanması için gerekli olan tam bir alışkanlık bir sınırlama olarak görülebilir.

Birkaç davranışsal paradigmalar motivasyonunu ölçmek için mevcut olmakla birlikte, ilerleyen oran genellikle konu bir güçlendirici almak için uygulamak için istekli olduğunu çaba ölçmek için kullanılır. Ilerici oran paradigma genellikle en son tamamlanan oranda kolu presler maksimal sayısı olarak tanımlanır kesme olarak bilinen bir ölçü, üretir;.. Yani maksimum bir güçlendirici oluşturulan yanıt ²¹ ilerici oran büyüklüğünü güçlendiricidir duyarlıdır. Örneğin, daha yüksek kokain (veya sukroz) doz daha yüksek bir kesme noktası ve daha düşük kokain (veya sukroz) dozları daha düşük bir verim breakp üretmekoint. ^21,22 Buna göre, kesme motivasyon ve / veya takviye etkinliği için bir rutin olarak kullanılan proxy. ^21,23-26 kesme niyeti hayvan yanıt vermiyor belirlemek için olduğundan, ilerici oran paradigmanın önemli bir parametredir aktif kalma süresini. Sonlu oturum uzunlukları kesme değerleri yanlış kap koyabilirsiniz ve bu anormal öz-yönetim veya artış sonrası takviye duraklatma oranını azaltmak öncesi tedaviler şiddetlenir edilebilir. . Bu şaşırtmak yaklaşımların herhangi bir sayı aşılabilir;., Örneğin, oturumlar, hayvan, ortalama arası infüzyon aralığının bazı katlarına göre yanıt tevkif zaman sona ⁴⁴ Bu yaklaşımın daha yaygın olarak uygulanan varyantı vardır yanıt kez oturumları sonlandırmak için konular arasında sabit tutulur bazı ampirik olarak tespit değerine göre tevkif edilmiştir. Biz adım 4.4.9.11 bu yaklaşımı uygulamak için yöntem sağlamıştır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cannula Tubing	Amazon Supply/ Small Parts	HTXX-26T-60	26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA
Obturator	Amazon Supply/ Small Parts	GWXX-0080-30-05	33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN
Microinjector Wire	MicroGroup	33RW 304	33 gauge
Super Glue	Loctite	3924AC	Liquid, Non-gel, can be autoclaved
Microinjector Plastic Tubing	Becton Dickson	427406	PE20
Medium Weight Hemostats	World Precision Instruments	501241-G
Ruler	Fisher	09-016	150 mm
#7 Forceps	Stoelting	52100-77	Dumont, Dumostar
Rotary Tool	Dremmel	285	Two-speeds
Cut-off Disc	McMaster Carr	3602	15/16" x 0.025"
Microinjection Pump	Harvard Apparatus	PhD 2000
1 ul Glass Syringe	Hamilton	7001KH	Needle Style: 25s/2.75"/3
Cotton Tipped Applicator	Fisher	23-400-101
Lab Wipes	Kimwipes	34133
Operant Software	Coulbourn	Graphic State
Operant Chambers	Coulborun	Habitest