Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura

Resumo

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Resumo

Inervação desempenha um papel chave no desenvolvimento, homeostase e regeneração de órgãos e tecidos. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses fenômenos não são bem compreendidas ainda. Em particular, o papel de inervação no desenvolvimento e regeneração de dente é negligenciado.

Vários estudos in vivo têm fornecido informações importantes sobre os padrões de inervação dos tecidos dentários durante os processos de vários modelos animais de desenvolvimento e reparação. No entanto, a maioria destas abordagens não são ideais para destacar a base molecular das interacções entre as fibras nervosas e os órgãos e tecidos alvo.

Co-culturas constituem um método valioso para estudar e manipular as interacções entre as fibras nervosas e os dentes num ambiente controlado e isolado. Nas últimas décadas, co-culturas convencionais, utilizando o mesmo meio de cultura foram efectuadas por períodos muito curtos (por exemplo, dois dias)investigar os efeitos atractivas ou repulsivas de desenvolvimento de tecidos orais e dentais em fibras nervosas sensoriais. No entanto, a extensão do período de cultura é necessária para investigar os efeitos da inervação sobre a morfogénese do dente e citodiferenciação.

Sistemas microfluidicos permitir co-culturas de neurónios e diferentes tipos de células no seu meio de cultura apropriado. Nós demonstramos recentemente que gânglios trigeminais (TG) e os dentes são capazes de sobreviver durante um longo período de tempo quando co-cultivadas em microcanais, e que eles se mantêm em estas condições o mesmo padrão de inervação que mostram in vivo.

Nesta base, nós descrevemos como isolar e co-cultura em desenvolvimento e dos gânglios trigêmeo germes dentários em um protocolo de co-cultura microfluídicos system.This descreve uma forma simples e flexível para co-cultura gânglios / nervos e tecidos-alvo e para estudar os papéis moléculas de específicas sobre estas interacções em um controlled e ambiente isolado.

Introdução

Inervação desempenha um papel chave no desenvolvimento, homeostase e regeneração de órgãos e tecidos ^1,2. Além disso, a inervação está envolvido na regulação da proliferação de células estaminais, diferenciação e mobilização ^3-5. Com efeito, estudos recentes realizados em tecidos do complexo orofacial têm mostrado que os nervos parassimpáticos são necessários para a função de células progenitoras epiteliais durante o desenvolvimento e regeneração das glândulas salivares ^6,7. Da mesma forma, foi demonstrado que a inervação é necessário para o desenvolvimento e manutenção de paladar ^8-11. Assim, é importante analisar as funções ainda negligenciadas de inervação no desenvolvimento de outros órgãos e tecidos orofaciais importantes, tais como os dentes.

Apesar da rica inervação dos dentes adultos, e em contraste com todos os outros órgãos e tecidos do corpo, desendentes de ping começar a ser inervados nas primeiras fases pós-natais. Os dentes se desenvolvem como resultado de interações seqüenciais e recíprocas entre o ectoderma oral e cranial mesênquima derivado da crista neural. Estas interacções dar origem ao derivado ameloblastos-epiteliais e mesenquimais derivadas de odontoblastos que são responsáveis ​​pela formação do esmalte e dentina, respectivamente ^12. Nervos sensoriais do gânglio trigeminal e nervos simpáticos do gânglio cervical superior inervam os dentes adulto ^13-15. Durante a embriogênese, fibras nervosas que emana do projeto gânglios trigeminal para os germes dentários em desenvolvimento e, progressivamente, cercá-los, mas eles não penetram no mesênquima papila dentária ^13. As fibras nervosas entrar no mesênquima polpa dental em estágios mais avançados de desenvolvimento que se correlacionam com diferenciação de odontoblastos e matriz dentinária deposição ^16. Inervação polpa dentária é complETED logo após a erupção dos dentes na cavidade oral ^13. Estudos anteriores revelaram que vários semaforinas e neurotrofinas estão envolvidos na regulação da inervação durante odontogenesis ^16-19. Estudos anteriores demonstraram claramente que a inervação é um pré-requisito para a formação dos dentes em peixes ^20. Estudos mais recentes têm mostrado que a homeostase das células-tronco mesenquimais dentária em incisivos de rato é regulada por nervos sensoriais através da secreção de sonic hedgehog (Shh) ^21. No entanto, o papel da inervação em dente de iniciação, desenvolvimento e regeneração ainda é altamente controversa em mamíferos ^22-24.

Uma infinidade de estudos in vivo têm fornecido informações importantes sobre os padrões de inervação dos tecidos dentários durante os processos de vários modelos animais ^13,25,26 desenvolvimento e reparação. No entanto, a maioria destes Approdores não são ideais para destacar a base molecular das interacções entre as fibras nervosas e os órgãos e tecidos alvo. Co-culturas constituem um método valioso para estudar e manipular as interacções entre as fibras nervosas e os dentes num ambiente controlado e isolado ^26-29. Ao mesmo tempo, a co-cultura é sujeita a várias adaptações técnicas. Por exemplo, nervos e tecidos dentais específicos (por exemplo, polpa dentária, folículo dental, epitélio dental) muitas vezes requerem diferentes meios de cultura, a fim de garantir a sobrevivência do tecido por longos períodos de tempo de ^30-32.

Nas últimas décadas, co-culturas convencionais, utilizando o mesmo meio de cultura foram efectuadas por períodos muito curtos (por exemplo, dois dias) para investigar os efeitos atractivas ou repulsivas de desenvolvimento de tecidos orais e dentais em fibras nervosas sensoriais ^27-29.No entanto, a extensão do período de cultura é necessária para investigar os efeitos da inervação na morfogénese e citodiferenciação dente, e para estudar a dinâmica de fibras nervosas de ramificação dentro de órgãos alvo. Portanto, não contíguas co-culturas seria mais apropriada para realizar estudos sobre as interacções de tecidos neuronais-dentário.

Sistemas microfluidicos permitir co-culturas de neurónios e diferentes tipos de células no seu meio de cultura apropriado. Nestes dispositivos, os tecidos dentais e neurónios são separados em diferentes compartimentos, permitindo que o crescimento dos axónios dos corpos celulares neuronais através de microcanais para o compartimento que contém o seu tecido alvo ^33. Microcanais têm já sido usadas para estudar as interacções entre neurónios e microglia ^34,35, bem como de células para as interacções das células no cancro e neovascularização ^35. Além disso, estes sistemas têm sido usados ​​para estudar as interacções entre dorsal gânglios da raiz e osteoblastos ^36.

Nós demonstramos recentemente que gânglios trigeminais (TG) e os dentes são capazes de sobreviver durante longos períodos de tempo quando co-cultivadas em microcanais ^37. Além disso, demonstrámos que os dentes de diferentes estádios de desenvolvimento em manter estas condições in vitro, os mesmos efeitos repulsivos ou atractivos da inervação do trigémio que mostram in vivo ^37. Este protocolo fornece informações sobre uma maneira simples, poderosa e flexível para co-cultura gânglios / nervos e tecidos-alvo e para estudar os papéis de moléculas específicas sobre tais interações em um ambiente controlado e isolado.

Protocolo

Todos os ratos foram mantidos e tratados de acordo com a Lei de Bem-estar animal suíço e em conformidade com os regulamentos do escritório Cantonal Veterinária, Zurique.

1. Preparação da dissecção Material, Meios de Cultura, microfluídicos

1. Autoclave pinças micro-dissecção e tesouras (121 ° C, o tempo de esterilização: 20 min) e armazená-los em um recipiente estéril.
2. Esterilizar lamelas de vidro (24 mm x 24 mm), incubando-as em HCl 1 M durante 24 h num agitador orbital a 37 ° C. Lavar três vezes com estéril, _H2O destilada e três vezes com etanol a 99%. A seco seguida as lamelas a 37 ° C ou sob câmara de fluxo estéril. Finalmente, autoclave ou expor as lamelas a luz UV (30 min) para completar a esterilização. As lamelas podem então ser armazenados em etanol a 70%.
3. Remova cuidadosamente os dispositivos de isolamento AXIS Axon do pacote usando uma pinça estéril e colocá-los em uma placa de Petri estéril.
4. Usando uma biópsia estéril (o: 1 mm) criar um buraco por amostra a ser cultivadas (Figura 1), em correspondência com as câmaras de cultura.
   NOTA: Não perfurar demasiado perto das estrias, pois eles podem ser danificados pela pressão aplicada.
5. Esterilizar os dispositivos de isolamento AXIS Axon por imergindo-los em etanol a 70%. Seca, então AXIS Axon dispositivos de isolamento e lamelas completamente sob uma capela de fluxo estéril. Espere um mínimo de 3 horas antes de prosseguir.
   NOTA: secagem incompleta resultará em conjunto com defeito de dispositivos microfluídicos.
6. Colocar em cada lamela de 35 mm numa caixa de Petri ou num poço numa placa de 6 poços.
7. Coloque o dispositivo de isolamento AXIS Axon na lamela e pressione delicadamente mas com firmeza com uma pinça com extremidades dobradas a fim de permitir a adesão completa entre o dispositivo de isolamento ea lamela de vidro.
8. Em cada câmara de cultura, pipeta 150 uL de poli-D-lisina (0,1 mg / ml em estéril, destilada H ₂O). Colocar os dispositivos de microfluidos sob vácuo durante 5 minutos, a fim de remover todo o ar das câmaras de cultura.
9. Se o ar ainda pode ser visto dentro das câmaras, re-pipeta a solução de poli-D lisina para as câmaras.
10. Incubar os dispositivos com poli-D-lisina O / N a 37 ° C.
11. Lavar três vezes com câmaras estéreis, _H2O destilada
12. Encha as câmaras com 150 ul de solução de trabalho laminina (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml, em PBS ou meio isento de soro), e incubar O / N a 37 ° C.
13. Preparar 50 ml de meio de culturas de gânglios do trigémeo ^37, composto como se segue: 48 ml de meio Neurobasal, 1 ml de B-27, 100 U de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, fator / ml de penicilina / 5 ng / mL de crescimento do nervo (NGF) , 12:25 citosina arabinósido.
14. Preparar 50 ml de meio de culturas de germe de dente ^37, a seguinte composição: 40 ml de DMEM-F12, 10 ml de soro fetal bovino (FBS, concentração final: 20%), 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 150 ug / ml de ácido ascórbico.

2. mouse Embryo Geração e Dissection

1. Determinar a idade embrionária de acordo com plugue vaginal (plug vaginal: dia embrionária de desenvolvimento 0.5, E0.5) e confirmá-la através de critérios morfológicos. Para este protocolo, geralmente usamos embriões E14.5-E17.5 rato.
2. Limpe a área de dissecção eo estereoscópio com etanol 70%.
3. Sacrifique a mãe grávida via deslocamento cervical. Bloquear o pescoço do rato com o primeiro e segundo dedo dentro de uma grade, e puxar com a decisão da cauda.
4. Dissecar a pele ao redor do abdômen inferior, e abrir o abdômen com uma tesoura. Localize o útero: durante estas fases tardias da gravidez, o útero abundantemente encher a cavidade abdominal.
5. Dissecar o útero e coloque em um tubo cheio de PBS em gelo. Quando em gelo, o tecido pode ser deixado para várias horas. Descarte o cadáver da mãe de acordo com as diretrizes institucionais
6. Dissecar os embriões do útero e libertá-los de seus tecidos extra-embrionário. Coloque os embriões em PBS em gelo.
7. Decapitar os embriões utilizando uma tesoura, e separar o maxilar inferior do resto da cabeça com uma tesoura de micro-dissecção (Figura 2A). Remover precisamente o maxilar inferior, sem danificar o gânglio trigeminal; em que esta última está localizada na proximidade da mandíbula inferior, o seu dano acidental é possível. Preservar a mandíbula e o resto da cabeça em PBS frio, em gelo.
8. Para dissecar TG, pegue a cabeça e colocá-lo em uma placa de Petri de vidro dissecação, anteriormente preenchido com PBS frio. Usando fórceps, remover a pele e o crânio. Remove então o telencéfalo e ao cerebelo, colocando uma pinça abaixo do telencéfalo e elevador; do telencéfalo e ao cerebelo vai virar em conjunto, deixando a parte inferior da cabeça exposta.
9. Localizar o gânglio trigeminal (mostrado na Figura 2B). Use a pinçapara separar o TG a partir dos nervos trigeminais. Elimine os restos das projeções do trigêmeo utilizando as agulhas de dissecação como facas. Inserir o TG dissecados numa caixa de Petri cheio com PBS frio e mantê-los em gelo.
10. Para dissecar dentes embrionárias, coloque a mandíbula inferior, previamente separado do crânio, sobre o vidro dissecção placa de Petri, cheio de frio PBS. Usando agulhas de dissecação como facas, retirar a língua ea pele ao redor da mandíbula. Separa-se o hemi-mandíbulas esquerdo e direito através do corte ao longo da linha média da mandíbula. Os germes dentários são facilmente visíveis, como mostrado na Figura 1C. Isolar os germes dentários utilizando agulhas de dissecação e remover o excesso de tecidos não dentais. Coloque os germes dentários dissecados em uma placa de Petri preenchido com PBS frio e mantê-los no gelo.

3. microfluídicos Co-culturas

1. Após a dissecção, remova laminina a partir dos dispositivos microfluídicos. Encha as câmaras com 200 ul da respective mídia.
2. Com uma pinça, transferir suavemente os TG e dente germes dissecados nos orifícios criados por perfuração (Figura 1D). Certifique-se de que os germes dentários não flutuam e que eles afundam até que entre em contato com as lamelas.
3. Cultura as amostras em estufa a 37 ° C, 5% de CO _2.
4. Alterar o meio de cultura a cada 48 horas. Não esvaziar as câmaras completamente, e não pipetar diretamente para as câmaras de cultura. O esvaziamento completo de câmaras que resultam na formação de bolhas de ar no interior das câmaras; pipetagem direto para a câmara iria resultar em lesão axonal. Para evitar estes problemas, o meio de remover a pipeta apontando para o lado externo das cavidades; Do mesmo modo, pipetar o meio fresco no lado das cavidades localizadas de frente para as câmaras.
5. Durante o período de cultura, co-culturas podem ser facilmente visualizados por microscopia de lapso de tempo. Co-culturas pode ser mantida por mais de 10 dias.
6. Após a cultura period, lavar as câmaras por pipetagem de 150 ul de PBS por poço para uma câmara, e permitindo PBS fluir através das câmaras de três vezes.
7. Remover o PBS e fixar as amostras por pipetagem de 150 uL de paraformaldeído a 4% (em PBS) por poço em uma câmara; incubar à TA durante 15 min.
8. Lavam-se as câmaras duas vezes com PBS como descrito em 3.6.
9. Avançar com a análise.

Resultados

Estes resultados mostram que os gânglios do trigémeo isoladas podem crescer num compartimento do dispositivo de microfluidos e, além disso, que o desenvolvimento das bactérias isoladas de dentes é mantida por um longo período de tempo no outro compartimento do dispositivo de microfluidos. Diferentes meios de cultura são usados ​​nos dois compartimentos, e as micro-ranhuras entre os dois compartimentos de permitir a extensão do axónio do gânglio trigeminal no sentido de os germes de dentes em desenvolviment...

Discussão

Anterior estudos in vitro de inervação do dente foram baseados em co-culturas convencionais de gânglios do trigémeo e tecidos dentais ou células ^26,28,29. Estes estudos foram conduzidos para investigar principalmente os efeitos atraentes dessas células ou tecidos em axônios sensitivos ^38. Apesar de trazer avanços significativos no campo, várias questões técnicas foram levantadas. Germes dentários começar a degenerar após alguns dias de cultura ^37. Com base nessas o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033