Le cerveau de rongeurs microinjection pour l'étude de substrats moléculaires de Motivé Comportement

Résumé

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Résumé

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Introduction

Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli^1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions⁴. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry^3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways^7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry^1,11,12.

While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,¹³ which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,¹⁴ which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles¹⁵ or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.^16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,^18-20 these procedures will not be covered here.

We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.^21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. ^21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,^21,24 we will focus mainly on practical concerns.

Protocole

Procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université Virginia Commonwealth et d'adhérer à la NIH Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation des Engins avant la chirurgie et microinjection

1. Mettre en place pour la préparation matérielle:
   1. Obtenir 26 G tube de canule, 33 G fil obturateur, 33 G tubulure de l'aiguille de microinjection, tube microinjecteur plastique (PE20 ou équivalent), deux poids moyen des pinces hémostatiques droites, bande de laboratoire, une règle, un marqueur permanent, éthanol à 70% (v / v), le stockage flacons (par exemple, 20 ml scintillation en verre), la super glue, les petits pèsent bateaux, et l'outil rotatif équipé d'un disque coupure devoir non lourd.
      Remarque: Sécurisation de l'outil rotatif à une boîte de pointe de la pipette l'aide de sangles ou de ruban est utile, car elle élève l'outil. Le port de lunettes de protection est important pour éviter les blessures lors de l'utilisation d'un outil rotatif.
   2. Placez un morceaudu laboratoire ou du ruban autoclave pour le banc.
2. Préparation des canules:
   Remarque: Au moins deux canules sont nécessaires pour un rat par injection bilatérale. Une canule supplémentaire sera utilisée dans une étape ultérieure.
   1. Acquérir une section de tube de la canule d'une longueur suffisante pour éviter la flexion au cours du processus de marquage et de découpage.
   2. Tracez une ligne de référence de 15 mm sur la bande de l'étape 1.1.2 en utilisant un stylo à pointe fine. Cela servira comme un guide pour le marquage des sections séquentielles de 15 mm sur le tuyau à l'aide d'un marqueur permanent pointu.
   3. Touchez le tube de la canule, à des points marqués, à la lente disque filature coupure de l'outil rotatif afin d'engranger le tube. Faire tourner la canule 180˚ et entailler le côté opposé du tube. Ne pas couper à travers le tube complètement, car il peut conduire à une occlusion.
   4. Fortement plier le tube afin de le casser en ~ articles 15 mm.
   5. Maintenez chaque extrémité coupée de la canule perpendiculaire à la coupuredisque entre le pouce et l'index. Tournez le tube de la canule tout en touchant la pointe de la grande surface avant du disque coupure (ie, pas le bord). Cela va générer une pointe émoussée. Remarque: Ne pas plier la canule, pour qui pourrait donner une injection hors site.
   6. Ream deux extrémités de la canule avec une aiguille 26 G biseauté (centre brun) à veiller à ce que toutes les bavures ont été enlevés et que la canule est dégagée.
   7. Passez un échantillon de coupe de fil obturateur à ~ 35 mm à travers la canule de coupe pour vérifier qu'il n'y a pas d'obstacles internes.
   8. Pick-up chaque canule individuellement à l'aide des pinces hémostatiques non fixées et mesurer chaque canule complété avec une règle pour vous assurer qu'il est exactement 14 mm de longueur.
3. Préparation d'obturateurs:
   1. Fixer un canule à environ une demi-longueur avec un poids moyen, pinces hémostatiques droites. Poser le hémostatique verrouillé sur le banc. La canule doit être perpendiculaire au banc.
      Remarque: Cette canulene doit pas être utilisé en chirurgie après avoir été détenu par hémostatiques verrouillées, comme il est plié probable.
   2. Nourrir une extrémité du fil de l'obturateur dans la canule jusqu'à ce qu'il ait atteint le banc. Rebondir le fil dans la canule pour assurer qu'une bavure est pas l'empêcher d'atteindre le banc;.-À-dire, pour atteindre la partie inférieure de la canule. La longueur de l'obturateur préviendront colmatage et la cicatrisation des tissus supplémentaires.
   3. Plier le fil en pinçant avec les doigts jusqu'à un angle de ~ 30˚ est atteint tout en maintenant le contact entre l'obturateur et le banc. Assurez-vous que l'angle de la courbure est telle qu'elle pose en affleurement avec le capuchon de la tête, et l'excès tourné vers l'avant, ce qui rend plus difficile pour le rat à supprimer.
   4. Retirez le fil de la canules et couper la partie excédentaire à ~ 2,5 mm du coude avec des petits tailleurs diagonales (couteaux de fil).
      Remarque: Au moins deux obturateurs seront nécessaires pour un rat par injection bilatérale, chaque canule implantée nécessite un obturateur. Créationune mi-chemin ~ 35˚ coude supplémentaire à travers l'obturateur sera également aider à prévenir l'enlèvement par l'animal. Stocker à la fois les canules et obturateurs dans des fioles distinctes (par exemple., 20 ml scintillation en verre) contenant 70% d'éthanol (v / v) jusqu'à l'utilisation, mais au moins O / N.
4. Préparation et contrôle de microinjecteurs:
   1. Obtenir un morceau de tube de l'aiguille de micro-injecteur qui est d'environ 1 m de long.
   2. Maintenir une extrémité du tube de micro-injecteur perpendiculairement à pinces hémostatiques droites verrouillés.
   3. Tordez le hémostatique tout en gardant la tension sur le tube à enrouler fermement autour du hémostatique au moins une fois.
   4. Mesurer 32 mm de l'extrémité opposée du tube lâche microinjecteur et de saisir ce point perpendiculairement avec une deuxième ligne droite, hémostatique de poids moyen et les verrouiller. Saisir le tube de micro-injecteur ayant hémostatiques sur le côté de 32 mm marque la plus proche de l'extrémité libre plutôt que sur le côté le plus proche du hémostatique avec fil enroulé.
   5. Bend le tube d'avant en arrière tout en gardant la tension sur le tube jusqu'à ce qu'il casse.
      Remarque: Une courbure ascendante et descendante unique, forte produira une rupture brutale, ce qui est souhaitable pour assurer que la micro-injection se produit dans la région du cerveau désirée.
   6. Inspecter les tubes de micro-injecteur afin d'assurer que les deux extrémités sont droites et que le diamètre intérieur est dégagé.
   7. Acquérir un tube de canule qui sera utilisée pour fabriquer un collier de micro-injecteur.
   8. Mesurer et marquer les sections séquentielles de 5 mm de tube de la canule à l'aide d'un marqueur permanent et une ligne de référence de 5 mm sur la bande dessinée (étape 1.1.2).
      Remarque: Chaque microinjecteur nécessite un collier. Les colliers sont tout simplement à court canules adhéré au fil de micro-injecteur.
   9. Touchez tube de la canule, à des points marqués, à la lente disque filature coupure d'outil rotatif afin d'engranger le tube. Faire tourner la canule 180˚ et entailler le côté opposé du tube. Couper complètement peut obstruer la tubulure.
   10. Nettementbend tube microinjecteur collier afin de briser dans ~ sections 5 mm.
   11. Aléser le diamètre intérieur des deux extrémités du collier avec une aiguille 26 G biseautée (moyeu brun) afin d'assurer que la plupart des bavures ont été supprimés. Quelques petites bavures vont saisir le fil de microinjecteur et aider ainsi dans le collage.
   12. Glisser une collerette sur chaque tube de micro-injecteur ~ 2 cm de l'extrémité.
   13. Créer une petite piscine de super glue dans le coin d'un petit bateau peser.
   14. Utilisez la ferraille tube de canule coupé à ~ 25 mm d'appliquer une petite quantité de colle super sur le tube de microinjecteur ~ 5 mm d'une extrémité. Ensuite, glissez le collier sur ce cordon de colle ultra sorte qu'il soit ~ 1 mm de l'extrémité du tube de micro-injection. Couvrir les deux extrémités du collier avec de la colle.
       Note: Eviter une grande accumulation de super glue sur le col, car elle empêche le tube en plastique de l'étanchéité autour de la micro-injecteur. Alors qu'il est important d'éviter d'être super glue sur l'extrémité ouverte du tube de micro-injecteur, car cela rendraitl'microinjecteur inutilisable, il est également important de faire glisser le collier aussi proche de la fin que possible pour minimiser vide volume (non injectée).
   15. Penchez la microinjecteur complété à l'extérieur d'un autre petit bateau peser avec le côté du col et laisser sécher pendant 24 heures.
   16. Obtenir une cm morceau de tuyau en plastique microinjecteur ~ 8 (PE20 ou équivalent), 1 ml seringue remplie avec de l'eau stérile, et 26 G aiguille biseautée (centre brun).
   17. Fixez une aiguille 26 G (centre brun) à la seringue et faites glisser le tube de coupe sur l'aiguille, en veillant à ne pas percer le tube.
   18. Faites glisser le tube en plastique sur l'extrémité du col de l'séchés, microinjecteur complète.
   19. Presser le piston de la seringue remplie d'eau pour tester la perméabilité.
       Remarque: L'eau devrait pulvériser très loin et tout droit sorti de la pointe de micro-injecteur. Si le flux est pas droit, l'emplacement d'injection ne sera pas correct. La source d'un spray côté ou diffuse est un pauvre pause (étape 1.4.5). Un microinjecteur devrait past être utilisé si le jet est latéralement ou diffuse. Saline doit pas être utilisé, car il pourrait obstruer le micro-injecteur ou d'une aiguille.
   20. Tirez la seringue afin d'éliminer l'eau de micro-injecteur. Conserver dans un flacon sec à l'abri, par exemple, à 20 ml scintillation en verre du flacon.
       Remarque: microinjecteurs peuvent être passés à l'autoclave après la fabrication avec la plupart des super colles, ³¹ mais cela doit être déterminées empiriquement. Des techniques de stérilisation alternatifs comprennent l'oxyde d'éthylène et l'irradiation gamma.

2. préparation et l'exécution microinjections

1. Obtenir microinjecteurs achevés, tube microinjecteur plastique (PE20 ou équivalent), pompe de micro-injection, deux petits pèsent bateaux, eau stérile, 70% d'éthanol (v / v), de l'acétone, deux seringues étanche 1 pl de verre avec une aiguille émoussée (25 G), embout de coton applicateurs en bois, des obturateurs de rechange, seringue de 1 ml, 26 G (hub brun) de l'aiguille, petite pince courbes (Style # 7 est recommandé), et le laboratoire wIPES.
2. Préparation microinjecteurs pour l'injection:
   1. Bend terminée micro-injecteur 15 mm de l'extrémité opposée à la collerette de sorte que l'angle entre les deux est ~ 95˚.
      Remarque: Un emplacement virage précis est impératif pour l'emplacement d'injection précis. Utilisation # 7 forceps (ou similaire) pour attraper le micro-injecteur et de flexion vers le haut est utile. Toujours re-mesurer la longueur avant d'effectuer des micro-injections.
   2. Couper le tube en plastique (PE20) à ~ 70 cm et glisser sur la buse microinjecteur.
      Remarque: l'ajout d'onglets de bande à un tube en plastique près à la fois le micro-injecteur et extrémité libre est utile au moment de remplir les injections, en particulier lors de l'injection deux solutions différentes. Onglets ne sont pas recommandés pour les deux tubes qu'ils deviennent encombrants lors de l'injection.
3. Préparation pompe pour micro-injections:
   1. Puissance de la pompe.
   2. Réglez diamètre de l'aiguille de microinjection, la vitesse de perfusion souhaité, et de cibler volume d'injection.
      Remarque: Le rat de perfusione et le volume d'injection dépend d'exigences expérimentales. Ce point est développé dans la discussion. Certaines pompes ont des tables de seringue pré-chargés. Si non, une table de seringue peut être trouvé sur le site (s) de fabrication.
   3. Réglez le mode de pompe à 'Volume' de sorte qu'un volume précis est livré automatiquement. Si le mode «pompe» est sélectionné à la place, l'expérimentateur doit arrêter manuellement la pompe.
   4. Ajuster la butée arrière de la pompe pour permettre à la seringue pour remplir le volume d'injection de 0,2 ul, plus un supplément.
4. Préparation microinjection seringue et microinjecteur pour l'injection:
   1. Verrouillez chaque seringue de micro-injection étanche dans le rack de la pompe de micro-injection.
   2. Placer l'embout de la seringue étanche au gaz dans l'eau stérile contenu dans un petit bateau et peser flutter doucement le piston pour lubrifier le fil interne. Uniformément tirez le piston pour la butée sur la pompe pour remplir d'eau.
   3. Faites glisser le tube PE20 qui est connected au micro-injecteur (à l'étape 2.2) sur une aiguille 26 G (moyeu brun) fixée à une seringue de 1 ml qui est rempli avec de l'eau stérile. Pulvériser de l'eau stérile à travers le micro-injecteur, et inspecter motif de pulvérisation et la distance.
      Remarque: L'eau devrait pulvériser très loin et tout droit sorti de la pointe de micro-injecteur. Si le flux est pas droit, l'emplacement d'injection ne sera pas correct.
   4. Placez le microinjecteur stérilisée sur un champ stérile.
   5. Faites glisser le tube hors de l'aiguille, en gardant le tube de microinjecteur verticale pour empêcher l'eau de couler sur tout en réduisant le tuyau en dessous de la zone endommagée par l'aiguille.
   6. Appuyez sur le piston de la seringue microinjection légèrement vers l'avant pour créer une gouttelette à l'extrémité de l'aiguille et le faire glisser le tube de PE20 rempli d'eau (qui est relié à la micro-injecteur) sur l'aiguille.
      Remarque: Cela va créer une connexion liquide-liquide qui permettra à contre-pression appropriée qui pourrait déloger un sabot qui pourraient former àla pointe de la micro-injecteur.
   7. Poussez le piston complètement vers l'avant pour préparer le chargement des échantillons et de veiller à ce qu'aucune trace de l'éthanol reste dans le micro-injecteur.
   8. Vérifiez la configuration des fuites en touchant la goutte d'eau qui a formé à la pointe de micro-injecteur à un laboratoire propre essuyer plusieurs fois.
5. Remarque: Lorsque vous touchez au laboratoire essuyer, une seule tache humide devrait former. Si le nombre de gouttes, il y a une fuite dans le système.
6. Éviter les fuites en contrôlant l'application de la super glue (étape 1.4.14) et en coupant le tube PE20 avec des ciseaux pointus ou une lame de rasoir en tout temps que le tube PE20 est retiré de toute connexion. En outre, répétez les étapes 2.4.3 à travers 2.4.8 pour remédier à la fuite.
7. Tirez piston de la seringue recul de 0,2 pi; la création d'une bulle entre l'eau stérile dans le tube PE20 / micro-injecteur et la solution à injecter.
8. Note: Cette bulle empêche la dilution du produit à injecter, la contamination de l'eau, et permetpour la surveillance du processus d'injection, car il se déplace au cours de l'injection. Un seul, bulle solide doit être produite. Si elle est cassée, une fuite est présente ou la pointe de micro-injecteur est occlus; ce qui indique que l'étape 2.4.8 (et la note d'accompagnement) doit être répété.
9. Placez le micro-injecteur dans le réactif à injecter et tirer lentement le piston de la seringue à la butée.
10. Préparation de l'animal pour l'injection:
11. Maintenez la poitrine du rat contre la poitrine de l'expérimentateur. Nettoyez la zone autour des canules avec un applicateur de coton imbibé d'éthanol à 70% (v / v).
12. Remarque: Avec la manipulation correcte, les souris peuvent être retenus doucement dans un creux de la main. Sinon, gommante peut être nécessaire.
13. Retirer obturateurs l'aide de petites pinces et la placer dans peser bateau avec 70% d'éthanol (v / v).
14. Exécution d'injections:
15. Placez microinjecteur rempli (étape 2.4.10) dans la canule. Appuyez sur start sur la pompe de micro-injection et le mouvement moniteur de bulle.
16. Remarque: Il MAy être nécessaire d'appliquer une légère pression pour garantir que microinjecteurs ne soulèvent pas. La bulle (formé à l'étape 2.4.9) devrait progresser de manière uniforme et entrer pleinement dans le micro-injecteur.
17. Retirer les micro-injecteurs de la canule et remplacer obturateurs, une fois que l'injection est terminée et que la période de diffusion de post-injection est passée.
18. Remarque: typiques des temps de diffusion post-injection sont de 2 - 4 min pour les réactifs pharmacologiques, et 2 - 10 min pour les virus. Laissant le microinjecteur au cours de la période post-perfusion empêche le reflux injectat de remonter la canules plutôt que la diffusion dans le tissu. La place des obturateurs du côté de la nacelle de pesée rempli d'éthanol pour permettre à l'éthanol pour écouler avant de réinsérer dans la canule.

3. post-injection de Clean Up

1. Obtenir un petit flacon de chacun: de l'eau stérile, EtOH à 70%, et de l'acétone.
2. Nettoyage microinjecteur et microinjection seringue:
   1. Retirer la seringue de verres à partir du râtelier pompe seringue et un tube de micro-injection de la seringue de verre.
   2. Débrancher les tubes de micro-injecteur de la seringue de verre et fixez une seringue de 1 ml rempli avec de l'eau stérile pour le tuyau de microinjecteur via une aiguille 26 G (centre brun). Poussez le piston de la seringue de 1 ml avant d'expulser ~ 0,3 ml. Ensuite, toucher la pointe de l'microinjecteur à un laboratoire-essuyer et aspirer l'air à travers le micro-injecteur.
      Remarque: Le micro-injecteur et de tubes peuvent être ré-utilisés pour des expériences similaires si jugé prudent.
   3. Placez aiguille de la seringue de verre dans l'eau stérile et d'en tirer pleinement plongeur arrière. Ensuite, pousser le piston complètement vers l'avant de rincer. Touchez l'embout de la seringue de verre à un laboratoire essuyez pour assurer qu'aucun liquide reste.
   4. Répétez l'étape 3.2.3 avec de l'eau stérile, de l'air, 70% EtOH, et de l'acétone dans l'ordre suivant: de l'eau stérile, de l'eau stérile, de l'air, de l'air, 70% EtOH, EtOH à 70%, de l'air, de l'air, de l'acétone, de l'acétone, de l'air, air. L'exécution de toutes ces étapes de nettoyage aidera à préserver la seringue de micro-injection.
   5. Placez la seringue (s) de microinjecteur dans l'emballage et tirez piston pour 0,05 pi.
      Note: Ceci est important, car il permet au plongeur d'être poussé ou tiré afin de déloger un plongeur coincé qui pourraient survenir doivent les dépôts de sel se former après stockage.

4. La programmation de Motivation Assay

1. Connectez-vous à État graphique avec des informations d'identification d'administrateur.
2. Sélectionnez ou créez la base de données pertinente.
3. Création calendrier ratio de renforcement progressif:
   1. Listes de sélection> Listes niveau base de données> Événement Listes transition paramètre.
   2. Sélectionnez 'Ajouter'. Entrez le numéro approprié de la liste (L #) et la description.
   3. Sélectionnez 'Ajouter Events'.
   4. Entrez la première valeur de calendrier de renforcement et sélectionnez "Ajouter". Répéter.
      Remarque: Les valeurs peuvent être déterminées en utilisant une formule où le calendrier de rapport progressive = 5e ^{(j * (renforçateur gagné + 1))} -5 ^7.Afin d'adapter cette équation de tester l'hypothèse, la valeur j doit être déterminée de manière empirique ou obtenu à partir de la littérature.
   5. Sélectionnez «en ordre» au sein de la case 'ordre de sélection'.
   6. Sélectionnez 'Hold Valeur = à: ____' intérieur de la boîte lorsque vous avez terminé. Entrez la valeur de calendrier de renfort dans la zone de texte qui dépasse de loin celle attendue de répondre. Ce sera l'effort requis pour toutes les entrées suivantes, une fois la liste a été épuisé.
4. Création d'un protocole expérimental:
   Remarque: État graphique se déplace le sujet à travers une série d'états qui sont sortis basée sur le temps ou les critères de performance. Réglez tous les indices et paramètres discrets et contextuelles marquées ci-dessous comme '$' pour tester de manière appropriée l'hypothèse en cours d'examen.
   1. Sélectionnez Fichier> Créer un protocole expérimental.
   2. Entrez le numéro de protocole désiré et la description dans la boîte de texte approprié.
   3. Sélectionnez 'État Création'.
   4. Réglez tous les stimuli à la fois pour la «RDY - État Prêt» et «FIN - état fini '.
   5. Sélectionnez 'New État »et nommez-le« S2 - PR réponse.
   6. Sélectionnez 'New État »et nommez-le« S3 - PR Reinforcer et Cue.
   7. Sélectionnez 'New État »et nommez-le« S4 - Timeout ».
   8. Mettez en surbrillance «S1» et nommez-le «S1 - accoutumance.
      1. Sélectionnez Ajouter 'Time Go To.
      2. Entrez le temps approprié ($) et les unités ($), par exemple., Minutes et sélectionnez 'S2' de la boîte S descendre à. Les unité de temps «unités» a été déterminée lorsque la base de données a été initialement créé.
         Remarque: Le passage de l'heure de création devrait lire semblable à [Après $ minutes GO P = 100%, à S2] Figure 1 est un exemple de cet événement une fois créé.

   
   Figure 1. programmation Représentant exemple n ° 1. Dans ce cas, un état ​​délimité de temps est illustré dans lequel une valeur définie par l'utilisateur $, représenté ici en quelques minutes, indique que l'état actuel devrait sortir à l'état 2 (S2).

   9. Mettez en surbrillance «S2 - PR réponse.
      1. Sélectionnez Add 'événement Atteindre.'
      2. Entrez le nom de la liste contenant le calendrier de rapport progressive qui a été créé à l'étape 4.3 dans la première zone de texte comme L $ (par exemple, L1), sélectionnez le operandum approprié (par exemple., Levier ou le nez Poke) de la première zone de liste déroulante, et sélectionnez " S3 'de à S liste déroulante.
         Remarque: L'événement créé peut lire semblable à [SI L $ 1 - active GO P = 100%, à S3]. L'identifiant 1 - active a été désigné lors de la création de base de données. Ici, 1 - activese réfère à l'operandum branché sur un commutateur.
      3. Sélectionnez 'Ajouter Temps Aller à ».
      4. Cochez la case «R», entrez le temps approprié et unités ($), et sélectionnez «FIN» de S déroulante.
         Remarque: L'événement de temps créé peut lire semblable à [R (vérifié) $ SI minutes GO P = 100%, POUR FIN]. Cela permettra d'assurer que la session se terminera si il n'y a pas d'activité sur cette operandum après le seuil de consigne;.-À-dire, la session sera arrêtée après l'animal refuse de répondre sur le operandum de renfort appariées pour la période de temps définie.
      5. Sélectionnez Add 'événement Atteindre.'
      6. Cochez la case «R», saisissez 1 dans la première zone de texte, sélectionnez la libération de operandum appropriée de la première liste déroulante, et sélectionnez «S2» de la boîte S descendre à.
         Remarque: L'événement créé peut lire semblable à [R (vérifié) $ Après [1] Actif GO P = 100%, à S2]. Cette étape garantit que lors de la libération de l'operandum(indiqué par des crochets ci-dessus), que l'Etat est réintroduit, ramenant ainsi le seuil d'inactivité de la session (4.4.9.4). À ce stade, l'Etat va quitter lorsque le rapport progressive contenue dans la liste est terminé (étape 4.4.9.2) ou les temps de session sur (étape 4.4.9.4). Ainsi, chaque fois que le operandum est activé, il compte pour le rapport progressive. . Et, à chaque fois que le operandum est inactivé; par exemple, le levier est relâché ou le poke nez est sorti, le seuil d'inactivité de la session (étape 4.4.9.4) est réinitialisé figure 2 représente toutes les transitions programmées pour 'S2 - PR réponse.. '

   
   Figure 2. La programmation Représentant exemple # 2. Ici, l'Etat est sorti sur l'un des deux critères. L $ est le barème progressif de rapport créé à l'étape 4.3. Sur le calendrier completion, l'état sort à l'état 3 (S3). Notez que ce critère n'a pas un R, qui permet le calendrier pour avancer plutôt que de recommencer à chaque rentrée dans cet état. L'Etat peut aussi quitter après quelques minutes '$' pour indiquer FIN. Ceci est le seuil de temporisation prédéterminée après laquelle la session prendra fin si aucune réponse se produit au sein de cette fenêtre. Ceci est expliqué plus loin dans la discussion. Enfin, le seuil de délai de session est réinitialisée à chaque nouvelle version de operandum. Ainsi, «[1] 'indique libération de la operandum' 1 '.

   9. Mettez en surbrillance 'S3 - PR Reinforcer et Cue.
      1. Sélectionnez 'Ajouter Temps Go To'
      2. Entrez le temps et les unités appropriée pour fournir le renfort ($), et sélectionnez «S4» dans la liste déroulante S TO.
         Remarque: L'événement de temps créé peut lire semblable à [Après $ secondes GO P = 100%, à S4].
   10. Mettez en surbrillance 'S4 - Timeout ».
       1. Sélectionnez Ajouter 'Time Go To'
       2. Entrez le temps et les unités appropriées de rester dans un état inactif ($) prestation de renfort suivante, et sélectionnez «S2» dans la liste déroulante S TO.
          Remarque: L'événement de temps créé peut lire semblable à [Après $ secondes GO P = 100%, à S2]. État »S4 - Timeout» ne peut être exigé pour tous les modèles.
   11. Sélectionnez Etats Resolve.
       Remarque: Ce protocole est maintenant prêt à fonctionner.

Résultats

Ici, nous montrons des exemples de résultats qui peuvent être obtenus avec le procédé ci-dessus. Montré premier est un quartier typique qui est transfectées par des vecteurs viraux (Figure 3). En général, un volume de ~ 1 transfectées ³ mm est obtenue dans un tissu striatal. Le volume de la région transfectée peut être quantifiée à travers des sections en série à l'aide de la méthode de Cavalieri ³² Fait important, le volume transfectées dépend de nombreux facteurs tels que le type de tissu étant transfectée. sérotype viral; promoteur; débit et le volume injecté; nombre de particules injectées; injecter pH; et si réactifs hyperosmolaires, tels que le mannitol, ont été utilisés. ^33,34 Typiquement, nous micro-injection 10 ¹² particules / ml, 1 pl / latéraux plus de 10 min, et laissez 7 min supplémentaires avant de remplacer obturateurs. En outre, le produit à injecter est généralement autour de pH 8. Ensuite, nous montrons que la motivation peut être manipulé par soit l'expression du transgène (figure 4)ou une micro-injection de réactif pharmacologique (figure 5).

Dans la figure 4, nous avons exprimé un récepteur Designer Exclusivement Activé par Designer Drugs (de DREADDs). La région codante du récepteur a été suivie par DREADD un site d'entrée de ribosome interne et une cassette mCitrine. Le mCitrine permet la visualisation commode de cellules transfectées. Le DREADD a été couplé à la protéine G hétérotrimérique-Gaq. Activation du couplage DREADD Gaq peut stimuler les astrocytes, ^28,35 et la DREADD lui-même peut être activé par l'administration systémique de la clozapine N-oxyde (CNO, 3 mg / kg, ip). Les rats ont été formés ^14,22,36 à levier répondre pour le renforcement de l'éthanol, où 3 presses à levier ont donné une chance de boire pendant les jours 1 h séances de plus de 60 jours consécutifs. Ensuite, les rats ont été contraints à l'abstinence, et DREADDs Gaq couplés ont été exprimés dans le noyau accumbens astrocytes de base. Après trois semaines d'abstinence, la motivation à l'auto-ADMI nistre de l'éthanol a été mesurée par point d'arrêt. ^21,27-30 activation du noyau accumbens astrocytes de base, par l'intermédiaire de l'administration systémique CNO, a diminué la motivation des rats pour reprendre l'éthanol auto-administration après l'abstinence par rapport à un véhicule. Surtout, le CNO n'a eu aucun effet dans une cohorte aussi formé qui exprimait la protéine fluorescente verte au lieu de la DREADD.

Figure 3. striatum ventral région Représentant transfectées par le virus microinjecté. Cette image illustre la région du noyau accumbens astrocytes qui ont été transfectées en suivant la méthode ci-dessus. Les données sont reproduites à partir de Bull et al. ¹³ avec la permission du titulaire du droit d'auteur. Les détails peuvent être trouvés dans cette publication et le matériel complémentaire d'accompagnement.blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Motivation des rats à auto-administrer de l'éthanol a été réduite par l'activation d'un transgène qui a été sur-exprimé dans le noyau accumbens astrocytes de base. Le virus a été microinjecté et la motivation mesurée par point d'arrêt après avoir laissé une semaine pour le virus d'exprimer. Le transgène exprimé était un créateur Receptor Exclusivement Activé par Designer Drugs (de DREADDs). Une ANOVA à sens unique (F (2,30) = 3,29, p = 0,04), suivie par un post-hoc Scheffé révélé que l'activation de la DREADD par l'administration systémique de la clozapine N-oxyde (CNO, 3 mg / kg, ip ) réduit de façon significative la motivation des rats à auto-administrer de l'éthanol après l'abstinence par rapport à un véhicule CNO n'a eu aucun effet dans une cohorte aussi formé qui exprimait la protéine fluorescente verte (GFP) au lieu de la DREADD. Les données sont reproduites à partir de Bull et al. ¹³ avec la permission du titulaire du droit d'auteur. Les détails peuvent être trouvés dans cette publication et le matériel complémentaire d'accompagnement.

Figure 5. microinjection de Gap bloqueurs de jonction a augmenté la motivation des rats à l'auto-administrer éthanol après l'abstinence Deux bloquants des jonctions lacunaires ont été évalués pour leur effet sur ​​la motivation (mesurée par l'intermédiaire de points d'arrêt) de rats à l'auto-administrer de l'éthanol:. Méfloquine et 18- a-acide glycyrrhétinique (18-α). Une ANOVA à deux voies a révélé que la micro-injection de bloqueurs écart-jonction dans le noyau accumbens base a augmenté la motivation des rats à l'auto-administrer éthanol après l'abstinence (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Les données sont reproduites à partir de Bull et al. ¹³ avec la permission du titulaire du droit d'auteur. Les détails peuvent être trouvés dans cette publication etle matériel complémentaire d'accompagnement.

Discussion

La procédure présentée ici est un moyen efficace pour la fabrication de micro-injection canules et microinjecteurs qui aideront à élucider les substrats moléculaires de comportement motivé. Cette méthode offre plusieurs avantages. D'abord, par la fabrication propres implants et microinjecteurs de un, de nouveaux paramètres expérimentaux peuvent être rapidement optimisées;-à-dire, on n'a pas besoin d'attendre pour les composants sur mesure pour arriver. Deuxièmement, en raison du faible diamètre de la canule, plus canules peuvent être implantés simultanément. Cela raccourcit le temps chirurgical nécessaire, ce qui peut améliorer la survie, et permet également de multiples implants par animal. Troisièmement, le logiciel utilisé pour contrôler les chambres opératoires accueille facilement les horaires de rapport progressistes depuis un ratio paradigme fixe peut être rapidement converti en un ratio paradigme progressive en appliquant simplement une liste de paramètres de transition de l'événement qui contient le programme de renforcement souhaitée.

Êtrelargement utile, un procédé de micro-injection a été présenté générique qui devrait être largement applicable pour la micro-injection de presque n'importe quel réactif actuellement disponibles. Par conséquent, nous prévoyons que cette technique continuera d'être d'une grande utilité similaire à l'avenir avec des modifications mineures. En changeant seulement quelques variables, cette approche peut être appliquée à un grand nombre de réactifs. Les paramètres qui le plus souvent être manipulées comprennent la longueur du micro-injecteur qui fait saillie à partir de la canule, le volume de l'injection et la vitesse d'injection. Par exemple, on peut vouloir l'injecteur pour faire saillie plus loin de la pointe de la canule pour éviter la cicatrice gliale qui forme généralement autour des implants chroniques. En outre, on peut souhaiter pour injecter un volume plus important. Pour les micro-injections de virus du striatum, un volume de 1 ul est habituellement utilisé et ce volume est typiquement injecté sur une période de temps plus longue (souvent 7-10 min plus 3-10 min temps de diffusion supplémentaire) par rapport à l'utilisation queD pour les réactifs pharmacologiques (généralement 0,3 - 0,5 pi plus de 2 - 3 min plus 1 - 3 min temps de diffusion supplémentaire). L'utilisateur devrait consulter la littérature et / ou empiriquement déterminer les paramètres les mieux adaptés à leurs besoins. Peu importe, le succès de cette procédure dépend essentiellement de 4 variables: 1) la longueur de la canule, 2) la longueur de microinjecteur, 3) la qualité du modèle microinjecteur de pulvérisation, et 4) l'intégrité du système avant l'injection. Parce emplacement de micro-injection est fonction de la profondeur que le micro-injecteur fait saillie à partir de la canule, il est impératif que les deux canules (étape 1.2.8) et la longueur de micro-injecteur (post-flexion, l'étape 2.2.1) sont à la fois connue avec précision et uniforme entre tous les sujets . Cela peut facilement être contrôlé par facilement rejeter tout mettre en œuvre ce ne est pas la longueur nécessaire à la ré-mesure finale. En outre, l'emplacement d'injection ne peut être prédit si elle se produit immédiatement en dessous de la canule de guidage. Ainsi, toute microinjecteur That Does pas vaporiser une longue, mince filet sur des tests (étapes 2.4.6) devraient être rejetées. Une injection de qualité est également liée à l'intégrité du système avant l'injection. Si après la distribution toute l'eau de l'injecteur (avant le remplissage avec le réactif) multiples taches sont observées sur le laboratoire-essuyer, puis une fuite doit être corrigée (Note sur l'étape 2.4.8). En outre, si la bulle (étape 2.4.9) qui sépare le médicament à partir de l'eau dans la tubulure PE20 est pas une, bulle unique (après remplissage de la micro-injecteur ayant réactif), puis l'injecteur est partiellement obstrué. Ce sabot pourrait prévenir ou détourner l'injection. Cela aussi peut être aisément remédié (Note sur l'étape 2.4.8).

Si l'on veut micro-injection alors que l'animal est dans le cadre stéréotaxique il ya trois alternatives. En premier lieu, on pourrait augmenter la longueur du col de micro-injecteur de telle sorte qu'il peut être tenu fermement par le manipulateur stéréotaxique et également prolonger suffisamment loin pour permettre la connexion à un tube PE20. D'autre part, sure temporellement pourrait implanter une canule et d'utiliser la norme microinjecteur présenté ici. Troisièmement, on pourrait utiliser dessinée et des pipettes en verre poli. ^16,17

Une limitation importante de la procédure présentée ici est qu'il est mieux menée chez le rat bien gérées qui sont familiers avec la procédure. Les rats utilisés pour les données décrites dans la section des résultats nécessaires pas de procédures spéciales de manipulation parce que le même enquêteur manipulé des rats sur une base quotidienne pendant plus de 2 mois. Cela comprenait l'observation quotidienne et la manipulation de l'implant chirurgical pendant au moins 2 semaines. Cependant, les rats peuvent être habitués rapidement par un certain nombre de techniques qui sont utilisées pour avant l'essai d'inhibition de pré-impulsion, qui peut être affecté par le stress. Ces techniques d'habituation spéciales ont été bien détaillé précédemment. ⁴³ En plus de ces procédures, il est conseillé que les rats sont habitués à la procédure de microinjection où microinjecteurs raccourcis sont utilisés duanneau injections «fictives». Au cours de ces injections simulées, il est essentiel que le microinjecteur pas dépasser dans le tissu afin de limiter les dommages aux tissus. En d'autres termes, le micro-injecteur ne doit pas être plié plus de 14 mm. Ainsi, l'accoutumance complet requis pour la mise en oeuvre optimale de cette technique peut être considérée comme une limitation.

Bien que plusieurs paradigmes comportementaux existent pour mesurer la motivation, le rapport progressif est couramment utilisé pour quantifier l'effort que l'objet est disposé à exercer pour obtenir un renforcement. Le ratio paradigme progressif produit une mesure connue sous le nom de point d'arrêt, qui est souvent défini comme le nombre maximal de presses à levier dans le dernier rapport complété;..-À-dire, répondre maximale qui a généré un renforçateur ²¹ Le ratio progressive est sensible à renforçateur grandeur. Par exemple, la cocaïne supérieur (ou saccharose) doses produisent un point d'arrêt supérieur et de la cocaïne inférieure (ou saccharose) doses donnent une breakp inférieureoint. ^21,22 conséquent, point d'arrêt est un proxy utilisé couramment pour la motivation et / ou l'efficacité de renforcement. ^21,23-26 Parce que l'intention du point d'arrêt est de déterminer quand l'animal cesse de répondre, un paramètre important du rapport progressive paradigme est durée de la session. Longueurs de session finis peuvent mettre un faux plafond sur les valeurs de point d'arrêt, ce qui peut être exacerbée par des pré-traitements qui diminuent anormalement le taux d'auto-administration ou cette augmentation post-renforcement pause. Cette confondre peut être surmonté par un certain nombre d'approches;.. Par exemple, des séances qui se terminent lorsque l'animal a retenu répondre par un multiple de l'intervalle moyen entre perfusion ⁴⁴ Une variante plus couramment appliquée de cette approche est de mettre fin à des sessions fois répondre a été retenu par une valeur déterminée de façon empirique qui est maintenue constante dans toutes les disciplines. Nous avons fourni la méthode à appliquer cette approche à l'étape 4.4.9.11.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cannula Tubing	Amazon Supply/ Small Parts	HTXX-26T-60	26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA
Obturator	Amazon Supply/ Small Parts	GWXX-0080-30-05	33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN
Microinjector Wire	MicroGroup	33RW 304	33 gauge
Super Glue	Loctite	3924AC	Liquid, Non-gel, can be autoclaved
Microinjector Plastic Tubing	Becton Dickson	427406	PE20
Medium Weight Hemostats	World Precision Instruments	501241-G
Ruler	Fisher	09-016	150 mm
#7 Forceps	Stoelting	52100-77	Dumont, Dumostar
Rotary Tool	Dremmel	285	Two-speeds
Cut-off Disc	McMaster Carr	3602	15/16" x 0.025"
Microinjection Pump	Harvard Apparatus	PhD 2000
1 ul Glass Syringe	Hamilton	7001KH	Needle Style: 25s/2.75"/3
Cotton Tipped Applicator	Fisher	23-400-101
Lab Wipes	Kimwipes	34133
Operant Software	Coulbourn	Graphic State
Operant Chambers	Coulborun	Habitest