Enzimatik Biyosensörlerin Kullanımı Endojen ATP veya H belirlememize<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; Böbrek

Özet

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H₂O₂ in the kidney.

Özet

Enzimatik mikroelektrot biyosensörler yaygın gerçek zamanlı olarak hücre dışı sinyal ölçmek için kullanılmıştır. Bunların kullanımı çoğu Beyin dilimleri ve nöronal hücre kültürleri ile sınırlı olmuştur. Son zamanlarda, bu teknoloji, bütün organlara uygulanmıştır. Sensör tasarımı gelişmeler kan ile perfüze vivo böbreklerde hücre sinyallemesinin ölçüm mümkün kılmıştır. Mevcut protokoller sıçan böbrek interstisyumda ATP ve H _{2 O 2} sinyalizasyon ölçmek için gereken adımları listeler. İki ayrı bir sensör tasarımları ex vivo ve in vivo protokoller kullanılır. Sensörün Her iki tür de hızlı bir yanıt, duyarlı ve seçici biyosensörler vermek üzere bir seçici geçirgenliğe tabakanın üzerine ince bir enzimatik biolayer ile kaplanır. Seçici geçirgenliğe tabakası biyolojik dokuda interferents sinyal korur ve enzimatik tabakanın gliserol kinaz ve gliserol-3-Phos sıralı katalitik reaksiyon kullanırATP varlığında phate oksidaz _{H2O 2} üretmek. Ex vivo çalışmalar için kullanılan sensörler grubu ayrıca bir platin / iridyum (Pt-Ir) telidir ilgili _{H2O 2} oksidasyonu ile analiti tespit edildi. In vivo çalışmalar için sensörler yerine, kan ile perfüze doku için tasarlanmış bir mediatör kaplı altın elektrot üzerinde _{H2O 2} indirgenmesi dayanmaktadır. Nihai konsantrasyon değişiklikleri analit bilinen konsantrasyonlarına kalibrasyon ardından gerçek zamanlı amperometri ile tespit edilir. Buna ek olarak, amperometrik sinyalin spesifıkliği O ₂ ve ATP buna _H2 parçalayan örneğin katalaz gibi enzimler ve apiraz ilavesiyle kontrol edilebilir. Bu sensörler ayrıca önce ve her bir deney sonrasında doğru kalibrasyon temeline dayanmaktadır. Aşağıdaki iki protokol ATP ve _H2 Gerçek zamanlı saptama çalışma oluşturulmasıBöbrek dokularında O _2, ve daha fazla başka biyolojik karışımların veya bütün organlarda kullanım için tarif edilen yöntem genişletmek için değiştirilebilir.

Giriş

(Aynı zamanda mevcut el yazması sensörleri olarak başvurulan) Enzimatik mikroelektrot biyosensör hücre ve dokuları, canlı, dinamik sinyal süreçleri incelemek için değerli bir araç olmuştur. Sensörler biyolojik ilgili konsantrasyonlarda hücre sinyal molekülleri zamansal ve uzaysal çözünürlüğü artmış sağlarlar. Bunun yerine örnekleme ve uzun süre boyunca aralıklarla alınan hücre dışı sıvıların analiz enzimleri analit tepki olarak, bu sensörler, böylece gerçek zamanlı ölçümleri ^1,2 üreten, hızlı yanıt verir. Pürin ya da hidrojen peroksit ve bunların serbest bırakılması dinamikleri gibi otokrin ve parakrin faktörler, interstisyel konsantrasyonları hızlı tespiti, normal ve patolojik koşullarda ³ ilaçların etkileri için bir profil oluşturmak için de kullanılabilir. Şu anda, sensörler kullanılarak uygulamalar çoğunluğu beyin dokusu dilimleri ve hücre kültürlerinde ^4-10 olmuştur. Bu yazının amacı ayrıntılı protokollerdoğru bütün böbreklerde analitlerin gerçek zamanlı konsantrasyonlarını ölçmek için araçlar kurar.

Aşağıdaki protokoller interstisyel ATP ve H böbrekte _{2 O 2} sinyal incelemek için geliştirilmiştir. Böbreğin yerli ortamında, hücre dışı ATP hızla türevleri (ADP, AMP ve adenozin) içine endojen ectonucleotidases tarafından katabolize edilir. Burada kullanılan sensör diğer pürin ATP bozunma ürünleri ^{üzerinde 11} ATP'ye son derece seçicidirler. ATP serbest bırakılması ve sinyal fonksiyonu sürekli ve dinamik konsantrasyonlarının doğru izlenmesini sağlayan bu büyük bir avantaj sunuyor. İnterstisyel ATP konsantrasyonu iki Mikroelektronlar kombinasyonu, bir ATP sensörü ve null sensörü kullanılarak ölçülür. Katalaz uygulamaları ile birlikte boş sensör interstisyel _H 2 O ₂ konsantrasyonu ¹² tespit edebiliyor. Aşağıdaki protokoller senso iki farklı tasarımlar kullanınYa ex vivo veya in vivo uygulamalarda optimum özelliklere sahip rs.

Her iki tasarım bir sensör enzimatik katmanın içerdiği gliserol kinaz ve gliserol-3-fosfat oksidaz sıralı katalitik reaksiyon dayanır ve ATP mevcudiyetinde tarafından tahrik edilir. Ex vivo çalışmalarda kullanılan sensörlerin grubu, _{H2O 2,} son enzimatik reaksiyon ürünü olarak bir platin / iridyum (Pt-Ir) telidir ilgili oksidasyonu ile tespit edilir. In vivo çalışmalar için sensörler yerine, kan ile perfüze doku için tasarlanmış bir mediatör kaplı altın elektrot üzerinde ₂ O ₂ redüksiyon H dayanmaktadır. Bu yazıda anlatılan her iki protokol şeması Şekil 1'de gösterilmektedir. Bu bağlanmış enzimler yoksun hariç boş sensör karşılık gelen ATP sensörü ile aynıdır. Bu nedenle, katalaz enzimi ile _{H2O 2} saptanmasına ek olarak, sıfır sensör meaSures nonspesifik müdahaleler. ATP konsantrasyonları Boş nonspesifik müdahaleler ve ATP sensörü sinyali arka plan H _{2 O 2} algılandı çıkarılmasıyla hesaplanır. Çeşitli sensörleri ayrıca karşılık gelen Null ile eşleştirilmiş in vivo adenozin ionosine, hipoksantin, asetilkolin, kolin, glutamat, glikoz, laktat, ex vivo uygulamalar ya da adenozin ionosine d-serin ve hipoksantin gibi diğer analitler tespit etmek için ticari olarak temin edilebilir sensörü.

Doğru analitlerin tespit sensörün yeteneği düzgün öncesi ve sonrası kalibrasyon ¹³ bağlıdır. Bu analiz, biyolojik dokularda kullanım sırasında meydana sensör hassasiyeti sürüklenme hesapları sağlar. Sensör sensör enzimatik reaksiyonlarda reaktif madde olarak kullanılan bir gliserol depo tutar. Sensör gliserol içeren banyo çözümlerinde kullanılan değilse, zamanla yıkayın olacaktır. Shorter rayıt kez o zaman sensör kayması en aza indirmek için gereklidir. Ayrıca büyük sensörlerin ¹⁴ duyarlılığını azaltabilir endojen proteazlar ve protein parçaları ile kirlenme sensör.

Mevcut elyazması ex vivo ve in vivo böbrek hazırlıklarında enzimatik mikroelektrot biyosensörler kullanımını kurar. Gerçek zamanlı analit ölçümü böbrek hastalıkları ve farmakolojik ajanların mekanizmalarına yeni bakış açıları ortaya çıkarabilir hücresel sinyal görülmemiş ayrıntı sağlar.

Protokol

Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu'na uyulması aşağıdaki hayvan prosedürleri. Ön onay Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) elde edilmiştir.
NOT: Sensör üreticisi talimatları Deneme tasarımı ve önce kendi kullanımına sırasında yapılmalıdır. Sensörler kullanırken bu talimatları sonrasında optimal sonuçlar üretecektir.

1. Sensör Kalibrasyonu

1. Deneyin başlamasından önce taze stok çözümleri hazırlayın.
2. 10 mM NaPi tamponu, 100 mM NaCI, 1 mM _MgCI2, ve 2 mM gliserol içeren tampon A oluşturur. NaOH kullanılarak 7.4'e pH ayarlayın. 2-8 ° C'de saklayın.
3. -20 ° C'de saklandı stok ATP konsantrasyonu (100 mM) kullanılarak, Tampon A, 90 ul 10 ul stok eklenerek taze 10 mM ATP çözeltisi oluşturmak kalibrasyon
4. T içine ucu (Şekil 2) koyarak ATP sensörü rehydrate2-8 ° C'de en az 10 dakika süre ile tampon A içeren da rehidrasyon odası.
   Not: rehidrasyon sonra, sensörler fazla 20 saniye boyunca havaya maruz kalmamalıdır veya sensör hassasiyeti azaltılabilir. Havaya uzun pozlama beklenen ise, bir gliserol çözeltisi içine kısa bir süre sensörü daldırma. Sensörler birden deneyler için kullanılabilir ancak bu sensör rehidrasyon ile aynı günde gerçekleşmelidir. Sensörler 24 saat için tampon A ile rehidrasyon odası içinde saklanabilir.
5. Çift kanallı potentiyostat (Şekil 3) açın ve kayıt sistemi yazılımını başlatmak.
6. Tampon A. Place 3 ml kalibrasyon odasına referans elektrodu ile bir kalibrasyon odasını hazırlayın. Daha sonra, rehidrasyon odasından her sensörü alın manipülatör ekleyin ve kalibrasyon odası çözüm içine yerleştirin.
   NOT: Bir kalibrasyon odası gibi standart silikon kaplı petri kullanın. Tüm kalibrasyonları ve st yürütmekyüksek performanslı laboratuar hava masaya bir Faraday kafesi içinde udies amperometri kayıtları (Şekil 4) sırasında sinyal gürültüsünü azaltmak için. Kalibrasyon mümkün olan en iyi şekilde veri toplama başlangıç ​​yakın yapılır. In vivo uygulamalar için kalibrasyon için en uygun zaman hayvan ameliyat sonrası iyileşme döneminde olduğunu.
7. Ex vivo kalibrasyon
   1. 10 döngü için 100 mV / sn bir hızda 500 mV -500 mV ile sensörler devirli kalibrasyon odası içinde voltametri gerçekleştirin. Bu büyük ölçüde sensör duyarlılığını arttırır. 10 döngüleri gözlenen izleri Şekil 5'e bakınız.
   2. Son döngüden sonra 600 mV sensörleri polarize. Sensör akımı bir asimptotuna bozulacaktır. Sabit bir okuma 5 dakikalık bir minimum sonra elde edilir. Sıfır okuma kaydedin.
8. In vivo sensör kalibrasyonu
   1. In vivo senso üzerinde voltametri yapmayınrs. Bunun yerine, mV ila +500 30 saniye için kalibrasyon odasında sensörü polarize. Sonra 0 mV potansiyostatı ayarlamak ve sensör akımı bir asimptotuna yükselmesine izin verin. Sensör akımı asimptotuna en az 2 dakika sürecektir. Sıfır okuma kaydedin.
9. Ardışık istenen algılama aralığı kapsayan bir kalibrasyon hattı üretmek için odasına ATP çözeltisi set miktarda ekleyebilirsiniz. ATP odasına boyunca eşit dağılır olarak ATP çözüm çürüme tarafından takip başlangıçta sensör sinyali keskin bir tepe üretir. Tutanak sinyal değerleri sinyal seviyesi bir kez. Her ATP ilavesinden sonra Şekil 6A ve 7 izlerini stabilize ve sırasıyla vivo çalışmalar hem ex vivo ve ATP konsantrasyonlarını önerdi.
   NOT: Bu Analitlerin temizleyiciler kullanılarak elektrotların seçiciliğini onaylamak için önemlidir. Mevcut protokol H 2 O ₂ sinyali (Şekil 6B). Ilaçların tatbik edilecek ise, sensör ile reaktiviteleri ölçümleri çalışma öncesi belirlenmelidir.
10. ATP sensörü (sıfır seviyesinin (Şekil 7) azaltmalıdır ATP uygulama tarafından üretilen akım spesifıkliğini test etmede 2 mg / ml (89 BM / mg) olan bir stok apiraz 3 ul ekle.
11. _{(2 O 2} uygulama sıfır okuma azaltmak gerekir H tarafından üretilen akım) null sensörü özgünlüğünü test etmek için 2mg / ml stok (100 UN / mg) katalaz 3 ul ekleyin.

Sensör Araştırmalar 2. Hayvan Cerrahisi

1. Ex vivo Cerrahisi
   1. Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakım) / tıbbi sınıf O ₂ ya da başka bir onaylanmış yöntemle deneysel hayvan anestezisi. ¹² Hayvanlar sürekli olarak anestezi yeterli düzeyde sağlanması için izlenmesi gerekir ¹⁵ '. Stmümkün solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır.
      Onaylı IACUC protokollerine göre hayvan Euthanize: Not. Tüm hayatta olmayan prosedürlerin tamamlanmasıyla hayvanın ¹² insani ölümünü sağlamak için pnömotoraks uyaran torakotomi ile derinden anestezi hayvanlar euthanize.
   2. Sırtüstü pozisyonda sıcaklık kontrollü cerrahi masaya sıçan yerleştirin. Uygun bir anestezi derinliği muhafaza edilirken, sol böbrek doğrultusunda yaklaşık 5 sm bir orta hat kesi yapmak ve merkezden uzak karın aortu maruz kalmaktadır.
   3. Çölyak ve superior mezenterik arterler ve bu arterlerin üzerinde abdominal aorta etrafında bitişik harfleri sarın ama Arter yok. Renal arterlerin altında abdominal aorta etrafında iki bitişik harfler sarın.
   4. Bitişik harfler üzerinde abdominal aorta Kelepçe. Alt bitişik harfleri bağlayın. Polietilen boru (PE50) ile abdominal aorta kateter. İkinci aort ligature ile kateter sabitleyin.
   5. Kelepçesini çıkartın ve mezenterik ve çölyak arterler Arter. Böbrek tamamen beyazlatılmış kadar 2-3 dakika süresince oda sıcaklığında Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi ile 6 ml / dk böbrek serpmek.
   6. Aort kısmını bağlı böbrek ve kateter, tüketim. Banyo çözeltisi ile dolu bir 3 mi Petri kabı içine böbrek yerleştirin.
      Not: Deney protokolü, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 _MgCl2, 1 _CaCl2, 10 HEPES, pH NaOH ile ayarlanmış 7,35: banyo çözeltisi mM içerir.
2. In vivo cerrahi
   1. Onaylı IACUC protokolleri kullanarak sıçan anestezisi. In vivo analiz için ketamin sıçanlar (20 mg / kg im), Inactin (50 mg / kg ip) anestezi. Hayvanlar sürekli olarak anestezi yeterli düzeyde sağlanması için izlenmesi gerekir. Kararlı bir solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır.
   2. Uygun anestezi derinliği elde sonraed, hava tablo üzerinde bulunan sıcaklık kontrollü bir topraklanmış bir yüzey üzerine sırt üstü yatırıldı sıçan yerleştirin. Yüzey önceden ısıtılmış ve 36 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir.
   3. Uygun anestezi derinliği korurken, böbrek doğrultusunda ensizyon yaklaşık 5 cm olun.
   4. Saptırmak ve tüm böbrek görünür şekilde deri ve deri altı doku demirlemek bir sütür kullanın. Herhangi bir hareket eserler en aza indirmek için bir böbrek fincan böbrek yerleştirin.
   5. Kan hacmi muhafaza etmek için, jugularis damarından 1 ml / 100 g / saatlik bir% 0.9 NaCl,% 2 BSA, bir IV infüzyonu kullanın. İdrar toplama hem üreterler cannulate. Yer superior mezenterik ve çölyak arterler etrafında bağlar ve böbrek perfüzyon basıncı (Şekil 10A) manipülasyonu için uzak aortal.
   6. Farmakolojik ajanların uygulanması in vivo deneyler sırasında gerekli ise, bir geçiş kateter yerleştirilmesi (Şekil 10B önerilir ).

3. Veri Toplama Ayarları

1. Veri toplama programını açın ve her iki ex vivo ve Anodik Pozitif in vivo deneylerde kendi polarite ayarlayın. ASCII kodu olarak verileri kaydetmek için programı ayarlayabilirsiniz.
2. Böbreklerin sensörler hızlı yerleştirilmesi için mikromanipülatörler yerleştirin.
   NOT: Alternatif olarak, sensörlerin istenen yerleşim ulaşmanıza yardımcı olmak için mikromanipülatör bağlı bir kukla prob kullanın.
3. Ex vivo veri toplama
   1. / Dakika 650 ul sabit bir oranda kanül yoluyla aort (2.1.6) banyo çözeltisi ile böbrek serpmek. Cerrahi makas kullanarak dikkatlice sensör yerleştirilmesi için gerekli olan böbrek kapsülü, kaldırın.
   2. Lastik bantlar böbrek üzerinde sarılı ve iğnelerle silikon kaplı çanak bağlı olan böbrek sabitleyin.
   3. Ucu batık ile petri böbrek yakın referans elektrot yerleştirintampon çözeltisi.
4. In vivo veri toplama
   1. Bir böbrek fincan böbrek yerleştirin. Hayvanın soyu ve yaşına bağlı olarak. Gevşek böbreği tutan bardak bir boyutunu kullanmak 8 görünen programları böbrek bardak iki boyutları Şekil. Benzer bardak gibi micropuncture vs ¹⁶ böbrek işlevinin analiz odaklı farklı fizyolojik yaklaşımlar kullanılmaktadır.
      Böbrek fincan pozisyon hayvan nefes tarafından üretilen mekanik gürültü çıkarmak için çok önemlidir, ancak müdahale veya böbrek perfüzyon veya idrar akışını engellemeyin olmalıdır: Not.
   2. Veri toplama gerçekleştirmeden önce iyileşme süresi 45 dakika bekleyin.
   3. Bir 26-30G iğne kullanarak, böbrek sensörün istenen konuma ve derinlikte bir delik delme. Dönen kanı temizlemek için yüzey delik kurulayın. Böbrek yüzeyine bir gliserol çözeltisini ekleyin. Bu deney sırasında kurumasını böbrek yüzeyini önleyecektir.
   4. Rehidrasyon odasından, ilk sensörünü çıkarın ve mikromanipülatör eklemek. Çabuk, 20 saniye içinde, böbrekte taze oluşturulan deliğe elektrot yerleştirin. Yineleyin boş sensör için 3,5-3,9 adımları.
   5. Sensörlerden gelen gelen böbrek içine yaklaşık 1 cm referans elektrot yerleştirin.
5. Potentiyostat açın ve bilgisayara kayıt programı etkinleştirin. 9 ex vivo böbrek veri toplama son kurulumunu göstermektedir. 10 eklenen bir kateter ile in vivo böbrek veri toplama son kurulumunu göstermektedir.

4. Veri Analizi

1. Menşe veya başka bir benzer yazılım içine ASCII veri dosyasını içe aktarın.
2. Konsantrasyon geçerli ilişki
   1. Geçerli bir lineer konsantrasyon (x- ekseni) oluşturmak için ATP veya H ₂ (y -Axis) ilişki lineer uyum / tahmin etmek işlevini kullanın O ₂ kalibrasyon noktası (Şekil 6 ve 7).
      doğrusal fit satır: y = mx + b
3. Konsantrasyona akımı Equate
4. Hücre içi ATP tarafından üretilen gerçek akımı elde etmek için ATP sensörünün olanlardan boş sensörünün ölçülen izleri çıkarın.
5. 4.2.1 detaylı kalibrasyon denklem kullanılarak nM'ye amperometri ile elde edilen pA ATP değerleri dönüştürür. "X" değeri her bir düzeltilmiş akımı ithal ve y (analitin konsantrasyonu) için çözerek ATP sensörünün çıkarılır veri izi konsantrasyonunu belirlemek.
6. Gerekirse Benzer şekilde, kalibrasyon denklemi H _{2 O 2} konsantrasyonu hesaplayın.

Sonuçlar

Enzimatik mikroelektrot biyosensör tasarımı bütün böbreklerde analitlerin gerçek zamanlı algılanmasını sağlar. Her iki ex vivo veya in vivo çalışmalar genel deney tasarımı kullanılan Şekil 1 hayranlarıyla sensörleri gösterilmiştir ve cerrahi işlemler çalışmaya bağlı olarak farklılık ex vivo veya in vivo olduğu.

Tekrarlanabilir sonuçlar, doğru öncesi ve sonrası kalibrasyon elde etmek olan kritik. ...

Tartışmalar

Mevcut protokoller ATP gelişmiş zamansal ve uzaysal çözünürlüğü sağlamak için geliştirilmiştir ve ex vivo perfüze izole ve in vivo kan perfüze böbrekler için H _{2 O 2} sinyal. Protokolleri ve burada kullanılan sensörler arasındaki farklar farmakolojik ajanlar ve fizyolojik çalışmalar biri için uygun veri toplama sağlar. Protokoller 1) sensör kalibrasyonu, 2) cerrahi prosedür, 3) veri toplama kurulumu ve 4) veri analizi oluşmaktadır. Onlar çok deneysel koşullar i?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor Kit	Sarissa Biomedical	SBK-ATP-05-125	The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.  Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-ATP-05-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-ATP-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe null sensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-NUL-20-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold null sensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-NUL-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe ATP Manual	Sarissa Biomedical		http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage	TMC
Dual channel potentiostat	Digi-Ivy	DY2021	Type II Faraday cage
Data acquisition program	Digi-Ivy	DY2000
Perfusion pump	Razel Scientific Instruments	Model R99E
Fiber optic illuminator	Schott	ACE 1
micromanipulator	Narishige	MM-3
micromanipulator magnetic stand	Narishige	GJ-8
air table	TMC	63-500
isoflurane ventilator	LEI Medical	M2000
3 ml petri dish	Fisher Scientific	S3358OA
needle	Santa Cruz		26-30 G
pins			Standard dissection pins
catheter			Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue	Vetbond	1469SB
suture	Look	SP117
rubber bands			any 2-4 mm wide rubber bands
silicone	Momentive	RTV-615 Clear 1#
clamp	Fine Science Tools	18052-03
standard dissection kit			Kit should include scalpel and dissection sissors
Kidney Cup			Of own design
standard chemicals	Sigma-Aldrich
ATP	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO	100 mM ATP solution
hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	216763
glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Apyrase	Sigma-Aldrich	A7646
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
isoflurane	Clipper	10250
inactin	Sigma-Aldrich	T133
ketamine	Clipper	2010012
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14025092