Analyse de développement germe dentaire innervation Utilisation de périphériques Co-culture microfluidique

Résumé

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Résumé

Innervation joue un rôle clé dans le développement, l'homéostasie et la régénération des organes et des tissus. Cependant, les mécanismes sous-jacents de ces phénomènes ne sont pas encore bien compris. En particulier, le rôle dans le développement de l'innervation de la dent et la régénération est négligée.

Plusieurs études in vivo ont fourni des informations importantes sur les motifs de l'innervation des tissus dentaires au cours des processus de développement et de réparation de divers modèles animaux. Cependant, la plupart de ces approches ne sont pas optimales pour mettre en évidence la base moléculaire des interactions entre les fibres nerveuses et les organes et tissus cibles.

Co-cultures constituent une méthode utile pour étudier et manipuler les interactions entre les fibres nerveuses et des dents dans un environnement contrôlé et isolé. Au cours des dernières décennies, les co-cultures classiques en utilisant le même milieu de culture ont été effectués pendant des périodes très courtes (par exemple, deux jours)pour étudier les effets attractives ou répulsives de développer des tissus buccaux et dentaires sur les fibres nerveuses sensorielles. Cependant, l'extension de la période de culture est nécessaire pour étudier les effets de l'innervation sur la morphogenèse de la dent et cytodifférenciation.

systèmes microfluidiques permettent des co-cultures de neurones et de différents types de cellules dans leur milieu de culture approprié. Nous avons montré récemment que les ganglions trigéminés (TG) et les dents sont en mesure de survivre pendant une longue période de temps lorsqu'ils sont co-cultivées dans des dispositifs microfluidiques, et qu'ils maintiennent dans ces conditions, le même schéma d'innervation ils montrent que in vivo.

Sur cette base, nous décrivons comment isoler et de co-culture et le développement de ganglions dents germes trijumeau dans le protocole de co-culture microfluidique décrit un moyen simple et flexible pour la co-culture ganglions / nerfs et les tissus cibles et d'étudier les rôles de molécules spécifiques sur ces interactions dans un controlled et environnement isolé.

Introduction

Innervation joue un rôle clé dans le développement, l'homéostasie et la régénération des organes et des tissus ^1,2. En outre, l'innervation est impliquée dans la régulation de la prolifération des cellules souches, la mobilisation et la différenciation ^3-5. En effet, des études récentes réalisées dans les tissus du complexe orofaciale ont montré que les nerfs parasympathiques sont nécessaires pour la fonction épithéliale de cellules souches au cours du développement et de la régénération glandes salivaires ^6,7. De même, il a été démontré que l'innervation est nécessaire pour le développement et l'entretien des papilles ^8-11. Ainsi, il est important d'analyser le rôle de l'innervation encore négligées dans le développement d'autres organes et tissus oro-faciales importants tels que des dents.

En dépit de la richesse de l'innervation dents d'adulte, et contrairement à tous les autres organes et tissus du corps, developing dents commencent à être innervée au stade de la post-natales premiers. Les dents se développent en raison des interactions séquentielles et réciproques entre l'ectoderme oral et crânienne neuronal mésenchyme de la crête dérivés. Ces interactions donnent lieu à adamantoblastes épithéliales dérivées et les odontoblastes mésenchymateuses dérivées qui sont responsables de la formation de l'émail et de la dentine, ¹² respectivement. Les nerfs sensoriels du ganglion de Gasser et les nerfs sympathiques du ganglion cervical supérieur innervent les dents d'adultes ^{de 13 à 15.} Au cours de l'embryogenèse, les fibres nerveuses émanant du projet de ganglions de Gasser vers les germes dentaires développement et progressivement entourer eux, mais ils ne pénètrent pas dans la papille mésenchyme dentaire ^13. Les fibres nerveuses pénètrent dans la pulpe dentaire mésenchyme à des stades de développement plus avancés qui sont en corrélation avec la différenciation des odontoblastes et la matrice de la dentine dépôt ^16. Pulpe dentaire innervation est complETED peu de temps après l'éruption des dents dans la cavité buccale ^13. Des études antérieures ont révélé que divers sémaphorines et neurotrophines sont impliqués dans la régulation de l'innervation cours odontogenèse ^16-19. Des études antérieures ont clairement démontré que l'innervation est une condition préalable à la formation des dents chez les poissons ^20. Des études plus récentes ont montré que l'homéostasie des cellules souches mésenchymateuses dentaire dans incisives de souris est réglementée par les nerfs sensoriels via la sécrétion de sonic hedgehog (Shh) ^21. Néanmoins, le rôle de l'innervation de la dent initiation, le développement et la régénération est encore très controversée chez les mammifères ^{22 - 24.}

Une pléthore d'études in vivo ont fourni des informations importantes sur les motifs de l'innervation des tissus dentaires au cours des processus de développement et de réparation de divers modèles animaux ^13,25,26. Cependant, la plupart de ces Approdes maux ne sont pas optimales pour mettre en évidence la base moléculaire des interactions entre les fibres nerveuses et les organes et tissus cibles. Co-cultures constituent une méthode utile pour étudier et manipuler les interactions entre les fibres nerveuses et des dents dans un environnement contrôlé et isolé ^{de 26 à 29.} Dans le même temps, la co-culture est soumise à diverses adaptations techniques. Par exemple, les nerfs et les tissus dentaires spécifiques (par exemple, la pulpe dentaire, follicule dentaire, l'épithélium dentaire) nécessitent souvent différents milieux de culture afin de garantir la survie des tissus pendant de longues périodes de temps ^30-32.

Dans les dernières décennies, les co-cultures conventionnelles utilisant le même milieu de culture ont été effectués pour des périodes très courtes (par exemple, deux jours) pour étudier les effets attractives ou répulsives de développer des tissus buccaux et dentaires sur les fibres nerveuses sensorielles ^27-29.Cependant, l'extension de la période de culture est nécessaire pour étudier les effets de l'innervation sur la morphogenèse de la dent et cytodifférenciation, et d'étudier la dynamique de fibres nerveuses de branchement dans les organes cibles. Par conséquent, les co-cultures non-contigus serait plus approprié de réaliser des études sur des tissus interactions neuronales-dentaire.

systèmes microfluidiques permettent des co-cultures de neurones et de différents types de cellules dans leur milieu de culture approprié. Dans ces dispositifs, les tissus dentaires et les neurones sont séparés dans des compartiments différents, tout en permettant la croissance des axones dans les corps cellulaires neuronaux à travers des microcanaux vers le compartiment contenant leur tissu cible ^33. Les dispositifs microfluidiques ont déjà été utilisées pour étudier les interactions entre les neurones et les microglies ^34,35, ainsi que des cellules à des interactions cellulaires dans le cancer et la néovascularisation ^35. En outre, ces systèmes ont été utilisés pour étudier les interactions entre dorsal ganglions de la racine et les ostéoblastes ^36.

Nous avons démontré récemment que les ganglions de Gasser (TG) et les dents sont capables de survivre pendant de longues périodes de temps en cas de co-cultivées dans des dispositifs microfluidiques ^37. De plus, nous avons démontré que les dents de différents stades de développement de maintenir dans ces conditions in vitro les mêmes effets répulsifs ou attractifs sur innervation trijumeau qu'ils montrent in vivo ^37. Ce protocole fournit des informations sur un moyen simple, puissant et flexible de co-culture ganglions / nerfs et les tissus cibles et d'étudier les rôles des molécules spécifiques sur ces interactions dans un environnement contrôlé et isolé.

Protocole

Toutes les souris ont été maintenues et gérées selon la loi sur la protection des animaux en Suisse et en conformité avec les règlements de l'office vétérinaire cantonal, Zurich.

1. Préparation de dissection Matériau, Culture Media, dispositifs microfluidiques

1. Forceps autoclave micro-dissection et ciseaux (121 ° C, le temps de stérilisation: 20 min) et de les stocker dans un récipient stérile.
2. Stériliser lamelles de verre (24 mm x 24 mm) en les incubant dans HCl 1 M pendant 24 heures sur un agitateur orbital à 37 ° C. Laver trois fois avec eux stérile, H ₂ O distillée et trois fois avec de l'éthanol à 99%. Sec, puis les lamelles à 37 ° C ou sous une hotte à flux stérile. Enfin, l'autoclave ou exposer les lamelles à la lumière UV (30 min) pour compléter la stérilisation. Lamelles peuvent ensuite être stockés dans de l'éthanol 70%.
3. Retirer soigneusement l'isolement périphériques AXIS Axon du package à l'aide de pinces stériles et les placer dans une boîte de Pétri stérile.
4. En utilisant une biopsie poinçon stérile (ø: 1mm) créer un trou par échantillon pour être cultivées (figure 1) en correspondance des chambres de culture.
   NOTE: Ne perforer trop près des microsillons, car ils pourraient être endommagés par la pression appliquée.
5. Stériliser les Dispositifs d'isolement AXIS Axon en les immergeant dans de l'éthanol 70%. Sèches puis AXIS Axon Dispositifs d'isolement et lamelles complètement sous une hotte à flux stérile. Attendre un minimum de 3 heures avant de procéder.
   NOTE: séchage incomplet entraînera l'assemblage défectueux des dispositifs microfluidiques.
6. Placez chaque lamelle dans une boîte de Pétri de 35 mm ou dans un puits dans une plaque à 6 puits.
7. Placez le périphérique Isolation AXIS Axon sur la lamelle et appuyez doucement mais fermement avec une pince à bouts recourbés afin de permettre la pleine adhésion entre le dispositif d'isolement et de la lamelle de verre.
8. Dans chaque chambre de culture, H ₂ pipette 150 ul de poly-D-lysine (0,1 mg / ml dans stérile distillée,O). Placez les dispositifs microfluidiques sous vide pendant 5 minutes, afin d'éliminer tout l'air des chambres de culture.
9. Si de l'air peut encore être vu dans les chambres, re-pipette la solution de poly-D-lysine dans les chambres.
10. Incuber les appareils avec O poly-D-lysine / N à 37 ° C.
11. Laver les chambres à trois temps avec stérile, H ₂ O. distillée
12. Remplissez chambres avec 150 ul solution de travail laminine (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml, dans du PBS ou un milieu sans sérum), et incuber O / N à 37 ° C.
13. Préparer 50 ml de milieu pour les cultures de ganglions de Gasser ^37, composé comme suit: 48 ml Neurobasal moyenne, 1 ml B-27, 100 U / ml de pénicilline / streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 5 ng / ml de facteur de croissance des nerfs (NGF) , 12:25 cytosine arabinoside.
14. Préparer 50 ml de milieu pour les cultures dent germinales ^37, composé comme suit: 40 ml de DMEM-F12, 10 ml de sérum fœtal bovin (FBS, concentration finale: 20%), 100 U / ml de pénicilline / streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 150 ug / ml d'acide ascorbique.

2. Génération d'embryon de souris et Dissection

1. Déterminer l'âge embryonnaire selon bouchon vaginal (bouchon vaginal: jour de développement embryonnaire 0,5, 0,5 ME) et le confirmer par l'intermédiaire des critères morphologiques. Pour ce protocole, nous utilisons généralement des embryons de souris E14.5-E17.5.
2. Nettoyer la zone de dissection et le stéréoscope avec de l'éthanol 70%.
3. Sacrifiez la mère enceinte par dislocation cervicale. Bloquer le col de la souris avec la première et la deuxième doigt sur une grille, et tirez avec la décision de la queue.
4. Disséquer la peau autour de l'abdomen inférieur, et d'ouvrir l'abdomen avec des ciseaux. Situer l'utérus: au cours de ces derniers stades de la grossesse, l'utérus remplir abondamment la cavité abdominale.
5. Disséquer l'utérus et le placer dans un tube rempli de PBS sur la glace. Lorsque sur la glace, le tissu peut être laissé pour plusieurs heures. Jeter le cadavre de la mère selon les directives institutionnelles
6. disséquer les embryons de l'utérus et de les libérer de leurs tissus extra-embryonnaires. Placez les embryons dans PBS sur la glace.
7. Décapiter les embryons avec des ciseaux, et séparer la mâchoire inférieure du reste de la tête avec des ciseaux micro-dissection (figure 2A). Retirer précisément la mâchoire inférieure, sans endommager les ganglions de Gasser; comme celles-ci sont localisées à proximité immédiate de la mâchoire inférieure, leur endommagement accidentel est possible. Préserver la mâchoire inférieure et le reste de la tête dans du PBS froid, sur la glace.
8. Pour disséquer TG, prendre la tête et placez-le sur une boîte de Pétri en verre de dissection, préalablement rempli avec du PBS froid. Utilisation de la pince, enlever la peau et le crâne. Retirer ensuite le télencéphale et le cervelet en plaçant une pince ci-dessous le télencéphale et un ascenseur; le télencéphale et au cervelet se retourner, en laissant la partie inférieure du crâne exposé.
9. Localiser le ganglion trijumeau (représenté sur la figure 2B). Utilisez la pincepour séparer la TG des nerfs trijumeau. Éliminer les restes de les projections du trijumeau utilisant les aiguilles de dissection comme couteaux. Placez le TG disséqué dans une boîte de Pétri remplie de PBS froid et de les garder sur la glace.
10. Pour disséquer dents embryonnaires, placer la mâchoire inférieure, préalablement séparée du crâne, sur le verre de dissection boîte de Pétri, rempli avec du PBS froid. En utilisant des aiguilles de dissection comme couteaux, retirez la langue et la peau entourant la mâchoire. Séparer l'hémi-mâchoires gauche et droite en coupant le long de la ligne médiane de la mâchoire. Les germes dentaires sont facilement accessibles, comme le montre la figure 1C. Isoler les germes dentaires en utilisant des aiguilles de dissection et éliminer l'excès de tissus non-dentaires. Placez les germes dentaires disséqués dans une boîte de Pétri remplie de PBS froid et de les garder sur la glace.

3. microfluidiques Co-cultures

1. Après dissection, retirez la laminine des dispositifs microfluidiques. Remplir les chambres avec 200 ul de la respective médias.
2. Avec des pinces, transférer doucement les germes TG et dents disséqués dans les trous créés par poinçonnage (figure 1D). Assurez-vous que les germes dentaires ne flottent pas et qu'ils coulent jusqu'à ce qu'ils touchent les lamelles.
3. Culture des échantillons dans l'incubateur à 37 ° C, 5% CO _2.
4. Changer le milieu de culture toutes les 48 heures. Ne pas vider les chambres complètement, et ne pas pipeter directement dans les chambres de culture. Vidange complète de chambres se traduirait par la formation de bulles d'air à l'intérieur des chambres; pipetage directe dans la chambre de causer des dommages axonale. Pour éviter ces problèmes, éliminer le milieu pointant la pipette vers le côté externe des puits; de même, la pipette sur du milieu frais du côté des puits situés à l'opposé des chambres.
5. Pendant la période de culture, co-cultures peuvent être facilement visualisés par microscopie time-lapse. Co-cultures peuvent être maintenues pendant plus de 10 jours.
6. Après la pério de cultured, laver les chambres en pipetant 150 pi de PBS dans un puits par chambre, et en laissant PBS circuler à travers les chambres à trois reprises.
7. Retirez le PBS et fixer les échantillons par pipetage 150 pi de paraformaldéhyde 4% (dans du PBS) dans un puits par chambre; incuber à température ambiante pendant 15 min.
8. Laver les chambres deux fois avec PBS comme décrit dans 3.6.
9. Procéder à une analyse plus approfondie.

Résultats

Ces résultats montrent que les ganglions trigéminés isolés peuvent se développer dans un compartiment du dispositif microfluidique et, en outre, que le développement des germes dentaires isolées est maintenue pendant une longue période de temps dans l'autre compartiment du dispositif microfluidique. Des milieux de culture différents sont utilisés dans les deux compartiments, et les micro-rainures entre les deux compartiments permettre l'extension de l'axone du ganglion trijumeau vers les germes den...

Discussion

Précédente dans des études in vitro de la dent innervation étaient basées sur des co-cultures conventionnelles de ganglions de Gasser et les tissus dentaires ou des cellules ^26,28,29. Ces études ont été menées pour étudier principalement les effets attractifs de ces cellules ou de tissus sur axones sensoriels ^38. Bien amener des avancées significatives dans le domaine, plusieurs questions techniques ont été soulevées. germes de dents commencent à dégénérer après...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033