Высокая пропускная способность<em&gt; Данио Rerio</em&gt; Анализ Расход энергии

Резюме

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH₂ sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Аннотация

Данио рерио являются важным модель организма с присущими преимуществами, которые имеют потенциал, чтобы сделать данио широко применяется модель для исследования энергетического гомеостаза и ожирения. Небольшой размер рыбок данио позволяет анализы на эмбрионах, которые будут проводиться в формате 96- или 384-луночного планшета, технологии Морфолино и CRISPR основе содействия легкость генетических манипуляций, и медикаментозное лечение путем применения ванны является жизнеспособным. Кроме того, данио идеально подходят для передних генетических экранов, позволяющих открытие нового гена. Учитывая относительную новизну данио в качестве модели ожирения, необходимо развивать инструменты, которые в полной мере использовать эти преимущества. Здесь мы опишем метод для измерения расхода энергии в тысячи эмбрионального данио одновременно. Мы разработали целый животных микропланшетов платформу, в которой мы используем 96-луночных изолировать отдельные рыбу и мы оцениваем совокупный НАДН ₂ производства с использованием коммерчески доступной культуры клеток жизнеспособность Reагент AlamarBlue. В холоднокровных отношения между НАДН ₂ производства и расхода энергии тесно связано. Эти расходы энергии анализ создает потенциал для быстрого экранировать фармакологические или генетические манипуляции, которые непосредственно изменяют расход энергии или изменяют реакцию на прикладной препарата (например сенсибилизаторов инсулина).

Введение

Мышь в настоящее время преобладает модель ожирения исследований. Короткий промежуток поколения и генетических инструментов, доступных в мышь были непревзойденной на сегодняшний день. Тем не менее, данио также имеет короткий промежуток поколения (3 - 4 месяца) и превосходит даже мышь в простоте генетической манипуляции ^1,2. Данио поддерживает почти 90% генов млекопитающих, в то время как намного превышает мыши в количестве потомства и потенциалом для использования в генетических и наркотиков экранах ^3.

Чтобы выявить потенциал данио модели для изучения в ожирения, анализы должны быть разработаны, чтобы исследовать факторы, влияющие на вес тела регулирования, в том числе расходов энергии. Как метаболиты проходят через бета-окисления и кислорода цикла трикарбоновых кислот потребляется и НАДН ₂ производится. Таким образом, NADH ₂ является прямым показателем потока метаболитов через метаболических путей (окисления метаболит). В poikilotherms, ^Н + утечка через внутреннюю митохондриальную мембрану, которая расцепле- НАДН ₂ окисление от синтеза АТФ, составляет 4 - 5 раз ниже, чем в теплокровным ^4. Соответственно, в данио NADH ₂ очень тесно связан с АТФ через окислительного фосфорилирования. Здесь мы опишем анализа, который измеряет НАДН ₂ производства в личиночной рыбок данио в качестве прокси для расхода энергии ^5.

Потребление кислорода является золотым стандартом для измерения расхода энергии. Тем не менее, лучше всего воспользоваться высокой пропускной потенциал рыбок данио, анализы расходов энергии должен поддаваться высокой пропускной. Системы потреблением кислорода, которые зависят от закрытой камере система циркуляции ограничены в пропускной способности по количеству камер, доступных ^6. На открытом воздухе _O 2 потребление / СО _{2 производственные} анализы также применяются в данио ^5,7. Они под открытым небом 96-а опорная плитаD Systems поддаются высокой пропускной способностью. К сожалению, газообмен с окружающей средой ограничивает чувствительность этих анализов. Мы недавно опубликовал заявление анализе, который контролирует NADH ₂ с помощью индикатора окислительно-восстановительный AlamarBlue ^5. Этот анализ позволяет преодолеть ограничения пропускной способности и чувствительности, общей для анализа потребления кислорода в данио.

Данио становится все более важным модель для изучения всей энергетической тело гомеостаза. В частности, потому, что у рыбок данио поддаются для использования в передних генетических экранов и экранов с наркотиками. Кроме того, целевые генетические манипуляции, в том числе и нокдаун нокаут в, может быть быстро применяется. Ранее мы показали, что этот анализ может быть объединен с применением ванны наркотиков и генной нокдаун или нокаут для идентификации соединений и генов, которые изменяют скорость метаболизма ^5. Кроме того, этот анализ предназначен для использования высоких преимущества, присущие пропускной данио.

протокол

Примечание: Этот протокол следует рекомендациям университета Аризоны Управления ответственного поведения исследований и был одобрен Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная

1. Данио рерио эмбрионов Разведение и обслуживание

1. Подготовка E3 эмбриона среду ^8. Сделать 60x маточного раствора, растворить 34,8 г NaCl, 1,6 г KCl, 5,8 г CaCl ₂ ^● _2Н 2 О, а 9,78 г MgCl ₂ 6H ₂ ^● О в 1,95 л ddiH _{2 O.} Отрегулируйте рН до 7,2 с помощью NaOH и HCl Регулировка громкости до 2 л с использованием ddiH ₂ O.
2. Для подготовки 1x E3 эмбриона среду, развести 16,5 мл 60x запас в 1 л ddiH20. Добавить 100 мкл 1% метиленовый синий.
3. Разведение
   1. Дом Мужчина и женщина маточного стада (7 - 18 месяцев возраста) отдельно, чтобы максимизировать плодовитость.
   2. Включите огни 1 - 2 ч раньше на день раньше яйца лучшего. Настройка спаривания (1 самец и 1 - 2 самки) в CRossing клетки, как описано выше ^9. Пересечение клетки позволяют яйца, чтобы избежать хищников, как они проходят через перфорированную базе танка вставки, в которых взрослые рыбы проводятся.
   3. Дополнительно:. Для своевременной разведения (как было бы необходимо для исследований, связанных с морфолиновое инъекции), отделить мужского и женского рыбы с помощью прозрачной пластиковой перегородки, удаление это утром, приведет к своевременной кладки яиц и оплодотворения. Для морфолино исследований, выполнения расчетов мощности для оценки количества эмбриональной рыбы, необходимого на лечение. Без оценки величины эффекта или изменения, предварительный судебный можно запустить с N = 8.
4. Вылейте яйца от пересечения клетке в чашке Петри (100 - 150 эмбрионов / 10 см чашки Петри). Разрешить яйца оседают на дно тарелки и вылейте воду. Удалите оставшуюся воду с помощью тоненького кончика одноразовые пипетки передачи. Добавить еще Е3 эмбриона среду, достигнутый в шаге 1.1.
5. Сделать AFхромой полированная одноразовые пипетки для будущего яйца и передачи рыбы. Используя ножницы, вырезать окончил одноразовые пипетки передачи в 0,25 мл учебы. Для удаления заусенцев, пламя польский срез кончика над горелкой Бунзена.
6. Поддержание эмбриональных рыбу до 4 дней после оплодотворения (DPF) в 10 см чашки Петри в данио эмбрионов E3 среды на 28,5 ^○ С Два раза в день, использовать пламя полированный окончил одноразовый передачи пипетки, чтобы удалить любые неоплодотворенные яйца или мертвые эмбрионы (непрозрачный белый внешний вид). После каждого дня, заменить E3 эмбриона среды. Вылейте E3 эмбриона среду, удалить оставшуюся жидкость с помощью тоненького кончика пипетки одноразовые передачи, и добавить обратно подогретого (28,5 ^○ C) E3 эмбриона среду.

2. Подготовка Пробирной Решение

1. Приготовьте раствор для анализа соответствии с таблицей 1. Фильтр стерильный раствор для анализа, используя фильтр 0,22 мкм. Перед анализом посвящение, теплый стерильной анализа раствора в 28,5 ^○ Сводяная баня.

Ингредиент	% От общего	Объем (мкл / 10 мл)
60x Е3 эмбрионов Средний	1.667	166,7
Дважды деионизированной (DDI) Н 2 0	96,233	9623,3
Аламар Голубой	1	100
400 мм NaOH	1	100
ДМСО	0,1	10

Таблица 1. Анализ среднего

3. Выполните Пробирной

1. Промыть эмбрионы рыбок данио 3 раза стерильной фильтрованной E3 эмбриона среды. Смешайте все жизнеспособные эмбрионы рыбок данио с муфтой в стакан. Стерильный фильтр 75 мл Е3 эмбрион среднего. Использование тонкой наконечником одноразовые пипетки передачи, вновьдвигаться столько эмбриона среды E3 от эмбрионов данио, как это возможно. Добавить еще 20 мл стерильного отфильтрованного E3 эмбриона среду. Снять и заменить E3 эмбриона среды в 3 раза.
2. Пластина 1 рыбы в каждый из 93 лунки 96-луночного черного сторону очевидно нижнюю пластину. Передача эмбриональных рыбу на тарелку индивидуально захвата эмбриона в пламя полированный окончил пластиковые одноразовые пипетки передачи (шаг 1.5) и осторожно извлечения в колодец. Перевести E3 эмбриона среду, взятую из стакан, содержащий промытый рыбу в 3 пустых скважин. Это гарантирует, что контрольные лунки были подвержены точно такой же, как воды в лунки, которые содержат рыбу. Обе скважины, которые содержат рыбу и пустые колодцы должны быть по крайней мере половиной полном объеме (200 мкл) при заключении этого шага.
3. Заменить E3 эмбриона среду с анализа решения во всех 96 скважин, в том числе пустых скважин. Этот шаг должен быть выполнен 1 колонка за один раз для каждого из 12 столбцов в 96-луночный планшет. Использование тонкой кончик одноразовые трансфер пипетки, удалить E3 эмбриона среды из каждой лунки в одном столбце пластины (8 скважин). Позаботьтесь, чтобы не коснуться данио эмбриона. Добавить 300 мкл аналитического раствора в каждую лунку, из которой воду удаляют. Повторите удаление E3 эмбриона среды и замены с анализа решения для всех 12 столбцов пластины.
4. Необязательно: Чтобы проверить изменения скорости обмена веществ в ответ на соединения, чтобы решение, которое в 100 раз (100X) желаемая концентрация лечение. Следует отметить, что гарантировать, что решение 100x не превышает 10% ДМСО, чтобы ограничить конечную концентрацию DMSO не более чем 0,1%. Добавить 3 мкл раствора 100x для каждого из очистных скважин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение вычислений мощности, чтобы оценить количество очистных скважин. Тем не менее, без оценки величины ответа или изменения, предварительный судебный могут работать в 8 соединения обработанной и 8 транспортных средств обработанных скважин контроля, которые содержат рыбу.
   1. Добавить 3 мкл контроля транспортного средства контроля (нет Дрюг лечение) скважин, которые содержат рыбу. Чтобы убедиться, что флуоресцентный отклик на соединения является результатом действий внутри рыбы, применять наркотики и транспортных средств лечения до 3 пустых скважин в 96-луночного планшета.
5. Читайте рыбы, заполненный пластину на флуоресцентной ридере с длиной волны возбуждения при 530 нМ и длины волны излучения при 590 нм.
6. Место пластины в увлажненном инкубаторе установлен в 28,5 ^○ C (сохранить пластину в темноте на протяжении анализа, чтобы избежать фотообесцвечивания анализа решения). Анализ может быть запущен для периодов времени, которые варьируются от 1 часа до 24 часов. Продолжительность анализа зависит от цели исследования. Для проверки ответа на короткого действия нестабильного соединения короткий срок может быть наиболее подходящим. Тем не менее, для стабильных испытаний или тестов составных генетических эффектов, максимизации продолжительности анализа предпочтительнее использовать преимущества, связанные с совокупной сигнала.
7. В заранее определенный момент времени (см шаг 3,6, чтобы помочь определить сроки)прочитать флуоресценции рыбы заполненные пластины снова с теми же настройками, как на стадии 3.5.

4. Оценка относительного изменения флуоресценции, связанные с лечением

1. Рассчитать изменение в флуоресценции каждой лунки вычитанием флуоресценции в момент времени 0 с флуоресценцией при заключении исследования. Уэллс без рыбы (заготовок), должны иметь значения около 0, что намного ниже значений из скважин, которые содержат рыбу.
   Изменение флуоресценции = флуоресценции при заключении - флуоресценции в момент времени 0
2. Чтобы установить относительное изменение флуоресценции, вычислить среднее изменение флуоресценции для контрольные лунки затем разделить на изменение флуоресценции каждой лунки с помощью среднего изменения флуоресценции контрольных лунках. Следует отметить, что элементы управления могут быть как элементы управления транспортных средств или генетические элементы управления.
   

Результаты

Анализ решение не увеличивать флуоресценцию в отсутствие эмбрионального рыбы (рисунок 1). Тем не менее, анализ является очень чувствительным к малейшим изменениям в скорости обмена веществ в скважину. Один рыбы в лунку создает сигнал значительно отличается от пустых скважин в...

Обсуждение

Загрязнение бактерий или грибков значительно ограничивают применение этого анализа. Метиленовое синего эмбриона среды E3 ограничивает возможность грибкового заражения. На протяжении эмбриона воспитания важно, что осторожность, чтобы удалить мертвые эмбрионы два раза в день. Кроме то...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Manufactured by Thermo Scientific
Fine Tip DisposableTransfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-26	Manufactured by Thermo Scientific
Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-771-9AM	Manufactured by Thermo Scientific
Black sided clear bottom 96-well plates	Fisher Scientific	50-320-785	Manufactured by E&K Scientific Products Inc.