Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Özet

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Özet

Inervasyonu organ ve dokuların gelişimi, homeostasis ve rejenerasyonda önemli bir rol oynar. Ancak bu olayları altta yatan mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle, diş gelişimi ve rejenerasyon innervasyonunun rolü ihmal edilmektedir.

In vivo çalışmalar birçok değişik hayvan modellerinin geliştirilmesi ve onarım işlemleri sırasında diş dokularının innervasyon desen hakkında önemli bilgiler vermiştir. Ancak, bu yaklaşımların pek çok sinir lifleri ve hedef organ ve doku arasındaki etkileşimin moleküler temelini vurgulamak için optimal değildir.

Eş-kültür araştırılması ve kontrollü ve yalıtılmış bir ortamda sinir lifleri ve dişlerin arasındaki etkileşimleri işlemek için değerli bir yöntem teşkil etmektedir. Son yıllarda, aynı kültür ortamı kullanılarak geleneksel eş-kültürleri çok kısa süreler için yapılmıştır (örneğin, iki gün)duyusal sinir lifleri üzerinde ağız ve diş dokularının gelişiminin çekici veya itici etkisini araştırmaktır. Ancak, kültür süresinin uzatma diş morfolojilerinden ve hücrelerdeki farklılaşmanın üzerindeki innervasyonunun etkilerini araştırmak için gereklidir.

Microfluidics sistemleri, uygun bir kültür ortamı nöronların ve farklı hücre tipleri arasında ko-kültürler izin verir. Son zamanlarda, trigeminal gangliyon (TG) ve diş uzun bir süre hayatta mümkün olduğunu göstermiştir birlikte kültüre edildiğinde, mikroakışkan cihazlarda, ve bu koşullar altında da in vivo olarak gösterir, aynı innervasyon deseni korumak.

Bu temelde, biz izole etmek ve bir mikroakışkan ko-kültürü sistemi kullanmaktadır.Bu protokolde trigeminal ganglion ve diş mikropları gelişmekte ko-kültür basit ve esnek bir yol için ortak kültür ganglionlar / sinirler ve hedef doku ve açıklar anlatan rolleri incelemek için Bir Contr tür etkileşimler üzerinde özel moleküllerolled ve izole bir ortam.

Giriş

Inervasyonu organ ve dokularda ^1,2 geliştirilmesi, homeostasis ve rejenerasyonda önemli bir rol oynar. ^{5 -} Ayrıca, innervasyon kök hücre proliferasyonu, mobilizasyon ve farklılaşma ³ düzenlenmesinde rol oynar. Gerçekten de, orofasyal kompleks dokularda gerçekleştirilen son çalışmalar parasempatik sinir tükürük geliştirilmesi ve rejenerasyonu ^6,7 bezleri içinde epitel progenitör hücrelerin fonksiyonu için gerekli olduğunu göstermiştir. ^{11 -} Aynı şekilde, innervasyon damak ⁸ gelişimi ve korunması için gerekli olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu gibi dişler gibi diğer önemli orofasyal organ ve dokuların gelişimi innervasyon yapılmamış ihmal rolünü analiz etmek önemlidir.

Yetişkin dişi zengin innervasyon rağmen, ve buna karşılık vücut develo tüm diğer organ ve dokularaping dişler erken doğum aşamalarında innerve başlanacak. Dişler ağız ektoderm ve kranial nöral krest kökenli mezenşimin arasındaki sıralı ve karşılıklı etkileşimleri sonucunda gelişir. Bu etkileşimler, epitel türevli ameloblast ve mine ve dentine sırasıyla ¹² oluşumundan sorumlu olan mezenşimin türetilmiş odontoblast yol açar. ^{15 -} Üstün servikal ganglionlar gelen trigeminal ganglia ve sempatik sinirler duyu sinirleri yetişkin dişleri ¹³ innerve. Embriyogenez sırasında sinir lifleri gelişmekte diş mikrop karşı trigeminal ganglion projeden kaynaklanan ve giderek onları çevreleyen ama diş papilla mezenşimin ¹³ içine nüfuz etmez. Sinir lifleri odontoblast farklılaşma ve dentin matriks birikimi ¹⁶ ile ilişkili daha ileri gelişim aşamalarında diş pulpa mezenşimi girin. Diş hamuru innervasyon completed yakında ağız boşluğunda ¹³ diş patlaması sonucu. ^{19 -} Çeşitli semaphorins ve nörotrofinler Odontogenez ¹⁶ sırasında innervasyon düzenlenmesinde rol oynadığını Önceki çalışmalar ortaya koymuştur. Daha önceki çalışmalarda açıkça innervasyon balıkların ²⁰ diş oluşumu için bir ön koşul olduğunu göstermiştir. Daha yeni çalışmalar sonik kirpi (sus) ²¹ salgılanması yoluyla duyusal sinirler tarafından düzenlenir fare kesici diş mezenşimin kök hücrelerin bu homeostasisi göstermiştir. ^{24 -} Bununla birlikte, diş başlatma, geliştirme ve yenilenme içinde innervasyon rolü hala memelilerde ²² derece tartışmalıdır.

In vivo çalışmalarda bir bolluk, çeşitli hayvan modellerinde ^13,25,26 geliştirme ve onarım işlemleri sırasında diş dokularının innervasyon desen hakkında önemli bilgiler vermiştir. Bununla birlikte, bu en APPROağrıları sinir lifleri ve hedef organ ve doku arasındaki etkileşimin moleküler temelini vurgulamak için optimal değildir. ^{29 -} Co-kültürler araştırılması ve kontrollü ve yalıtılmış bir ortamda ²⁶ sinir lifleri ve dişlerin arasındaki etkileşimleri işlemek için değerli bir yöntem teşkil etmektedir. Aynı zamanda, eş-kültürleme çeşitli teknik ayarlamalar tabidir. ^{32 -} Örneğin, sinirler ve spesifik diş dokularının (örneğin, diş hamuru, diş folikül, diş epiteli) için çoğu zaman ³⁰ uzun süreler için doku hayatta garanti etmek amacıyla farklı bir kültür ortamı gerektirir.

^{29 -} Son yıllarda, aynı kültür ortamı kullanılarak geleneksel eş-kültürler duyusal sinir lifleri ²⁷ ağız ve diş dokularının gelişiminin çekici veya itici etkilerini araştırmak için çok kısa bir süre (örneğin, iki gün) için yapılmıştır.Ancak, kültür süresinin uzatma diş morfolojilerinden ve hücrelerdeki farklılaşmanın üzerindeki innervasyonunun etkilerini araştırmak ve hedef organlarda içinde dallanma sinir liflerinin dinamiklerini incelemek için gereklidir. Bu nedenle, bitişik olmayan ko-kültürler nöronal-diş dokuları etkileşimler çalışmalar yapmak daha uygun olacaktır.

Microfluidics sistemleri, uygun bir kültür ortamı nöronların ve farklı hücre tipleri arasında ko-kültürler izin verir. Hedef doku ³³ içeren bölmeye doğru mikrokanallar boyunca nöral hücre kütlelerinden aksonlarının gelişimini izin verirken, bu cihazlarda, diş dokuları ve nöronlar farklı bölümlerinde ayrılır. Mikroakışkan cihaz zaten kanser ve neovaskülarizasyon ³⁵ hücre etkileşimleri nöronlar ve mikroglia ^34,35 arasındaki etkileşimleri hem de hücre incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, bu sistemler Dors'a arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılmıştıral kök gangliyon ve osteoblastlar ^36.

Biz son zamanlarda trigeminal gangliyon (TG) ve diş uzun süre hayatta kalmak için mümkün olduğunu göstermiştir zaman birlikte kültüre mikroakışkan cihazlar ^37. Ayrıca, biz farklı gelişim aşamalarında dişler bu in vitro koşullarda bunlar, in vivo ³⁷ göstermek trigeminal inervasyon aynı itici ya da çekici efektler korumak olduğunu göstermiştir. Bu protokol, basit, güçlü ve esnek bir şekilde birlikte kültür ganglionlar / sinirler ve hedef doku ve kontrollü ve yalıtılmış bir ortamda bu tür etkileşimler ile ilgili özel moleküllerin rollerini incelemek için hakkında bilgi sağlar.

Protokol

Tüm fareler İsviçre Hayvan Refahı Kanunu ve Kanton Veteriner ofisi, Zürih düzenlemelere uygun olarak uygun muhafaza ve ele alınmıştır.

Diseksiyon Malzeme, Kültür Medya, mikroakışkan Cihazlar 1. Hazırlık

1. Otoklav mikro diseksiyon forseps ve makas (121 ° C, sterilizasyon süresi: 20 dk) ve steril bir kapta saklayın.
2. 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 24 saat süre ile, 1 M HCI onları kuluçka cam lamelleri (24 mm x 24 mm) sterilize edin. Etanol% 99 ile steril distile H ₂ O, onlara üç kez üç kez yıkayın. Kuru daha sonra 37 ° C'de ya da steril bir akış hunisi altına lamelleri. Son olarak, otoklav veya sterilizasyon tamamlamak için UV ışığı (30 dakika) lamelleri maruz kalmaktadır. Lameller sonra etanol% 70 saklanabilir.
3. Steril forseps kullanarak dikkatlice paketinden AXIS Akson İzolasyon Aygıtlar çıkarın ve steril bir Petri kabı koyun.
4. Steril bir biyopsi yumruk kullanarak (ø: 1mm) kültür odaları yazışmalarda numune başına bir delik kültüre edilmesi (Şekil 1) oluşturun.
   NOT: uygulanan basınç tarafından zarar olabileceği gibi, mikro oluklarda çok yakın yumruk yapmayın.
5. Etanol% 70 bunları yükselmekte tarafından AXIS Akson İzolasyon Cihazları sterilize edin. Tamamen steril bir akış kaputu altında kuru ardından EKSEN Akson İzolasyon Cihazları ve lamelleri. Geçmeden önce 3 saat, en az bekleyin.
   NOT: Eksik kurutma mikroakışkan cihazların arızalı mecliste neden olacaktır.
6. 6-kuyu plaka içindeki bir 35 mm Petri kabı içine veya iyi olarak her bir lamel yerleştirin.
7. Izolasyon cihazı ve cam lamel arasında tam yapışma sağlamak için bükülmüş uçları ile forseps ile yavaşça ama sıkıca lamel ve basın üzerine AXIS Akson İzolasyon Cihazı yerleştirin.
8. Her bir kültür odası içinde, bir pipet, poli-D-lisin, 150 ul (steril 0.1 mg / ml, H ₂ damıtılmışO). Kültür odaları tüm havayı çıkarmak için, 5 dakika vakum altında mikroakışkan cihazlar yerleştirin.
9. Hala hava odaları, yeniden pipet olan odalarına poli-D-lisin solüsyonu görülebilir gerekebilir.
10. 37 ° C 'de, poli-D-lizin O / N cihazları inkübe edin.
11. Steril distile H ₂ O ile bölmeleri üç defa yıkamak
12. 150 (PBS içinde, Sigma-Aldrich, 5 ug / ml ya da serum barındırmayan ortam) il, laminin çözelti ile odaları doldurun ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
13. Şöyle oluşan trigeminal ganglion kültürleri ³⁷ için 50 ml hazırlayın: 48 mi, Neuro temelli vasat, 1 mi B-27 / ml penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin, 5 ng / ml sinir büyüme faktörü 100 U (NGF) , 12:25 sitosin arabinosid.
14. 40 mi DMEM-F12, 10 ml cenin sığır serumu (FBS, nihai konsantrasyon:% 20), aşağıdaki gibi oluşan, diş mikrop kültürlerinden ³⁷ için 50 ml hazırlayın, 100 U / ml penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin, 150 ug / ml askorbik asit.

2. Fare Embriyo Üretimi ve Diseksiyon

1. (Vajinal fişi: geliştirme 0.5, E0.5 embriyonik gün) vajinal fiş göre embriyonik yaşını belirlemek ve morfolojik kriterlere aracılığıyla onaylayın. Bu protokol için, genellikle E14.5-E17.5 fare embriyoları kullanmak.
2. Diseksiyon alanı ve etanol% 70 ile stereoskop temizleyin.
3. Servikal dislokasyon yoluyla hamile anne Kurban. Bir ızgara üzerine birinci ve ikinci parmak ile fare boyun engelleyin ve kararı kuyruğu ile çekin.
4. Alt karın çevresindeki deri teşrih ve makas kullanılarak karın açın. Rahim bulun: Gebeliğin böyle geç evrelerinde, rahim bol karın boşluğuna doldurun.
5. Buz üzerinde PBS ile dolu bir tüp içinde rahim ve yeri parçalara ayır. Zaman buz üzerinde doku birçok saat boyunca bırakılabilir. Kurumsal kurallarına göre anne cesedi atın
6. rahim embriyolar inceleyin ve onların extraembryonic dokulardan onları serbest. Buz üzerinde PBS embriyolar yerleştirin.
7. Makas kullanarak embriyolar decapitate ve mikro diseksiyon makas (Şekil 2A) kullanarak baş geri kalanından alt çene ayırın. Trigeminal ganglionlar zarar vermeden, tam alt çene çıkarın; İkinci alt çene yakın lokalize olarak, onların kaza sonucu hasar mümkündür. Buz üzerinde alt çene ve soğuk PBS başın kalan, koruyun.
8. TG incelemek için, başını alıp önce soğuk PBS ile dolu bir diseksiyon cam Petri kabı üzerine yerleştirin. Forseps kullanarak, deri ve kafatası çıkarın. Daha sonra telencephalon ve telencephalon ve asansör altındaki forseps koyarak beyincik çıkarın; telencephalon ve beyincik maruz kafatası alt bırakarak, birlikte çevirmek olacaktır.
9. (Şekil 2B'de gösterildiği gibi) trigeminal ganglionları yerelleştirilmesine. Forseps kullanıntrigeminal sinirler TG ayırmak için. Bıçaklar olarak diseksiyonu iğneler kullanılarak trigeminal projeksiyonlar kalıntılarını ortadan kaldırın. Soğuk PBS ile dolu bir Petri kabındaki disseke TG koyun ve buz üzerinde saklayın.
10. Soğuk PBS ile dolu önceden diseksiyon cam Petri kabı üzerine, kafatasından ayrılan alt çene, koyun, embriyonik dişleri incelemek için. Bıçaklar olarak diseksiyonu iğneler kullanarak, dil ve çene etrafındaki cilt kaldırmak. Çene orta hat boyunca keserek sol ve sağ hemi-çeneleri ayırın. Şekil 1C gösterildiği gibi diş mikrop kolaylıkla görebilir. Diseksiyon iğneler kullanarak diş mikropları yalıtmak ve olmayan diş dokularının fazlalığı kaldırın. Soğuk PBS ile dolu bir Petri kabındaki disseke diş mikropları yerleştirin ve buz üzerinde saklayın.

3. mikroakışkan Co-kültürler

1. Diseksiyon sonra, mikroakışkan cihazlardan laminin çıkarın. Saygımdan 200 ul odaları doldurunmedyayı ettik.
2. Forseps ile (Şekil 1D) delme tarafından oluşturulan deliklere hafifçe disseke TG ve diş mikropları aktarın. Diş mikrop yüzer yok emin olun ve onlar lamelleri temas edene kadar onlar lavabo söyledi.
3. Kültür, 37 ° C'de inkübatör içinde örnekleri,% 5 _CO2.
4. Kültür ortamı, her 48 saat değiştirin. Tamamen odaları boşaltmak etmeyin ve kültür odalarına doğrudan pipetle yok. Odaları içindeki hava kabarcıklarının oluşmasına neden olur bölmelerin tam boşalması; odasına doğrudan pipetleme aksonal hasarla sonuçlanır. Kuyuların dış tarafına doğru pipet işaret orta kaldırmak, bu sorunları önlemek için; Benzer şekilde, odalarına karşısında yer kuyuların yanında taze orta pipetle.
5. Kültür döneminde, eş-kültürleri kolayca time-lapse mikroskobu ile görüntülenebilir. Eş-kültür 10 gün boyunca muhafaza edilebilir.
6. Kültür perio sonrad odasının başına bir kuyuya PBS 150 ul pipetle ve PBS odaları aracılığıyla üç kez akış sağlayarak odaları yıkayın.
7. PBS çıkarın ve odanın başına bir kuyudaki paraformaldehit 150 ul (PBS)% 4 pipetleme örnekleri düzeltmek; 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
8. 3.6 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez odaları yıkayın.
9. Daha fazla analiz ile devam edin.

Sonuçlar

Bu sonuçlar, izole trigeminal ganglion izole diş mikrop gelişimi mikroakışkan cihazın diğer bölmeye uzun bir süre boyunca devam olduğu, ek olarak, mikro-akışkan cihazın bir bölmeye büyür ve olduğunu göstermektedir. Farklı kültür ortamı iki bölme kullanılır ve iki bölme arasında microgrooves geliştirilmesi diş mikrop doğru trigeminal ganglion gelen akson uzantısı sağlar. Şekil 3, bir fare, bir ko-kültür, immünofloresan ³⁷ üzerinden nörofilament bir görse...

Tartışmalar

Diş innervasyon in vitro çalışmalar mi, trigeminal ganglionların diş dokuları veya hücreleri ^26,28,29 geleneksel ko-kültürler dayandırılmıştır. Bu çalışmalar çoğunlukla duyusal aksonlar ³⁸ bu hücrelerin veya dokuların çekici etkisini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Alanda önemli ilerlemeler getirerek rağmen, çeşitli teknik sorunlar dile getirildi. Diş mikroplar kültür ³⁷ birkaç gün sonra dejenere başlar. Bu gözlemlere dayanarak, aynı k?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033