Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Özet

Bu protokolün amacı stoma kompleksinin hücre korteks içinde, GFP etiketli PATROL1, bir membran kaçakçılığı protein noktalar yanıp sönen gösteren değişken açılı Epifloresans mikroskobu ile bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamikleri izlemek için nasıl göstermek için Arabidopsis thaliana.

Özet

A plant’s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed ‘residence time’) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

Giriş

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell’s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes^1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant’s responses to environmental cues at the molecular level.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization³, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass–water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells⁵. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging^6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface⁷, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants⁶.

The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis⁸. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells⁸ and subsidiary cells⁹, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min⁹.

Protokol

Fidan 1. Hazırlık

1. Tohum sterilize edin.
   1. Ve 1 ul% 10 Triton X-100 500 ul steril su: 500 ul NaClO (% 5.0 mevcut klorin) eklenerek sterilizasyon solüsyonu hazırlayın.
   2. Yeri yaklaşık 10 transgenik A. Bir 1.5 ml tüp içine GFP PATROL1 ⁸ taşıyan thaliana tohumları.
   3. 1 ml% 70 etanol solüsyonu ekleyin ve beş kez ters yüz edilerek iyice karıştırın. 1 dakika boyunca bekletin.
   4. Tohumlar tüpün dibine çöker gözlemleyin. Temiz bir laminer akış kabininde, yavaşça bir mikropipet kullanılarak% 70 etanolü çıkarmak ve 1 ml sterilizasyon çözeltisi ilave edilir. Beş kez tersini İyice karıştırın ve 5 dakika bekletin.
   5. Tohum yıkayın. Hala temiz bir bankta aseptik koşullarda çalışan, yavaşça bir mikropipet kullanarak çözüm kaldırmak ve 1 ml steril su ekleyin. Bu beş kez tekrarlayın. Sterilize edilmiş tohumlara, 2 gün boyunca 4 ° C'de steril su içinde depolanabilir.
2. Yani% 0.5 gellan zamkı katılaşmış 1/2 Murashige ve Skoog levha (pH 5.8) ⁹ sterilize edilmiş tohumlar, w. Cerrahi bant iki kat kullanarak plaka üzerine kapağı bantlayın.
3. Soğuk depolama odası O / N 4 ° C'de karanlıkta plaka inkübe edin.
4. 100 umol ^m-2 sec ^-1 beyaz ışık kullanarak 12 saat / 12 saatlik bir ışık-karanlık çevrimi ile 23.5 ° C 'ye ayarlanmış bir büyütme odasında içine plaka aktarın ve 7 gün boyunca inkübe edilir. Uzun yaklaşık 1 mm kotiledonlarında fideler daha sonra hasat edilebilir.

2. Sky Drop Kotiledon Örnekler montajı

NOT: VAEM gözlem numune hazırlama önemli bir faktör numune ve kapak cam arasındaki hava kabarcıkları dahil kaçınmaktır. Kabarcıklar ölçüde kırılma indeksi farklılıkları yol açarak VAEM görüntü kalitesini azaltır. Biz montaj 'gökyüzü bırak' çağrısında bulundu basit bir yöntem, kabarcıkları önlemek için de kullanılabilirA arasında thaliana Kotiledonlar ve kapak cam. Bu gözlem hemen önce yapılmalıdır.

1. 76: Bazal tampon [5 mM 2- (N-morfolino) -etansülfonik pH 6.5'te asit tris (MES-Tris), 50 mM KCI, 100 uM _CaCl2] Bir cam slayt ortasına (boyut 30 ul koyun × 26 mm, kalınlığı: 1.0-1.2 mm).
2. Diseksiyon makas kullanarak 7 günlük bir fide bir kotiledon çıkarın. Gözlem tarafı bazal tampon damla (Şekil 1, aşama 1) üzerinde yukarı bakacak şekilde kotiledon kaydırın.
3. Bir kapak cam ortasına bazal tampon 30 ul yerleştirin (boyut: 18 × 18 mm, kalınlığı: 0,12-0,17 mm) (Şekil 1, adım 2). Başaşağı hafifçe cam kapak çevirin. Yüzey gerilimi düşmesini tampon damla önleyecektir. Bir kenarında cımbızla cam kapak tutun. Tampon damla yaklaşık kotiledon üstünde olacak şekilde cam slayt karşı kenarını yerleştirin.
4. Bu kotiledon örnek (Şekil 1, aşama 3) üzerinde yer almaktadır, böylece sürgü hala, kapak camın kenarına ve hala cımbız ile karşı kenarını tutarken, kapak camı altında tamponu damla konumunu ayarlamak. Kapak cam gidelim. Hava kabarcığı olmadan bir hazırlık sonucunda numune üzerinde bir damla monte edin.
5. Havsız dokuları kullanılarak aşırı tampon siliniz. Hemen hazırlık gözlemleyin (adım 3).
   NOT: örnekleri mühür gerek yoktur.

3. VAEM Gözlem ve Toplama Film

Bir ters mikroskop, bir TIRF ünitesi ve 1.49 sayısal diyafram ile bir TIRF objektif lens ile donatılmıştır: NOT: aşağıdaki gibi bu çalışmada kullanılan TIRF mikroskop sistemi ⁹ açıklanmıştır. Lazer giriş açısının bilgisayarlı kontrol için, bir kontrol kutusu kullanılır. Yeşil floresan proteini (GFP) 488 nm optik pompalanan yarıiletken lazer ve t ile heyecanlıO floresans kloroplast gelen otoflüoresanı önlemek için 510-550 nm bant-geçiş filtresi içinden tespit edilir. Fiber çıkış gücü ölçülen maksimum değeri 13,0-13,5 mW olduğunu. Tespiti için, bir elektron kullanılır (EM-CCD) kamera kafası sistemi ve bir C-mount kamera büyütme değişim ünitesi şarj çiftli cihaz çarparak.

1. Lazer üreticinin talimatlarına göre merkezleme ve odaklama kalibrasyonu.
   Not: Bu adım hassas VAEM gözlemleri için çok önemlidir. Kuvvetle lazer yolu ayar prosedürlerinin periyodik kontroller, mikroskop uygun, yürütülmektedir tavsiye edilir.
   1. Mikroskopi odasının tavanında bir objektif lens içermeyen ışık yolu ile aydınlatılmış merkezi konumunu belirleyin. Merkezi konumunu işaretlemek için, tavanda renkli daire mühür koymak (Şekil 2, adım 1, 2).
   2. Objektif lensi (Şekil 2, aşama 3, 4) sahip tavan yakma. I Taşıorta konumda (Şekil 2, adım 5) 'bölgesini lluminated. Lazer (Şekil 2, Adım 6) odaklanın. Ince ayar yapma merkezi (Şekil 2, basamak 7) odaklanmış lazer konumu.
2. Mikroskop sahnede bir örnek olarak ayarlayın ve parlak alan aydınlatma kullanılarak gözlem hücreleri seçin.
3. Floresan protein hücrelerinde görülebilir kontrol edin ve Epifloresans aydınlatma (Şekil 3A) kullanılarak hücre yüzeyinde z -Axis konumunu ayarlamak.
4. VAEM gözlemleri gerçekleştirin.
   1. Denetleyici kutusu ile yavaş yavaş lazer ışınının giriş açısı eğim. Aynı zamanda, özenle canlı görüntüyü izlemek. Başlangıçta, görüntü (Şekil 3B) bulanık olacaktır.
   2. Lazer açısı arttıkça, VAEM görüntü sonunda net bir görüntü (Şekil 3C ve D) üreten, daha az bulanık hale gelecektir. Bu noktada, increa durdurmaLazer açısını şarkı. Floresan sinyali kaybolursa, sığ açı azalır.
   3. İnce ayar lazer giriş açısı daha iyi bir görüntü elde etmek için. İnce ayar z -Axis pozisyon da imajını artırabilir. Gerekirse, optik parametreleri (lazer gücü, dalga boyu ve filtre seti) ve görüntü sensörü parametrelerini [görüntü boyutu, pozlama süresi, kazanç, sayısallaştırıcı ve elektron-çarparak (EM) kazanç] ayarlayın.
      NOT: TIRF mikroskop ekipman durumda yukarıda açıklanan aşağıdaki gibi, temsilci parametrelerdir. Sadece kamera önünde lens Büyütme: 2X; Lazer çıkışı: 1.0 mW; Resim boyutu: 512 × 512 piksel; Pozlama süresi: 100 ms; Kazanç: 5 ×; Dijitalleştirici: 11 MHz; ve EM kazanç: 100.
5. Ticari mikroskop yazılımını kullanarak çok sayfalı TIFF görüntü dosyası olarak film edinin. Burada, film stoma hücrelerinin yüzeyi üzerinde yanıp sönen GFP-etiketli noktalar taşımaktadır.
   NOT: Temsili görüntü alma koşulları fol gibidiralçak. Toplama Modu: Akış RAM'e; Kare sayısı: 600; ve çoklu sayfa TIFF dosya boyutu: ~ 302 MB.

4. kymograph Analizi Niceleme için GFP etiketli Dot Residence Time Fiji Yazılım Kullanma

1. Fiji Install yazarların yönergeleri kullanarak yazılım ¹⁰ ('Fiji Just ImageJ olduğu') (http://fiji.sc/Fiji).
2. Fiji çalıştırın ve Fiji menüsü "Dosya-Aç" kullanılarak elde çoklu sayfa TIFF dosyasını açın.
3. Fiji araç çubuğu menüsü "Düz Çizgi Seçim Aracı" seçeneğini kullanarak, ilgi sitede bir çizgi yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, "Segment Hattı Seçim Aracı" veya "Serbest Hattı Seçim Aracı" kullanın. Burada sunulan sonuçlar şekilde, (8.0 um karşı gelen) 100 piksellik bir düz çizgi bir yan hücre (Şekil 4A) üzerine yerleştirilmiştir.
4. Fiji menüsü "Resim-Yığınları-Dinamik Reslice kullanarak bir kymograph görüntü olun "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Şekil 4B). İsteğe bağlı olarak, bir onay kutusu penceresinde ve "Döndür 90 Degrees" "Dikey Döndürme" de (100 piksel tekabül (Burada sunulan sonuçlar kullanılmaz) kymograph görüntüde. X ve y ekseni hattı konumunu belirtmek mevcuttur 8.0 mikron) ve gözlem süresi (600 piksel sırasıyla) 60 saniyeye tekabül etmektedir. kymograph görüntü tatmin edici değilse, pozisyon ve tip (düz, parçalı ve çok sayfalı görüntü hattın serbest) gibi. değiştirilebilir çizgi değişikliği, kymograph görüntü dinamik olarak değişir. Fiji menüsü "Dosya-Farklı Kaydet-Tiff" kullanarak bir TIFF dosyası olarak bir kymograph görüntüsünü kaydedin.
5. Zaman ekseni yönde blob uzunluğunu ölçün.
   1. Gürültü azaltma gerçekleştirmek için, Fiji menüsü "Süreç Filtreler-Gaussian Blur" seçeneğini kullanarak kymograph görüntüleri Gauss filtre uygulamak. "Sigma (Radius) "parametresi ayarlanabilir (1 piksel yarıçapı sunulan sonuçlar için kullanılan) 'dir.
   2. Segment Fiji menüsünü kullanarak eşikleme sinyal bölgeleri, "Resim-ayarlayın-Eşik".
      NOT: Aralarından seçim yapabileceğiniz çeşitli eşikleme algoritması vardır. Sunulan sonuçlarda, "Yen" algoritması (Şekil 4C) seçildi.
   3. Menüsünü kullanarak blob'un -Axis uzunluğu süresi (y) ölçmek için hazırlanın "Analiz-Set Ölçümleri". "Set Ölçümleri" penceresindeki "Sınırlayıcı dikdörtgen" seçeneğini işaretleyin. İdeal Alan seti gürültü çıkarmak, mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Burada asgari alan 50 piksel olarak belirlendi. Zaman (y) menüsünü kullanarak blob'un -Axis uzunluğunu ölçün "Analiz-Analiz Parçacıklar". Yöneticisi Ekle "sonuç değerleri elde ve ölçüm bölgelerinin güvenilirliğini kanıtlamak," sonuçlarını görüntüle "kontrol etmek ve </ em> "kutuları.
   4. "Yükseklik" sütununda değerler (y) ölçülen damla (Şekil 4D) için uzunlukları -Axis zaman vardır. Sonuçlar tablo menüsü "Dosya-Farklı Kaydet" seçeneğini kullanarak değerleri kaydetmek ve hesaplanması ve istatistiksel paket ve / veya elektronik tablo yazılımı (Şekil 4E) kullanarak blob görüntü süreleri veri kümesi işlemek.

Sonuçlar

Bu video makalede, A. GFP-PATROL1 ve VAEM gözlem için protokollerde yer thaliana kotiledon stoma karmaşık hücrelerin sağlanmaktadır. Gökyüzü açılan montaj A. VAEM hazırlıkları hava kabarcıklarının oluşumunu azaltmaya yardımcı olabilir basit bir hazırlık yöntemi thaliana kotiledonları (Şekil 1). Giriş lazer ve / veya VAEM için numunelerin z-konumlandırma Overtilting belirsiz bir görüntü sağlayacaktır. Eğer bu gerçekleşirse, bu Epifl...

Tartışmalar

Bu video makalede, protokoller izlenmesi ve Arabidopsis thaliana'nın stoma kompleksi üzerine GFP-PATROL1 noktaların dinamik davranışını ölçmek için verilmiştir. Burada gösterildiği gibi, VAEM gözlem bitki hücre yüzeylerinin canlı görüntüleme için güçlü bir araçtır. Son derece hassas EM CCD VAEM optik bir nispeten zayıf uyarım lazer kullanımına izin verir, çünkü GFP PATROL1 izlenmesi için kullanılan deney koşulları altında, bir video yakalama 1 dakika için kullanılan n...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser angle control box	Chuo Seiki	QT-AK
Optically pumped semiconductor laser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter	Olympus	U-FBNA
EM CCD camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual	Olympus	AX7385	Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 degrees)