Uso de biossensores para quantificar enzimática endógena ATP ou H<sub&gt; 2</sub&gt; Ó<sub&gt; 2</sub&gt; No rim

Resumo

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H₂O₂ in the kidney.

Resumo

Biossensores microeléctrodo enzimáticas têm sido amplamente utilizados para medir a sinalização extracelular em tempo real. A maioria da sua utilização tem sido limitada a fatias de cérebro e cultura de células neuronais. Recentemente, esta tecnologia tem sido aplicada aos órgãos inteiros. Avanços em design de sensor tornaram possível a medição de sinalização celular em em rins vivo perfusão de sangue. Listar os atuais protocolos os passos necessários para medir ATP e sinalização H _{2 O 2} no interstício do rim do rato. Dois modelos de sensores separados são usados ​​para o ex vivo e in vivo protocolos. Ambos os tipos de sensores são revestidos com uma fina biolayer enzimática no topo de uma camada de permeabilidade selectiva para dar resposta rápida, biossensores sensíveis e selectivos. A camada de permeabilidade selectiva protege o sinal a partir dos interferentes no tecido biológico, e a camada enzimática utiliza a reacção catalítica sequencial de glicerol cinase e glicerol-3-fosphate-oxidase na presença de ATP para produzir H _{2 O 2.} O conjunto de sensores utilizados para os estudos ex vivo mais analito detectada por oxidação _de H 2 O ₂ em uma platina / irídio eléctrodo de fio (Pt-Ir). Os sensores para os estudos in vivo são, em vez baseado na redução _de H 2 O ₂ em um eléctrodo de ouro revestido mediador concebido para o tecido perfundido de sangue. Mudanças concentração final detectado por amperometria são em tempo real seguido de calibração de concentrações conhecidas de analito. Além disso, a especificidade do sinal amperométrico pode ser confirmada pela adição de enzimas como a catalase e apirase que quebram H _{2 O 2} e ATP correspondentemente. Estes sensores também dependem fortemente de calibrações precisas antes e depois de cada experimento. Os dois protocolos seguintes estabelecer o estudo de detecção em tempo real de ATP e H _2O 2 em tecidos renais, e pode ser ainda modificado para prolongar o método descrito para o uso em outras preparações biológicas ou órgãos inteiros.

Introdução

Biossensores microeléctrodo enzimática (também referida como sensores no presente manuscrito) ter sido uma ferramenta valiosa para estudar processos dinâmicos de sinalização em células e tecidos vivos. Os sensores proporcionam uma maior resolução temporal e espacial das moléculas de sinalização celular nas concentrações biologicamente relevantes. Em vez de amostragem e análise de fluidos extracelulares tomadas em intervalos durante longos períodos de tempo, estes sensores responder tão rápido quanto suas enzimas reagem com o analito, produzindo, assim, as medições em tempo real ^{de 1,2.} Detecção rápida de concentrações intersticiais de factores autócrinos e parácrinos, como purinas ou peróxido de hidrogénio, e a dinâmica da sua libertação pode ser utilizada para estabelecer um perfil para os efeitos da droga em condições normais e patológicas ^3. Actualmente, a maioria das aplicações que usam sensores têm sido cérebro em lâminas de tecido e culturas de células ^4-10. Os protocolos detalhados nesta objetivo manuscrito paraestabelecer os meios para medir com precisão concentrações em tempo real dos analitos em rins inteiros.

Os seguintes protocolos foram desenvolvidos para estudar ATP intersticial e H _{2 O 2} a sinalização em rins. No ambiente nativo do rim, ATP extracelular é rapidamente catabolizado por ectonucleotidases endógenos em seus derivados (ADP, AMP e adenosina). Os sensores usados ​​aqui são altamente seletivas para ATP sobre outras purinas ou ATP produtos de degradação ^11. Isto oferece uma grande vantagem, pois permite um acompanhamento preciso das concentrações constantes e dinâmicas de libertação de ATP e sua função de sinalização. Intersticial concentração de ATP é medida utilizando a combinação de dois micro-eléctrodos, um sensor de ATP e um sensor nulo. O sensor nulo em combinação com catalase aplicações é capaz de detectar intersticial H _{2 O 2 a} ¹² concentrações. Os seguintes protocolos de usar dois modelos diferentes de sensoRS que possuem características ideais para tanto ex vivo ou em aplicações in vivo.

Ambos os modelos são baseados na reacção catalítica sequencial de glicerol cinase e oxidase de glicerol-3-fosfato contido em uma camada de sensor enzimática e é accionado pela presença de ATP. No conjunto de sensores utilizados nos estudos ex vivo, H _{2 O 2,} o produto final da reacção enzimática, é detectada por oxidação sobre um catalisador de platina / irídio eléctrodo de fio (Pt-Ir). Sensores para estudos in vivo em vez disso são baseados em H _{2 O 2} a redução em um eletrodo de ouro mediador revestidos específicos para o tecido perfusão de sangue. Mostrado na Figura 1 é um esquema de ambos os protocolos descritos neste manuscrito. O sensor Null é idêntico ao seu sensor de ATP correspondente exceto ela não tem as enzimas ligadas. Portanto, para além da detecção _de H 2 O ₂ com a enzima de catalase, o sensor de MEA nuloSures interferências não específicas. Concentrações de ATP são calculados subtraindo o Null detectadas interferências não específicas e fundo H _{2 O 2} a partir do sinal do sensor de ATP. Vários sensores também estão comercialmente disponíveis para a detecção de outros analitos, incluindo a adenosina, ionosine, hipoxantina, acetilcolina, colina, glutamato, glucose, lactato, d-serina por ex vivo aplicações ou adenosina, ionosine, e hipoxantina para in vivo, quando emparelhado com o nulo corresponde sensor.

A capacidade de o sensor detectar com precisão analitos depende da pré adequada e calibrações ^pós-13. Isto assegura que a análise representa o desvio na sensibilidade do sensor, que ocorre durante a utilização em tecidos biológicos. O sensor contém um depósito de glicerol que é utilizado como um reagente nas reacções enzimáticas do sensor. Se o sensor não é utilizado em soluções contendo glicerol de banho, que deve perder ao longo do tempo. Shorter recording vezes são, então, necessárias para minimizar a deriva do sensor. Além disso a incrustação do sensor por proteases endógenas e os fragmentos de proteínas podem diminuir significativamente a sensibilidade dos sensores ^14.

O presente manuscrito estabelece o uso de biossensores microeletrodos enzimáticas para a ex vivo e em preparações in vivo de rim. Em tempo real quantificação do analito fornece detalhes sem precedentes de sinalização celular que pode revelar novos insights sobre os mecanismos de doenças renais e agentes farmacológicos.

Protocolo

Os seguintes procedimentos com animais aderiram ao Manual do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A aprovação prévia foi obtida de Cuidado e Uso Comitê Institucional Animal (IACUC).
NOTA: Revisão das instruções do fabricante do sensor deve ser feito durante o delineamento experimental e antes da sua utilização. Seguindo estas instruções irá produzir os melhores resultados ao usar os sensores.

Calibração do Sensor 1.

1. Preparar soluções de fresco, antes do início da experiência.
2. Criar Tampão A contendo tampão NaPi 10 mM, NaCl 100 mM, _MgCl2 1 mM, e 2 mM de glicerol. Ajustar o pH a 7,4 usando NaOH. Armazenar a 2-8 ° C.
3. Utilizando uma concentração de estoque de ATP (100 mM) armazenado a -20 ° C, criar uma nova solução de calibração 10 mM de ATP pela adição de 10 ul de estoque de 90 ul de tampão A.
4. Re-hidratar o sensor de ATP, colocando a sua ponta (Figura 2) em tele câmara de reidratação contendo Tampão A durante pelo menos 10 min a 2-8 ° C.
   NOTA: Após reidratação, os sensores não devem ser expostos ao ar durante mais de 20 segundos ou a sensibilidade do sensor pode ser reduzida. Se longas exposições ao ar estão previstos, mergulhe o sensor brevemente em uma solução de glicerol. Os sensores podem ser usados ​​para várias experiências, mas estas devem ocorrer no mesmo dia como sensor de re-hidratação. Os sensores podem ser armazenados na câmara de hidratação com tampão A para até 24 horas.
5. Ligue o potenciostato canal duplo (Figura 3) e iniciar o software do sistema de gravação.
6. Prepara-se uma câmara de calibração com 3 ml de tampão A. Coloque o eléctrodo de referência dentro da câmara de calibração. Tome cada sensor da câmara de reidratação, em seguida, anexá-lo ao manipulador e inseri-lo na solução de câmara de calibração.
   NOTA: Use um silicone revestido placa de petri padrão como uma câmara de calibração. Realizar todas as calibrações e studies em uma gaiola de Faraday em uma mesa de ar do laboratório de alta performance para reduzir o ruído do sinal durante as gravações amperometria (Figura 4). Calibrações são o melhor feito tão perto do início da coleta de dados possível. Para aplicações in vivo, o tempo óptimo para a calibração é animais durante o período de recuperação pós-cirurgia.
7. Ex vivo calibração
   1. Realizar voltametria cíclica na câmara de calibração e ligando os sensores de -500 mV a +500 mV a uma velocidade de 100 mV / seg durante 10 ciclos. Isto melhora grandemente a sensibilidade dos sensores. Veja a Figura 5 para os traços observados a partir dos 10 ciclos.
   2. Polarizar os sensores a +600 mV após o último ciclo. O sensor de corrente irá decair para uma assíntota. Uma leitura de equilíbrio é atingido após um mínimo de 5 minutos. Registre a leitura do zero.
8. In vivo calibração do sensor
   1. Não execute a voltametria cíclica na in vivo sensors. Em vez disso, polarizar o sensor na câmara de calibração durante 30 seg a 500 mV. Em seguida, defina o potenciostato a 0 mV e permitir que a corrente do sensor de subir para uma assíntota. A corrente do sensor vai demorar pelo menos 2 min a assíntota. Registre a leitura do zero.
9. Consecutivamente adicionar conjunto quantidades de solução de ATP para dentro da câmara para produzir uma linha de calibração que abrange uma gama de detecção desejado. A solução ATP produz um pico acentuado no sinal do sensor inicialmente, seguido por um decaimento como o ATP difunde-se uniformemente ao longo da câmara. Valores de sinal de gravação uma vez que o nível do sinal se estabilizou após cada adição de ATP. As Figuras 6A e 7 mostram traços e sugere concentrações de ATP para tanto ex vivo e estudos in vivo, respectivamente.
   NOTA: É importante confirmar a selectividade dos eléctrodos usando sequestrantes dos analitos. O presente protocolo utilizado apirase para testar a especificidade do sensor de ATP e catalase para o H _{2 sinal de O 2 (Figuras 6B). Se os medicamentos são para ser administrado, as medições da sua reactividade com os sensores deve ser determinada antes do estudo.}
10. Adicionar 3 mL de apirase a partir de um stock de 2 mg / ml (89 NU / mg) para testar a especificidade do sensor de ATP (a corrente produzida por aplicação de ATP deveria reduzir ao nível zero (Figura 7).
11. Adicionar 3 mL de catalase a partir de um stock de 2 mg / ml (100 ONU / mg) para testar a especificidade do sensor nulo (a corrente produzida por aplicação de H _{2 O 2} deve reduzir a leitura de zero).

2. Cirurgia animal para estudos de Sensores

1. Cirurgia para ex vivo
   1. Anestesiar o animal experimental com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) / Medical Grade _O 2 ou outro método aprovado. ^{15 '12} animais devem ser monitorados continuamente para assegurar um nível adequado de anestesia. Streação taxa e toe pitada respiratório capaz são usados ​​para confirmar a anestesia adequada.
      Nota: eutanásia do animal de acordo com os protocolos aprovados IACUC. Após a conclusão de todos os procedimentos não-sobrevivência sacrificar animais profundamente anestesiados por toracotomia induzir pneumotórax para assegurar o desaparecimento humano do animal ^12.
   2. Colocar o rato sobre uma mesa cirúrgica de temperatura controlada em posição supina. Enquanto se mantinha uma profundidade anestésico adequado, fazer uma incisão na linha média de cerca de 5 cm em linha com o rim esquerdo e expor a aorta abdominal distai.
   3. Enrole uma ligadura ao redor do artérias celíaca e mesentérica superior ea aorta abdominal acima dessas artérias, mas não ligar. Enrole duas ligaduras em torno da aorta abdominal abaixo das artérias renais.
   4. Prenda o aorta abdominal acima das ligaduras. Amarre a ligadura inferior. Cateterize da aorta abdominal com tubo de polietileno (PE50). Fixe o cateter com a segunda ligadura aorta.
   5. Retire o grampo e ligar os mesentéricos e celíacos artérias. Perfundir rim de 6 ml / min com Solução Salina Equilibrada de Hanks à TA, durante 2-3 min, até que o rim é completamente branqueados.
   6. Excisar o rim e o cateter, ligado porção da aorta. Colocar o rim para um prato de Petri de 3 ml cheio com solução de banho.
      Nota: protocolo de experiência pode ser realizada à temperatura ambiente. A solução do banho contém em mM: 145 de NaCl, 4,5 de KCl, 2 _de MgCl2, 1 _de CaCl2, 10 de HEPES, pH 7,35 ajustado com NaOH.
2. Cirurgia para in vivo
   1. Anestesiar ratos utilizando protocolos aprovados IACUC. Para a análise in vivo anestesiar os ratos com cetamina (20 mg / kg IM) e inactina (50 mg / kg ip). Os animais devem ser continuamente monitorado para garantir um nível adequado de anestesia. Uma reação taxa e toe pitada respiratório estável são utilizados para confirmar a anestesia adequada.
   2. Depois de profundidade anestesia adequada é obterEd, colocar o rato na posição supina sobre uma superfície ligada à terra, com temperatura controlada localizado sobre a mesa de ar. A superfície deve ser pré-aquecido e mantido a 36 ° C.
   3. Enquanto se mantinha a profundidade da anestesia adequada, fazer uma incisão na linha média cerca de 5 cm em linha com o rim.
   4. Usar um sutura para desviar e ancorar no tecido cutâneo e subcutâneo para que todo o rim é visível. Coloque o rim em um copo rim para minimizar os artefatos de movimento.
   5. Utilize uma infusão IV de 2% de BSA: 0,9% de NaCl a 1 ml / 100 g / hr através da veia jugular para manter o volume de sangue. Canular ambos os ureteres para a coleta de urina. Coloque os laços em torno das artérias mesentéricas e celíacas superior ea aorta distal para a manipulação de pressão de perfusão renal (Figuras 10A).
   6. Se a aplicação de agentes farmacológicos é necessário durante os experimentos in vivo, a inserção de um cateter intersticial é recomendada (Figuras 10B ).

Setup 3. Aquisição de Dados

1. Abra o programa de aquisição de dados e definir a sua polaridade para ambos ex vivo e in vivo para Anodic positiva. Configure o programa para salvar dados como código ASCII.
2. Posicione os micromanipuladores para inserção rápida dos sensores para os rins.
   NOTA: Como alternativa, utilizar uma sonda ligada ao manequim micromanipulador para ajudar a conseguir o posicionamento desejado de sensores.
3. Ex vivo de aquisição de dados
   1. Perfundir o rim com uma solução de banho (a partir de 2.1.6) através da aorta foi canulada com uma taxa constante de 650 ul / min. Utilizando uma tesoura cirúrgica, cuidadosamente remover a cápsula do rim, o que é necessário para a inserção do sensor.
   2. Fixar o rim com bandas de borracha sobre o rim amarrados e ligados ao prato revestido de silicone com pinos.
   3. Colocar o eléctrodo de referência próximo do rim na placa de Petri com a sua ponta submersa ema solução tampão.
4. Na aquisição de dados vivo
   1. Coloque o rim em um copo de rim. Dependendo da estirpe e idade do animal usar um tamanho de copo que contém o rim frouxamente. A Figura 8 mostra dois tamanhos de copos nos rins. Copos semelhantes são usadas para diferentes abordagens fisiológicas voltadas para a análise da função renal, tais como micropunção etc ^16.
      Nota: A posição da taça do rim é crítica para remover o ruído mecânico produzido pela respiração animal, mas não deve interferir com a perfusão do rim ou bloquear o fluxo ou urina.
   2. Permitir que 45 min de tempo de recuperação antes de realizar a coleta de dados.
   3. Usando uma agulha 26-30G, fazer um buraco punção no local desejado e a profundidade do sensor no rim. Blot o buraco superfície para remover o sangue emanava. Adicionar solução de glicerol na superfície do rim. Isto irá evitar que a superfície do rim de secar durante a experiência.
   4. Retire o primeiro sensor da câmara de reidratação e anexá-lo ao micromanipulador. Rapidamente, dentro de 20 segundos, inserir o eléctrodo dentro do buraco criado recentemente no rim. Repita os passos de 3,5-3,9 para o sensor nula.
   5. Insira o eletrodo de referência para o rim, aproximadamente 1 cm a partir dos sensores.
5. Ligue o potenciostato e activar o programa de gravação no computador. A Figura 9 mostra a configuração final do ex vivo de aquisição de dados do rim. A Figura 10 mostra a configuração final do rim de aquisição de dados in vivo com um cateter inserido.

Análise 4. Dados

1. Importar o arquivo de dados ASCII em origem ou qualquer outro software semelhante.
2. Relação atual concentração
   1. Use a função de ajuste / extrapolar linear para construir uma concentração linear (eixo x) para corrente (eixo y) relação para a ATP ou _H 2 _O 2 pontos de calibração (Figuras 6 e 7).
      linear linha de ajuste: y = mx + b
3. Equiparar a corrente a concentração
4. Subtrair os vestígios de medição do sensor nulo das do sensor de ATP para obter a corrente real produzida pelo ATP intracelular.
5. Converter os valores de ATP no PA obtidos por amperometria para nm, utilizando a equação de calibração detalhado em 4.2.1. Determinar a concentração do traço do sensor de ATP dados subtraídos importando cada corrente ajustada para o valor "X" e resolvendo para y (a concentração da substância a analisar).
6. Da mesma forma, calcular H _{2 O 2} a partir da sua concentração equação de calibração, se necessário.

Resultados

O design do biossensor microeléctrodo enzimático permite a detecção em tempo real dos analitos em rins inteiros. A concepção geral para qualquer experiência ex vivo ou estudos in vivo é ilustrado na figura 1 os sensores .Os utilizada e os procedimentos cirúrgicos diferentes, dependendo se o estudo é ex vivo ou in vivo.

Para obter resultados reprodutíveis, pré precisas e calibrações pós são críticas. A figura 6A mostra

Discussão

Os actuais protocolos foram desenvolvidos para proporcionar maior resolução temporal e espacial da sinalização de ATP e H _{2 O 2} para rins perfundido de sangue ex vivo isolados, perfundidos e in vivo. As diferenças entre os protocolos e os sensores usados ​​aqui fornecem aquisição de dados ideal tanto para agentes farmacológicos ou estudos fisiológicos. Os protocolos consistem de 1) a calibração do sensor, 2) procedimento cirúrgico, 3) de configuração de aquisição de dados...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor Kit	Sarissa Biomedical	SBK-ATP-05-125	The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.  Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-ATP-05-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-ATP-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe null sensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-NUL-20-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold null sensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-NUL-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe ATP Manual	Sarissa Biomedical		http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage	TMC
Dual channel potentiostat	Digi-Ivy	DY2021	Type II Faraday cage
Data acquisition program	Digi-Ivy	DY2000
Perfusion pump	Razel Scientific Instruments	Model R99E
Fiber optic illuminator	Schott	ACE 1
micromanipulator	Narishige	MM-3
micromanipulator magnetic stand	Narishige	GJ-8
air table	TMC	63-500
isoflurane ventilator	LEI Medical	M2000
3 ml petri dish	Fisher Scientific	S3358OA
needle	Santa Cruz		26-30 G
pins			Standard dissection pins
catheter			Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue	Vetbond	1469SB
suture	Look	SP117
rubber bands			any 2-4 mm wide rubber bands
silicone	Momentive	RTV-615 Clear 1#
clamp	Fine Science Tools	18052-03
standard dissection kit			Kit should include scalpel and dissection sissors
Kidney Cup			Of own design
standard chemicals	Sigma-Aldrich
ATP	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO	100 mM ATP solution
hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	216763
glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Apyrase	Sigma-Aldrich	A7646
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
isoflurane	Clipper	10250
inactin	Sigma-Aldrich	T133
ketamine	Clipper	2010012
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14025092