JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Özet

Zebra balığı Zebra balığı, enerji homeostazı ve obezite çalışma için yaygın olarak uygulanan bir model yapmak potansiyeline sahip doğal avantajları ile önemli bir model organizma vardır. Embriyolardaki deneyler, 96 veya 384 oyuklu plaka formatmda gerçekleştirilir edilmesi için zebrabalıkları küçük boyutu sağlar Morfolino ve CRISPR tabanlı teknolojiler banyo uygulaması tarafından genetik manipülasyon kolaylığı ve ilaç tedavisi iyileştiren yaşayabilir olduğunu. Ayrıca, Zebra balığı roman gen keşfi için izin ileri genetik ekranlar için idealdir. Obezite için bir model olarak zebrafish göreceli yenilik göz önüne alındığında, tam bu faydaları istismar araçları geliştirmek için gereklidir. Burada, aynı zamanda embriyonik zebrafish binlerce enerji harcanmasını ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz, bireysel balık izole etmek için, 96 gözlü levhalar kullanan bir bütün hayvan mikroplaka platformu geliştirdik ve ticari olarak temin edilebilen hücre kültürü canlılığı yeniden hesaplanan toplam NADH 2 üretimini değerlendirmekAjan AlamarBIue. Poikilotherms NADH 2 üretim ve enerji tüketimi arasındaki ilişki sıkıca bağlanır. Bu enerji harcaması tahlil hızla doğrudan enerji tüketimini değiştirmek veya uygulamalı ilaç (örn insülin duyarlılığını) yanıtı değiştirebilir farmakolojik veya genetik manipülasyonlar taramak için potansiyel oluşturur.

Giriş

Fare şu anda obezite araştırmaları için baskın modeldir. Kısa nesil aralığı ve fare kullanılabilir genetik araçları bugüne kadar eşsiz olmuştur. Ancak, Zebra balığı da kısa bir nesil aralığı vardır (3-4 ay) ve genetik manipülasyon 1,2 kolaylığı hatta fare geçti. Kadar genetik ve ilaç ekranlar 3 kullanım için yavruları ve potansiyeli sayıda fare üzerinde gerçekleşmiştir zebra balığı memeli genlerinin yaklaşık% 90 tutar.

Obezitede çalışmalar için zebrabalıkları modelinin potansiyelini, tahliller enerji harcaması da dahil olmak üzere vücut ağırlığı regülasyonu, etkileyen faktörleri araştırmak amacıyla geliştirilmesi gerekmektedir. Metabolitler β-oksidasyon ve trikarboksilik asit döngüsü oksijenle işlenir zamanda tüketilir ve NADH 2 üretilir. Bu nedenle, NADH 2 metabolik yolların (metabolit oksidasyonu) ile metabolitlerin akış doğrudan bir göstergesidir. Poikil olarakhomotermlere 4 5'ten kat daha düşük - otherms, H +, ATP sentezi gelen NADH 2 oksitlenmeyi koparan 4'tür iç mitokondrial membran aracılığıyla kaçak. Bu duruma göre, zebra balığı NADH 2 çok sıkı bir şekilde, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimi ile bağlantılıdır. Bu yazıda, enerji harcaması 5 için bir proxy olarak larva Zebra balığı NADH 2 üretimini ölçen bir tahlil açıklar.

Oksijen tüketimi enerji tüketimini ölçmek için altın standarttır. Ancak, en iyi zebrafish yüksek verimlilik potansiyelinin yararlanmak, enerji harcama tahliller yüksek verimlilik için uygun olmalıdır. Sirkülasyon sistemi, kapalı bir bölme bağlıdır Oksijen tüketimi sistemleri 6 mevcuttur bölmelerin sayısına göre hacmi sınırlıdır. Açık hava O 2 tüketimi / CO2 üretim deneyleri de zebrabalıkları 5,7 uygulanmıştır. Bu açık hava 96 oyuklu levha temeld sistemleri, yüksek verim için uygun. Ne yazık ki, çevre ile gaz değişimi Bu tahlillerin duyarlılığını sınırlar. Biz son zamanlarda redoks göstergesi AlamarBIue 5 ile NADH 2 izler bir testin uygulanmasını yayınladı. Bu deney hacmi ve zebrabalıkları oksijen tüketimi analizler için ortak hassasiyetindeki sınırlamaların üstesinden gelmektedir.

Zebra balığı tüm vücut enerji homeostazı çalışmaları için giderek önemli bir model haline geliyor. Bölümünde, Zebra balığı nedeniyle ileri genetik ekranlar ve ilaç ekranlarında kullanmak için uygun. Ayrıca, demonte ve knock-in, hızlı bir şekilde uygulanabilir dahil genetik manipülasyon hedef aldı. Daha önce bu deney bileşikleri ve metabolik oranı 5 değiştiren genleri tanımlamak için banyo ilaç uygulaması ve genetik devirme veya nakavt ile kombine edilebilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bu deney zebrabalıkları doğasında yüksek kapasiteli avantajları yararlanmak için tasarlanmıştır.

Protokol

Not: Bu protokol Araştırma Sorumlu Davranış Arizona Ofisi Üniversitesi kuralları takip ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır

1. Zebra balığı Islahı ve Embriyo Bakım

  1. E3 embriyo orta 8 hazırlayın. 60x stok solüsyon To Make, 1.95 L ddiH 2 O. içinde 34.8 g NaCl, 1.6 gr KCI, 5.8 g CaCl2 ● 2H 2 O ve 9.78 g MgCl2 ● 6H 2 O çözülür DdiH 2 O. kullanarak 2 L ses seviyesini ayarlama NaOH ve HCI kullanılarak 7.2 pH ayarlayın
  2. 1 L ddiH20 16,5 ml 60x stok sulandırmak, 1x E3 embriyo orta hazırlamak. 100 ul% 1 metilen mavisi ekleyin.
  3. Yetiştirme
    1. Ev Erkek ve Dişi anaç (7 - yaş 18 ay) ayrı ayrı doğurganlığı artırmak için.
    2. Yumurtalar istenen gün önce önce 2 saat - 1 ışıklarını kapatın. C - Set up çiftleşme (2 kadın 1 erkek ve 1)Rossing kafesleri, daha önce 9 nitelendirdi. Onlar yetişkin balıklar tutuldukları tank ucun delikli tabanı üzerinden geçerken yumurta predationu kaçmak için kapısı kafesleri izin verir.
    3. İsteğe bağlı. Zamanlı ıslahı için, (morfolino enjeksiyonunu içeren çalışmalar için gerekli olacak gibi), şeffaf bir plastik bölücü erkek ve kadın balık ayırmak, yumurta ve gübreleme zamanlı döşenmesi sonucu sabah bu çıkartın. Morfolino çalışmalar için, tedavi başına gereken embriyonik balık sayısını değerlendirmek için güç hesaplamaları gerçekleştirmek. Etki ya da varyasyon büyüklükte bir tahmin olmaksızın, bir ön deneme, bir n = 8 ile çalıştırılabilir.
  4. (- 150 embriyolar / 10 cm petri 100) bir petri kabına geçiş kafesten yumurta dökün. Yumurta çanak dibe ve su kapalı dökmek için izin verin. Ince uçlu atılabilir transfer pipet kullanarak kalan suyu çıkarın. Adım 1.1 yapılan E3 embriyo orta geri ekleyin.
  5. Af olunGelecekteki yumurta ve balık transferi için topal cilalı tek kullanımlık pipet. Makas kullanarak, 0.25 ml mezuniyet dereceli atılabilir bir transfer pipet kesti. Pürüzlü kenarları, alev lehçe Bunsen beki üzerinde kesik ucu kaldırın.
  6. Zebra balığı E3 embriyo orta petri 28.5 ○ C'de post-fertilizasyon 10 cm (dpf) 4 gün embriyonik balık koruyun Twice her gün, bir alev herhangi gübresiz yumurta veya ölü embriyolar (opak beyaz görünümü) kaldırmak için atılan transfer pipet mezun cilalı kullanın. Her gün bir kez, E3 embriyo orta yerine. Ince uçlu atılabilir transfer pipet kullanarak, kalan sıvıyı çıkarmak, E3 embriyo orta kapalı dökün ve önceden ısıtılmış (28.5 ○ C) E3 embriyo orta geri ekleyin.

2. Deney çözeltisi hazırlayın

  1. 0.22 uM filtre kullanılarak Tablo 1. Steril filtre deney solüsyonuna göre olan bir deney çözeltisi hazırlayın. Bir 28.5 ○ C steril tahlil çözümü, inisiyasyonu tahlil sıcak öncesindesu banyosu.
Bileşen Toplam% Cilt (ul / 10 ml)
60x E3 Embriyo Orta 1,667 166,7
Çift deiyonize (DDI) H 2 0 96,233 9623,3
Alamar Mavisi 1 100
400 mM NaOH 1 100
DMSO 0.1 10

Tablo 1. Analiz Ortamı

3. Testi gerçekleştirmek

  1. Zebra balığı embriyolar steril süzülmüş E3 embriyo orta ile 3 kez durulayın. Bir behere debriyaj tüm canlı zebrafish embriyolar birleştirin. Steril filtre 75 ml E3 embriyo orta. Ince bir ucu tek kullanımlık transfer pipet kullanarak yenidenmümkün olduğunca Zebra balığı embriyolarının gelen E3 embriyo orta kadar hareket ettirin. 20 ml steril süzülmüş E3 embriyo orta geri ekleyin. Çıkarın ve E3 embriyo orta 3 kez değiştirin.
  2. 96-iyi siyah 93 kuyuların her birine Levha 1 balık net alt plaka taraflı. Alev plastik tek kullanımlık transfer pipet mezun cilalı içinde ayrı ayrı (1.5 adım) bir embriyo yakalama ve yavaşça kuyunun içine püskürtülmesiyle plakaya embriyonik balık aktarın. 3 boş kuyulara durulanır balık içeren beher alınan E3 embriyo orta aktarın. Bu boş kuyular balıklar içerdikleri kuyuların tam olarak aynı suya maruz kalmış olmasını sağlar. Balık ve boş kuyular içerirler Her iki kuyu, bu aşamada bitiminde (200 ul), en az ½ dolu olmalıdır.
  3. Boş kuyular da dahil olmak üzere 96 kuyu, içinde tahlil çözeltisi ile E3 embriyo orta değiştirin. Bu kademe, bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde 12 her sütun için bir seferde 1 sütun yapılmalıdır. Ince ucunu kullanarak atılabilir transfer pipet, plakanın (8 kuyu) bir sütunda her kuyudan E3 embriyo orta kaldırmak. Zebra balığı embriyo dokunmayın özen gösterin. Su çıkarıldı kuyuya her deney çözeltisi 300 ul ekle. Plaka 12 sütunlar için tahlil çözümü ile E3 embriyo orta ve değiştirme kaldırılmasını tekrarlayın.
  4. İsteğe bağlı: Bir bileşik cevaben metabolizma hızı değişikliği sınamak için, 100 kez (100X) istenen tedavi konsantrasyonu bir çözüm yapmak. Dikkat çekici bir şekilde, 100x çözeltisi,% 0.1 daha fazla nihai DMSO konsantrasyonunu sınırlandırmak için% 10 DMSO aşmamasını sağlamak. Tedavi bölümlerinin her birine 100x çözeltisi 3 ul ekleyin.
    NOT: Tedavi kuyu sayısını değerlendirmek için güç hesaplamaları gerçekleştirin. Bununla birlikte, yanıt veya varyasyonun büyüklükte bir tahmini olmadan, bir ön deneme tedavi 8 bileşiği ve balık içeren 8, araçla tedavi edilen kontrol oyuklarında çalıştırılabilir.
    1. (Kontrol hiçbir dru araç kontrolünün 3 ul ekleying tedavisi) balıklar içerdikleri kuyular. Bileşiğe fluoresan yanıt balıkta eylemlerinin bir sonucu olduğundan emin olmak için, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 3 Boş oyuklara ilaç ve araç tedavileri uygulanır.
  5. 590 nM'de 530 nM uyarma dalga boyunda ve emisyon dalga boyu ile floresan plaka okuyucusu üzerinde balık dolu plaka okuyun.
  6. Nemlendirilmiş inkübatör içine yerleştirin plakası 28.5 ○ C (tahlil çözeltinin photobleaching önlemek için tahlil boyunca karanlıkta plaka korumak) olarak ayarlanır. Deney 1 saat ila 24 saat arasında değişir zaman süreleri için çalıştırılabilir. Deneyin süresi çalışmanın amacı bağlıdır. Bir kısa süreli en uygun olabilecek bir kısa etkili olmayan kararlı bir bileşik yanıtı test için. Yine, stabil bir bileşik testleri veya genetik etkileri testleri için, deney süresi maksimize kümülatif sinyali ile ilgili avantajlar yararlanmak için tercih edilir.
  7. Önceden belirlenmiş bir zaman noktasında (zamanlama belirlemenize yardımcı olması için 3.6 adıma bakınız)adım 3.5 ile aynı ayarlarla tekrar balık dolu plaka floresan okuyun.

4. Tedavi ile Floresans İlişkili Bağıl Değişim değerlendirin

  1. De çalışma sonucunda floresan zaman 0 floresan çıkarılarak her floresan değişimi hesaplanır. Balık (boşluklar) olmadan Wells balıklar içerdikleri kuyulardan uzak değerlerinin altında, 0'a yakın değerlere sahip olmalıdır.
    Sonuca Floresans = Floresan değişim - Floresan 0 zamanında
  2. Kontrol Kaynaklar akabinde kontrol kuyularının floresan ortalama değişiklik ile her çukurun fluoresans değişikliği bölmek için floresans nispi değişikliği tespit etmek için, floresans ortalama değişimi hesaplamak. Unutmayın ki, kontroller, araç kontrolleri veya genetik kontrolleri ya olabilir.
    figure-protocol-7586

Sonuçlar

Deney çözeltisi embriyonik balık (Şekil 1) yokluğunda floresansında bir artış meydana gelmez. Ancak, tahlil kuyunun içinde metabolizma hızı küçük değişikliklere karşı çok duyarlıdır. Bir kuyunun içinde bir tek balık 1 saat (p <0.0001) içinde boş kuyulardan önemli ölçüde farklı bir sinyal oluşturur. 2 kuluçkadan 24 saat sonra embriyonik balıklar tarafından üretilen sinyallerin görsel temsilini sağlar Şekil. Bu resmin amacı için ...

Tartışmalar

Bakteri veya mantar ile kontaminasyon büyük ölçüde bu testin uygulanmasını sınırlayacaktır. E3 embriyo orta metilen mavisi fungal bulaşma olasılığını sınırlandırır. Embriyo boyunca bu bakım iki kez her gün ölü embriyolar kaldırmak için alınması çok önemlidir yetiştirme. Buna ek olarak, iyice deney başlatma gün steril E3 embriyo ortamı ile embriyolar durulanması gereklidir. Bu 2 adım embriyoların bakteriyel kontaminasyon potansiyelini sınırlar. Aşama 3.2 'de tarif edilen Boş o...

Açıklamalar

The authors have no competing financial interests to disclose.

Teşekkürler

The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AlamarBlueFisher Scientific10-230-103Manufactured by Thermo Scientific
Fine Tip DisposableTransfer PipetteFisher Scientific13-711-26Manufactured by Thermo Scientific
Fisherbrand Graduated Disposable Transfer PipetteFisher Scientific13-771-9AMManufactured by Thermo Scientific
Black sided clear bottom 96-well platesFisher Scientific50-320-785Manufactured by E&K Scientific Products Inc.

Referanslar

  1. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
  2. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  4. Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
  5. Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
  6. Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
  7. Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
  8. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53, 161-168 (2012).
  9. Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish, A practical approach. , (2002).
  10. Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
  11. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
  12. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
  13. Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
  14. Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
  15. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
  16. Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler BiyolojiSay 107Enerji HarcamasOksijen T ketimiDanio rerioZebra balDrug DiscoveryY ksek verimObeziteMetabolik Sendrom

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır