L&#39;utilizzo di biosensori enzimatica per quantificare endogena ATP o H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; Nel rene

Riepilogo

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H₂O₂ in the kidney.

Abstract

Biosensori microelettrodi enzimatici sono stati ampiamente utilizzati per misurare il segnale extracellulare in tempo reale. La maggior parte del loro uso è stato limitato a fettine di cervello e colture cellulari neuronali. Recentemente, questa tecnologia è stata applicata a tutto organi. I progressi nella progettazione dei sensori hanno reso possibile la misurazione di segnalazione delle cellule nel sangue-perfuso nei reni vivo. Elencare i presenti protocolli i passi necessari per misurare ATP e _H 2 O 2 segnalazione nell'interstizio rene di ratto. Due disegni sensore separato sono utilizzati per la ex vivo e in vivo protocolli. Entrambi i tipi di sensori sono rivestiti con un biolayer enzimatico sottile sopra di uno strato permselettività dare rapida risposta, biosensori sensibili e selettivi. Lo strato permselettività protegge il segnale dagli interferenti in tessuto biologico, e lo strato enzimatica utilizza la reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-phosphate ossidasi in presenza di ATP per produrre H ₂ O _2. La serie di sensori utilizzati per gli studi ex vivo ulteriormente rilevato analita mediante ossidazione di H ₂ O _{2 in un} platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. I sensori per gli studi in vivo sono invece basati sulla riduzione di H ₂ O _{2 in un} mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. Modifiche concentrazione finale vengono rilevati da amperometria tempo reale seguito da taratura a concentrazioni note di analita. Inoltre, la specificità del segnale amperometrico può essere confermato con l'aggiunta di enzimi quali catalasi e apyrase che rompono H ₂ O ₂ e ATP corrispondentemente. Questi sensori anche dipendono fortemente calibrazioni accurate prima e dopo ogni esperimento. I due protocolli seguenti stabiliscono lo studio di rilevamento in tempo reale di ATP e H ₂O ₂ in tessuti renali, e può essere ulteriormente modificato per estendere il metodo descritto per l'uso in altre preparazioni biologiche o organi interi.

Introduzione

Biosensori microelettrodi enzimatico (anche riferimento come sensori nel presente manoscritto) sono stati uno strumento prezioso per lo studio dei processi di segnalazione dinamici nelle cellule e nei tessuti viventi. I sensori offrono una maggiore risoluzione temporale e spaziale delle molecole di segnalazione cellulare in concentrazioni biologicamente rilevanti. Invece di campionamento e analizzare fluidi extracellulari effettuate ad intervalli più lunghi periodi di tempo, questi sensori rispondono più velocemente loro enzimi reagiscono all'analita, producendo misurazioni in tempo reale ^1,2. Rilevamento rapido delle concentrazioni interstiziali dei fattori autocrini e paracrini, come purine o perossido di idrogeno, e le dinamiche del loro rilascio può essere utilizzato per stabilire un profilo per gli effetti dei farmaci in condizioni normali e patologiche ^3. Attualmente, la maggior parte delle applicazioni che utilizzano sensori sono stati in fettine di tessuto cerebrale e colture cellulari ^4-10. I protocolli descritti in questo scopo manoscrittostabilire i mezzi per misurare con precisione le concentrazioni in tempo reale di analiti nei reni interi.

I seguenti protocolli sono stati sviluppati per studiare ATP interstiziale e H ₂ O ₂ segnalazione nei reni. In ambiente nativo del rene, l'ATP extracellulare viene rapidamente catabolizzata da ectonucleotidases endogeni nei suoi derivati ​​(ADP, AMP e adenosina). I sensori utilizzati sono altamente selettivi in ATP su altri purine o ATP prodotti di degradazione ^11. Questo offre un grande vantaggio in quanto permette il monitoraggio accurato delle concentrazioni costanti e dinamiche di rilascio di ATP e la sua funzione di segnalazione. Concentrazione di ATP interstiziale viene misurata utilizzando la combinazione di due microelettrodi, un sensore di ATP e un sensore Null. Il sensore Null in combinazione con applicazioni catalasi è in grado di rilevare interstiziale H ₂ O ₂ ¹² concentrazioni. I seguenti protocolli utilizzano due diversi disegni di sensors che presentano caratteristiche ottimali sia per ex vivo o in vivo. in applicazioni

Entrambi i modelli sono basati sulla reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-fosfato ossidasi contenuta in uno strato sensore enzimatica ed è guidata dalla presenza di ATP. Nella serie di sensori utilizzati negli studi ex vivo, H ₂ O _2, il prodotto finale di reazione enzimatica, viene rilevato mediante ossidazione su un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. Sensori per studi in vivo sono invece basati sulla riduzione H _{2 O 2} in un mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. In figura 1 è uno schema di entrambi i protocolli descritti in questo manoscritto. Il sensore Null è identico al suo sensore ATP corrispondente tranne che manca degli enzimi legati. Pertanto, in aggiunta al rilevamento di H ₂ O _{2 con} l'enzima catalasi, il sensore mea NullSures interferenze aspecifiche. Concentrazioni di ATP sono calcolati sottraendo il Null rilevato interferenze aspecifiche e sfondo H ₂ O ₂ dal segnale sensore ATP. Diversi sensori sono anche disponibili in commercio per individuare altri analiti tra cui l'adenosina, ionosine, ipoxantina, acetilcolina, colina, glutammato, glucosio, lattato, d-serina per applicazioni ex vivo o adenosina, ionosine, e ipoxantina in vivo se abbinato con la corrispondente Null sensore.

La capacità del sensore di rilevare esattamente analiti dipende il corretto pre e ^post-13 calibrazioni. Questo assicura che l'analisi rappresenta la deriva della sensibilità del sensore che si verifica durante l'uso in tessuti biologici. Il sensore contiene un deposito di glicerolo che viene utilizzato come reagente nelle reazioni enzimatiche sensore. Se il sensore non è usato in soluzioni contenenti glicerolo bagno, laverà nel tempo. Shorter rvolte ecording sono poi necessarie per minimizzare la deriva del sensore. Inoltre sensore incrostazione da proteasi endogene e frammenti di proteine ​​può notevolmente diminuire la sensibilità dei sensori ^14.

Il presente manoscritto stabilisce l'uso di biosensori microelettrodo enzimatiche per ex vivo e in vivo preparazioni renali. Real-time analita quantificazione fornisce dettagli senza precedenti di segnalazione cellulare che possono rivelare nuove informazioni sui meccanismi delle malattie renali e agenti farmacologici.

Protocollo

Le seguenti procedure sugli animali aderito alla guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. L'approvazione preventiva è stato ottenuto dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC).
NOTA: Revisione delle istruzioni del produttore del sensore dovrebbe essere fatto durante la progettazione dell'esperimento e prima del loro utilizzo. Seguendo queste istruzioni produrrà risultati ottimali quando si utilizzano i sensori.

1. Calibrazione sensore

1. Preparare soluzioni fresche prima dell'inizio dell'esperimento.
2. Creare tampone A contenente 10 mM tampone napi, NaCl 100 mM, 1 mM MgCl _2, e glicerolo 2 mM. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Conservare a 2-8 ° C.
3. Usando una concentrazione di ATP magazzino (100 mm) conservati a -20 ° C, creare una nuova soluzione di calibrazione 10 mM ATP con l'aggiunta di 10 microlitri magazzino a 90 ml di tampone A.
4. Reidratare il sensore ATP posizionando la punta (Figura 2) in tegli camera di reidratazione contenente tampone A per almeno 10 minuti a 2-8 ° C.
   NOTA: Dopo la reidratazione, i sensori non deve essere esposto all'aria per più di 20 secondi o la sensibilità del sensore può essere ridotta. Se si prevedono lunghe esposizioni all'aria, immergere il sensore per breve tempo in una soluzione di glicerolo. I sensori possono essere utilizzati per diversi esperimenti, ma questi devono avvenire lo stesso giorno come sensore di reidratazione. I sensori possono essere memorizzati nella camera reidratazione con tampone A fino a 24 ore.
5. Accendere potenziostato doppio canale (figura 3) e avviare il software di sistema di registrazione.
6. Preparare una camera di taratura con 3 ml di tampone A. Inserire l'elettrodo di riferimento nella camera di calibrazione. Prendere ogni sensore dalla camera di reidratazione, quindi collegarlo al manipolatore e inserirla nella soluzione di camera di taratura.
   NOTA: Utilizzare un siliconato capsula di Petri standard come una camera di taratura. Effettuare tutte le calibrazioni e studies in una gabbia di Faraday su un laboratorio tavolo aria ottimizzata per ridurre il rumore del segnale durante le registrazioni Amperometry (Figura 4). Le calibrazioni sono meglio farlo il più vicino l'inizio della raccolta dei dati il ​​più possibile. Per le applicazioni in vivo il tempo ottimale per la taratura durante il periodo di animale recupero post-operatorio.
7. Ex vivo di calibrazione
   1. Eseguire voltammetria ciclica nella camera di calibrazione pedalando sensori da -500 mV a +500 mV ad una velocità di 100 mV / sec per 10 cicli. Questo migliora notevolmente la sensibilità dei sensori. Vedere la Figura 5 per le tracce osservate dai 10 cicli.
   2. Polarizzare sensori al 600 mV dopo l'ultimo ciclo. La corrente del sensore decadrà a un asintoto. Una lettura stabile si ottiene dopo un minimo di 5 min. Registrare la lettura dello zero.
8. Calibrazione del sensore vivo in
   1. Non eseguire la voltammetria ciclica sul senso in vivors. Invece, polarizzare il sensore nella camera di calibrazione per 30 sec a +500 mV. Quindi impostare il potenziostato a 0 mV e consentire al corrente del sensore a salire a un asintoto. La corrente del sensore ci vorranno almeno 2 minuti per asintoto. Registrare la lettura dello zero.
9. Consecutivamente aggiungere set quantità di soluzione di ATP nella camera di produrre una linea di taratura che comprende un campo di rilevamento desiderata. La soluzione ATP produce un forte picco nel segnale del sensore inizialmente, seguito da un decadimento come ATP diffonde uniformemente in tutta la camera. Valori segnale di registrazione una volta che il livello del segnale è stabilizzata dopo ogni aggiunta di ATP. Figure 6A e 7 mostrano tracce e suggerito concentrazioni di ATP sia ex vivo e in vivo, rispettivamente.
   NOTA: E 'importante confermare la selettività degli elettrodi usando spazzini degli analiti. Il presente protocollo utilizzato apyrase per testare la specificità del sensore ATP e catalasi per l'H _{2 O 2 segnale (figure 6B). Se i farmaci sono da somministrare, misure della loro reattività con i sensori devono essere determinati prima dello studio.}
10. Aggiungere 3 ml di apyrase da uno stock di 2 mg / ml (89 UN / mg) per verificare la specificità del sensore ATP (la corrente prodotta dall'applicazione ATP dovrebbe ridurre al livello zero (Figura 7).
11. Aggiungere 3 ml di catalasi da uno stock di 2mg / ml (100 UN / mg) per testare la specificità del sensore nullo (la corrente prodotta da H ₂ O _{2 applicazione} dovrebbe ridurre la lettura zero).

2. Chirurgia Animale Per Gli Studi Sensor

1. Intervento chirurgico per ex vivo
   1. Anestetizzare l'animale sperimentale con isoflurano (5% di induzione, 1,5-2,5% manutenzione) / medico di grado O ₂ o altro metodo riconosciuto. ^{15 '12} Gli animali devono essere continuamente monitorate al fine di garantire un adeguato livello di anestesia. Stin grado respiratorio reazione votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l'anestesia corretta.
      Nota: Euthanize l'animale secondo protocolli IACUC approvati. Al termine di tutte le procedure non sopravvivenza eutanasia animali profondamente anestetizzati da toracotomia inducendo pneumotorace per garantire la scomparsa umana dell'animale ^12.
   2. Posizionare il ratto su un tavolo operatorio temperatura controllata in posizione supina. Pur mantenendo una profondità adeguata anestetico, fare una incisione mediana di circa 5 cm in linea con il rene sinistro ed esporre l'aorta addominale distale.
   3. Avvolgere una legatura attorno al celiaca e arterie mesenterica superiore, e l'aorta addominale sopra queste arterie, ma non legare. Avvolgere due legature intorno all'aorta addominale al di sotto delle arterie renali.
   4. Bloccare l'aorta addominale sopra le legature. Legare la legatura inferiore. Cateterizzare l'aorta addominale con tubo in polietilene (PE50). Fissare il catetere con la seconda legatura dell'aorta.
   5. Rimuovere il morsetto e legare le mesenterica e celiaci arterie. Profumato il rene a 6 ml / min con soluzione salina bilanciata Hanks a temperatura ambiente per 2-3 minuti fino a quando il rene è completamente imbiancato.
   6. Asportare il rene ed il catetere, connessa porzione dell'aorta. Posizionare il rene in una piastra di Petri da 3 ml riempita di soluzione del bagno.
      Nota: protocollo esperimento può essere eseguita a temperatura ambiente. La soluzione del bagno contiene in mM: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl _2, 1 CaCl _2, 10 HEPES, pH 7,35 regolato con NaOH.
2. Intervento chirurgico per in vivo
   1. Anestetizzare il topo utilizzando protocolli IACUC approvati. Per l'analisi in vivo anestetizzare i ratti con ketamina (20 mg / kg IM) e inactin (50 mg / kg ip). Gli animali devono essere costantemente monitorati per garantire un adeguato livello di anestesia. Una reazione respiratoria stabile votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l'anestesia corretta.
   2. Dopo adeguata profondità dell'anestesia è ottenereed, posizionare il ratto in posizione supina su una superficie a terra temperatura controllata situata sul tavolo dell'aria. La superficie deve essere preriscaldato e mantenuta a 36 ° C.
   3. Pur mantenendo un'adeguata profondità dell'anestesia, fare una incisione mediana circa 5 cm in linea con il rene.
   4. Utilizzare una sutura per deviare e ancorare il tessuto cutaneo e sottocutaneo in modo che l'intero organo è visibile. Posizionare il rene in una tazza rene per ridurre al minimo eventuali artefatti da movimento.
   5. Utilizzare infusione IV del 2% BSA: 0,9% NaCl a 1 ml / 100 g / h attraverso la vena giugulare di mantenere il volume del sangue. Cannulare entrambi gli ureteri per la raccolta delle urine. Posizionare le fasce intorno mesenterici e celiaci arterie superiori e l'aorta distale per la manipolazione della pressione di perfusione renale (Figure 10A).
   6. Se è richiesta l'applicazione di agenti farmacologici durante gli esperimenti in vivo, l'inserimento di un catetere interstiziale è raccomandato (Figure 10B ).

Setup 3. Acquisizione Dati

1. Aprire il programma di acquisizione dati e impostare la polarità sia ex vivo e in vivo per anodica positiva. Impostare il programma per salvare i dati come codice ASCII.
2. Posizionare i micromanipolatori per rapido inserimento dei sensori nelle reni.
   NOTA: In alternativa, utilizzare una sonda fittizia attaccato al micromanipolatore per contribuire a realizzare il posizionamento desiderato di sensori.
3. Ex vivo acquisizione dati
   1. Profumato rene con soluzione del bagno (da 2.1.6) tramite l'aorta cannulata a una velocità costante di 650 microlitri / min. Utilizzando le forbici chirurgiche, rimuovere con attenzione la capsula renale, che è necessaria per l'inserimento del sensore.
   2. Fissare il rene con elastici legati sopra il rene e collegati al piatto siliconata con perni.
   3. Posizionare l'elettrodo di riferimento vicino al rene nella capsula di Petri con la punta sommersala soluzione tampone.
4. In acquisizione dei dati in vivo
   1. Posizionare il rene in una tazza rene. A seconda del ceppo e l'età dell'animale utilizzare una dimensione di coppa che contiene il rene liberamente. Figura 8 mostra due dimensioni di tazze renali. Tazze simili sono utilizzati per approcci fisiologici differenti focalizzati sull'analisi della funzione renale come micropuntura ecc ^16.
      Nota: La posizione della coppa rene è fondamentale per eliminare il rumore meccanico prodotto dalla respirazione animale, ma non dovrebbe interferire con o bloccare perfusione renale o flusso di urina.
   2. Lasciare 45 minuti di tempo di recupero prima di eseguire la raccolta dei dati.
   3. Utilizzando un ago 26-30G, forare foratura nella posizione desiderata e la profondità del sensore nel rene. Asciugare il foro superficie per rimuovere il sangue trasudato. Aggiungere la soluzione di glicerolo alla superficie del rene. Questo consentirà di evitare la superficie rene si secchi durante l'esperimento.
   4. Togliere il primo sensore dalla camera di reidratazione e collegarlo al micromanipolatore. Rapidamente, entro 20 secondi, inserire l'elettrodo nel foro appena creata nel rene. Ripetere i passaggi 3,5-3,9 per il sensore nullo.
   5. Inserire l'elettrodo di riferimento nel rene, circa 1 cm dal dai sensori.
5. Accendere potenziostato e attivare il programma di registrazione sul computer. La Figura 9 mostra la configurazione finale del rene ex vivo di acquisizione dati. La figura 10 mostra la configurazione finale del rene in vivo acquisizione dati con un catetere inserito.

Analisi 4. I dati

1. Importare il file di dati ASCII in origine o qualsiasi altro software simile.
2. Relazione corrente Concentrazione
   1. Utilizzare la funzione di adattamento / estrapolare lineare per costruire una concentrazione lineare (asse x) di corrente (asse y) relazione per l'ATP o H ₂ O ₂ punti di taratura (figure 6 e 7).
      Linea fit lineare: y = mx + b
3. Equiparare la corrente alla concentrazione
4. Sottrarre le tracce misurati del sensore nullo da quelli del sensore ATP per ottenere la corrente attuale prodotta da ATP intracellulare.
5. Convertire i valori ATP pA ottenuti dalla amperometria a Nm utilizzando l'equazione di taratura descritto in 4.2.1. Determinare la concentrazione della traccia dati sottratto del sensore ATP importando ogni corrente regolata nel valore "x" e risolvendo per y (la concentrazione di analita).
6. Analogamente, calcolare la concentrazione _di H 2 O ₂ dalla sua equazione di taratura se necessario.

Risultati

Il disegno del microelettrodo biosensore enzimatico consente il rilevamento in tempo reale di analiti nei reni interi. Il disegno esperimento generale sia ex vivo o in vivo è illustrato in Figura 1 .I sensori utilizzati e le procedure chirurgiche variano a seconda se lo studio è ex vivo o in vivo.

Per ottenere risultati riproducibili, pre accurate calibrazioni e post sono critici. Figura 6A mostra una traccia rappresenta...

Discussione

Gli attuali protocolli sono stati sviluppati per fornire una maggiore risoluzione temporale e spaziale di ATP _e H 2 _O 2 di segnalazione per ex vivo isolati, perfusione e in vivo reni sangue-perfusione. Le differenze tra i protocolli ei sensori utilizzati qui garantiscono l'acquisizione dei dati ottimale sia per gli agenti farmacologici o studi fisiologici. I protocolli sono costituiti da 1) calibrazione del sensore, 2) intervento chirurgico, 3) l'installazione di acquisizi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor Kit	Sarissa Biomedical	SBK-ATP-05-125	The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.  Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-ATP-05-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-ATP-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe null sensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-NUL-20-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold null sensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-NUL-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe ATP Manual	Sarissa Biomedical		http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage	TMC
Dual channel potentiostat	Digi-Ivy	DY2021	Type II Faraday cage
Data acquisition program	Digi-Ivy	DY2000
Perfusion pump	Razel Scientific Instruments	Model R99E
Fiber optic illuminator	Schott	ACE 1
micromanipulator	Narishige	MM-3
micromanipulator magnetic stand	Narishige	GJ-8
air table	TMC	63-500
isoflurane ventilator	LEI Medical	M2000
3 ml petri dish	Fisher Scientific	S3358OA
needle	Santa Cruz		26-30 G
pins			Standard dissection pins
catheter			Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue	Vetbond	1469SB
suture	Look	SP117
rubber bands			any 2-4 mm wide rubber bands
silicone	Momentive	RTV-615 Clear 1#
clamp	Fine Science Tools	18052-03
standard dissection kit			Kit should include scalpel and dissection sissors
Kidney Cup			Of own design
standard chemicals	Sigma-Aldrich
ATP	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO	100 mM ATP solution
hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	216763
glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Apyrase	Sigma-Aldrich	A7646
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
isoflurane	Clipper	10250
inactin	Sigma-Aldrich	T133
ketamine	Clipper	2010012
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14025092