High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Riepilogo

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH₂ sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Abstract

Zebrafish sono un importante organismo modello con vantaggi inerenti che hanno il potenziale per fare zebrafish un modello ampiamente utilizzato per lo studio della omeostasi energetica e obesità. Le piccole dimensioni di zebrafish permette di saggi sugli embrioni da condurre in un formato piatto 96- o 384 pozzetti, tecnologie Morpholino e CRISPR basate promuovere la facilità di manipolazione genetica, e il trattamento farmacologico per applicazione bagno è praticabile. Inoltre, zebrafish sono ideali per schermi genetici a termine che consentono di scoperta del gene romanzo. Data la relativa novità di zebrafish come modello per l'obesità, è necessario sviluppare strumenti che sfruttino appieno questi benefici. Qui, si descrive un metodo per misurare il dispendio energetico in migliaia di zebrafish embrioni contemporaneamente. Abbiamo sviluppato una piattaforma completamente microplacca animale in cui usiamo piastre a 96 pozzetti per isolare singoli pesci e noi valutare cumulativo NADH ₂ produzione utilizzando il disponibile in commercio coltura cellulare vitalità reagente alamarBlue. Nel poichilotermi il rapporto tra NADH ₂ produzione e la spesa energetica è strettamente legata. Questo test dispendio energetico crea il potenziale per lo screening rapido manipolazioni farmacologiche o genetiche che alterano direttamente la spesa energetica o alterano la risposta ad un farmaco applicato (ad esempio sensibilizzatori dell'insulina).

Introduzione

Il mouse è attualmente il modello predominante per la ricerca di obesità. L'intervallo breve generazione e strumenti genetiche disponibili nel topo sono stati fino ad oggi senza pari. Tuttavia, il pesce zebra ha anche un intervallo di generazione breve (3 - 4 mesi) e supera anche il mouse in facilità di manipolazione genetica ^1,2. Il pesce zebra mantiene quasi il 90% dei geni dei mammiferi, mentre di gran lunga superiore il mouse in numero di figli e il potenziale per l'uso in schermi genetici e droga ^3.

Per sfruttare il potenziale del modello di zebrafish per gli studi in obesità, le analisi devono essere sviluppati per indagare i fattori che influenzano il corpo regolazione del peso, comprese le spese di energia. Come metaboliti vengono elaborati tramite β-ossidazione e l'ossigeno ciclo degli acidi tricarbossilici viene consumato e NADH ₂ viene prodotto. Così, NADH _{2 è} un indicatore diretto del flusso di metaboliti attraverso vie metaboliche (metabolita ossidazione). In poikilotherms, H ⁺ perdite attraverso la membrana mitocondriale interna, che disaccoppia NADH ₂ ossidazione dalla sintesi di ATP, è 4 - 5 volte inferiore negli esseri omeotermi ^4. Di conseguenza, in NADH zebrafish _{2 è} molto strettamente legata alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Qui, descriviamo un metodo che misura NADH ₂ produzione nel zebrafish larvale come proxy per dispendio energetico ^5.

Il consumo di ossigeno è il gold standard per la misurazione della spesa energetica. Tuttavia, per sfruttare al meglio l'elevato potenziale rendimento del zebrafish, saggi di dispendio energetico devono essere suscettibili di high-throughput. Sistemi di consumo di ossigeno che dipendono da una camera chiusa sistema di circolazione sono limitati nella velocità per il numero di camere disponibili ^6. Open air _consumo di O 2 / CO ₂ test di produzione è stato applicato anche nel zebrafish ^5,7. Questi all'aperto 96 pozzetti piastra di basesistemi d sono suscettibili di throughput elevato. Sfortunatamente, lo scambio di gas con l'ambiente limita sensibilità di questi test. Abbiamo recentemente pubblicato l'applicazione di un metodo che monitora NADH _{2 utilizzando} l'indicatore redox alamarBlue ^5. Questo saggio supera i limiti di produttività e sensibilità comune per analisi di consumo di ossigeno in zebrafish.

Il pesce zebra sta diventando un modello sempre più importante per gli studi di tutto omeostasi energia del corpo. In parte, perché zebrafish sono suscettibili di utilizzare schermi genetici avanti e schermi di droga. Inoltre, mirata manipolazione genetica, tra cui knockdown e knock-in, può essere applicato rapidamente. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo test può essere combinato con l'applicazione di droga bagno e atterramento genetica o knockout per identificare i composti e geni che alterano il tasso metabolico ^5. Inoltre, questo test è stato progettato per sfruttare i vantaggi di throughput elevati inerenti il ​​pesce zebra.

Protocollo

Nota: Questo protocollo segue le linee guida della University of Arizona Ufficio per una gestione responsabile della Ricerca ed è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Usa Istituzionale

1. Allevamento Zebrafish e Embryo manutenzione

1. Preparare E3 embrione media ^8. Fare 60x soluzione madre, sciogliere 34,8 g di NaCl, 1,6 g KCl, 5.8g CaCl ₂ ^● 2H _{2 O,} e 9,78 g _MgCl 2 ^● 6H _{2 O} a 1,95 L ddiH ₂ O. Regolare il pH a 7,2 con NaOH e HCl Regolare il volume a 2 L utilizzando ddiH ₂ O.
2. Per preparare 1x E3 medio embrione, diluire 16,5 ml 60x magazzino in 1 L ddiH20. Aggiungere 100 ml 1% di blu di metilene.
3. Allevamento
   1. Casa Maschio e femmina nidiata magazzino (7 - 18 mesi di età) separatamente per massimizzare la fecondità.
   2. Spegnere le luci 1-2 ore prima del giorno precedente uova sono desiderati. Impostare l'accoppiamento (1 maschio e 1 - 2 femmine) in cgabbie Rossing come precedentemente descritto ^9. Gabbie Crossing consentono per le uova di sfuggire predazione che passano attraverso la base forata dell'inserto vasca in cui i pesci adulti sono detenuti.
   3. Optional:. Per la riproduzione temporizzata, (come sarebbe necessario per gli studi che coinvolgono morfolino iniezione), separare il maschio e pesce femmina da un chiaro divisorio in plastica, Rimuovi questa mattina di provocare temporizzato deposizione delle uova e la fecondazione. Per morpholino studi, eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pesci embrionale necessaria per il trattamento. Senza una stima della dimensione dell'effetto o variazione, una prova preliminare può essere eseguito con un n = 8.
4. Versare le uova da gabbia traversata in una capsula di Petri (100 - 150 embrioni / 10 centimetri di Petri). Lasciare le uova di depositarsi sul fondo del piatto e versare l'acqua. Rimuovere eventuale acqua residua con una punta fine trasferimento monouso pipetta. Aggiungere indietro medio E3 embrione fatto in fase 1.1.
5. Fai afzoppo pipetta monouso lucido per il futuro di uova e il trasferimento del pesce. Utilizzando le forbici, tagliare una pipetta di trasferimento monouso diplomato al diploma 0,25 ml. Per rimuovere i bordi irregolari, polacco fiamma la punta taglio sopra un becco Bunsen.
6. Mantenere pesce embrionale a 4 giorni dopo la fecondazione (DPF) di 10 cm capsule di Petri in zebrafish media E3 embrione a 28,5 ^○ C. Due volte al giorno, utilizzare fiamme lucido laureato monouso pipetta di trasferimento per rimuovere eventuali uova non fecondate o embrioni morti (aspetto bianco opaco). Una volta al giorno, sostituire E3 medio embrione. Eliminare E3 medio embrione, rimuovere il liquido restante con una punta fine trasferimento monouso pipetta e aggiungere di nuovo pre-riscaldato (28,5 ^○ C) E3 medio embrione.

2. Preparare Assay Solution

1. Preparare la soluzione test secondo la Tabella 1. Soluzione saggio Filtro sterile utilizzando un filtro da 0,22 micron. Prima del dosaggio iniziazione, scaldare la soluzione test sterile in una 28,5 ^○ Cbagnomaria.

Ingrediente	% Del totale	Volume (ml / 10 ml)
60x E3 Embrione Media	1.667	166,7
Doppia deionizzata (DDI) H 2 0	96,233	9.623,3
Alamar blu	1	100
NaOH 400 mm	1	100
DMSO	0.1	10

Tabella 1. Assay Media

3. Eseguire Assay

1. Sciacquare embrioni di zebrafish 3 volte con sterile filtrata medio embrione E3. Unire tutti gli embrioni vitali zebrafish dalla frizione in un bicchiere. Filtro sterile da 75 ml E3 medio embrione. Utilizzando una punta fine trasferimento monouso pipetta, rispostare tanto del mezzo embrione E3 dagli embrioni zebrafish possibile. Aggiungere 20 ml di nuovo sterile filtrata medio embrione E3. Rimuovere e sostituire E3 medio embrione 3 volte.
2. Tavola 1 pesce in ciascuno dei 93 pozzetti di una nera 96 ​​pozzetti lati chiara piatto fondo. Trasferire il pesce embrionale alla piastra catturando individualmente un embrione all'interno di una fiamma lucido laureato plastica pipetta usa e getta (punto 1.5) e l'espulsione delicatamente nel pozzo. Trasferire E3 embrione medio tratto dal bicchiere contenente pesce risciacquati nei 3 pozzetti del bianco. Questo assicura che i pozzi vuoti sono stati esposti per la stessa acqua dei pozzi che contengono pesci. Entrambi i pozzetti che contengono pesce e pozzetti vuoti devono essere almeno a metà (200 microlitri) al termine di questa fase.
3. Sostituire E3 medio embrione con la soluzione di test in tutti i 96 pozzi, tra cui pozzetti del bianco. Questa operazione deve essere eseguita 1 colonna alla volta per ciascuna delle 12 colonne in una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando una punta fine e getta transfer pipetta, rimuovere E3 medio embrione da ciascun pozzetto in una colonna della piastra (8 pozzetti). Fare attenzione a non toccare l'embrione zebrafish. Aggiungere 300 ml di soluzione di dosaggio per ciascun pozzetto da cui l'acqua è stata rimossa. Ripetere la rimozione di E3 medio embrione e sostituzione con la soluzione test per tutte le colonne 12 della piastra.
4. Opzionale: Per testare il cambiamento di tasso metabolico in risposta ad un composto, fare una soluzione che è 100 volte (100x) la concentrazione trattamento desiderato. Di nota, assicurarsi che la soluzione 100x non supera il 10% DMSO a limitare la concentrazione finale di DMSO a non più di 0,1%. Aggiungere 3 ml di soluzione 100x a ciascuno dei pozzetti di trattamento.
   NOTA: eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pozzi di trattamento. Tuttavia, senza una stima della entità della risposta o variazione, una prova preliminare può essere eseguito in 8 compound trattata e 8 veicoli trattati pozzetti di controllo contenenti pesci.
   1. Aggiungere 3 ml di controllo del veicolo al controllo (senza drug trattamento) pozzi che contengono pesci. Per assicurare che la risposta fluorescente composto è un risultato di azioni ai pesci, applicare trattamenti farmacologici e veicoli a 3 pozzetti di bianco in una piastra da 96 pozzetti.
5. Leggi pesce piatto pieno su lettore fluorescente piatto con lunghezza d'onda di eccitazione a 530 nm e lunghezza d'onda di emissione a 590 nm.
6. Posizionare la piastra in incubatore umidificato impostata a 28,5 ^○ C (mantenere piastra al buio per tutta test per evitare photobleaching di soluzione test). Il saggio può essere eseguito per periodi di tempo che vanno da 1 ora a 24 ore. La durata del saggio dipende dallo scopo dello studio. Per testare la risposta ad una breve composto non stabile recitazione breve durata può essere più adatto. Tuttavia, per le prove di composti stabili o test di effetti genetici, massimizzando durata saggio è preferibile sfruttare i vantaggi connessi con il segnale cumulativo.
7. In un punto tempo predeterminato (vedere la fase 3.6 per aiutare a determinare i tempi)leggere la fluorescenza di piatto di pesce pieno di nuovo con le stesse impostazioni di passo 3.5.

4. Valutare la variazione relativa a fluorescenza associata al trattamento con

1. Calcolare variazione di fluorescenza di ciascun pozzetto sottraendo la fluorescenza al tempo 0 dal fluorescenza al termine dello studio. Wells senza pesce (spazi) devono avere valori prossimi a 0, ben al di sotto dei valori da pozzi che contengono pesci.
   Cambia in Fluorescenza = Fluorescenza a conclusione - Fluorescenza al tempo 0
2. Per accertare la variazione relativa di fluorescenza, calcolare la variazione media della fluorescenza per pozzetti di controllo poi dividono la variazione di fluorescenza di ciascun bene dal variazione media di fluorescenza dei pozzetti di controllo. Da segnalare, i controlli potrebbero essere sia comandi del veicolo o controlli genetici.
   

Risultati

Soluzione Assay non aumenta la fluorescenza in assenza di pesci embrionali (Figura 1). Tuttavia, l'analisi è molto sensibile a piccole variazioni del tasso metabolico nel pozzo. Un singolo pesce entro un ben crea un segnale significativamente diverso da pozzetti bianchi entro 1 ora (p <0,0001). La Figura 2 fornisce una rappresentazione visiva dei segnali generati dai pesci embrionale dopo 24 ore di incubazione. Ai fini di questa immagine sono stati utilizzati ch...

Discussione

La contaminazione con batteri o funghi limiterà notevolmente l'applicazione di questo test. Il blu di metilene in mezzo embrione E3 limita la possibilità di contaminazione fungina. Nel corso embrione rialzando è fondamentale che la cura è presa per eliminare l'embrione è morto due volte al giorno. Inoltre, è essenziale risciacquare abbondantemente gli embrioni con E3 sterile medio embrione del giorno di dosaggio iniziazione. Questi 2 passaggi limitano il potenziale di contaminazione batterica degli embrion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Manufactured by Thermo Scientific
Fine Tip DisposableTransfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-26	Manufactured by Thermo Scientific
Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-771-9AM	Manufactured by Thermo Scientific
Black sided clear bottom 96-well plates	Fisher Scientific	50-320-785	Manufactured by E&K Scientific Products Inc.