В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии

Резюме

Цель этого протокола заключается в демонстрации того, как контролировать флуоресцентно-меченого динамики белков на завод клеточной поверхности с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии, показывающие мигать точками GFP-тегами ПАТРУЛЬ 1, белка через мембрану, в клеточной коре устьичного комплекса в Резуховидка Таля.

Аннотация

A plant’s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed ‘residence time’) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

Введение

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell’s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes^1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant’s responses to environmental cues at the molecular level.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization³, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass–water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells⁵. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging^6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface⁷, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants⁶.

The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis⁸. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells⁸ and subsidiary cells⁹, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min⁹.

протокол

1. Подготовка рассады

1. Стерилизовать семена.
   1. Приготовьте раствор стерилизации путем добавления 500 мкл NaClO (активного хлора: 5,0%) и 1 мкл 10% Triton X-100 до 500 мкл стерильной воды.
   2. Место около 10 трансгенных А. THALIANA семена, несущие GFP-ПАТРУЛЬ 1 ⁸ в 1,5 мл трубки.
   3. Добавить 1 мл 70% раствора этанола и тщательно перемешать путем обращения в пять раз. Оставить на 1 мин.
   4. Заметим, семена опускаются на дно пробирки. В чистом шкафу с ламинарным потоком, осторожно удалите 70% этанола, используя микропипетку, и добавить 1 мл раствора стерилизации. Все хорошо перемешать путем обращения в пять раз и оставить на 5 мин.
   5. Вымойте семена. Тем не менее работы в асептических условиях на чистом столе, аккуратно удалите раствор, используя микропипетку, и добавить 1 мл стерильной воды. Повторите это пять раз. В стерилизованные семена могут храниться в стерильной воде при 4 ° С в течение 2 дней.
2. ТакW стерилизованных семян на 0,5% геллановой камеди-затвердевает 1/2 среды Мурашига и Скуга пластины (рН 5,8) ^9. Лента крышку на пластине с помощью двух слоев хирургической ленты.
3. Инкубируйте планшет в темноте при 4 ° С с холодильной камере для хранения, O / N.
4. Передача пластины в камере роста, установленной на 23,5 ° С с 12-часовой / 12-часовой цикле свет-темнота с использованием 100 мкмоль ^{м-2 с-1} белые огни, и инкубируют в течение 7 дней. Саженцы с семядолей около 1 мм длиной, то могут быть собраны.

2. Небо падение Монтаж семядольных образцов

Примечание: важным фактором в подготовке образцов для наблюдения VAEM избегает включения пузырьков воздуха между образцом и покровным стеклом. Пузыри значительно снизить качество изображения VAEM вызывая различия показателя преломления. Простой метод, который мы назвали «Небо падение" монтажа, могут быть использованы, чтобы избежать пузыреймежду А. THALIANA семядоли и защитное стекло. Это должно быть сделано непосредственно перед наблюдения.

1. Поместите 30 мкл буфера базальной [5 мМ 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic кислоты-трис (MES-трис) при рН 6,5, 50 мМ КСl, 100 мкМ CaCl _2] в центре предметное стекло (размер: 76 × 26 мм, толщина: 1,0-1,2 мм).
2. Снимите семядолей от 7-дневных рассады с использованием рассекает ножницы. Поплавок семядолей с наблюдения стороной вверх на базальной капли буфера (рис 1, шаг 1).
3. Поместите 30 мкл буфера базальной по центру покровным стеклом (размер: 18 × 18 мм, толщина: 0.12-0.17 мм) (рис 1, этап 2). Поверните крышку стекла вниз мягко. Поверхностное натяжение предотвратит падение буфера от падения. Держите покровного стекла с помощью пинцета на одном краю. Поместите противоположный край на предметное стекло так, чтобы падение буфера составляет примерно выше семядоли.
4. С краю покровного стекла еще на слайде, и все еще ​​держа противоположный край с помощью пинцета, отрегулируйте положение капли буфера под покровного стекла так, чтобы он непосредственно над семядолей образца (рис 1, шаг 3). Отпусти покровного стекла. Установите падение на образец, в результате препарата без пузырьков воздуха.
5. Протрите избыточного буфер, используя безворсовые ткани. Сразу Соблюдайте подготовку (см шаг 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет необходимости, чтобы запечатать образцов.

3. VAEM Наблюдательные Приобретение Кино

Примечание: Система TIRF микроскоп ⁹ используется в настоящем исследовании описывается следующим образом: инвертированный микроскоп оснащен блоком TIRF и TIRF объектив с числовой апертурой 1,49. Для компьютерного управления угла лазерного входа, используется блок управления. Зеленый флуоресцентный белок (GFP), возбуждается с 488 нм оптической накачкой полупроводниковым лазером, и тон флуоресценции детектируется посредством 510-550 нм полосового фильтра, чтобы предотвратить флуоресценции от хлоропластов. Измеренная максимальная величина выходного волокна власти 13.0-13.5 мВт. Для обнаружения, электрон умножения прибор с зарядовой связью (ПЗС-ЭМ) головка камеры системы и C-Mount блок изменения увеличения камеры используются.

1. Калибровка лазерной центровки и фокусировки в соответствии с инструкциями изготовителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является решающим для точными наблюдениями VAEM. Настоятельно рекомендуется, что периодические проверки процедур настройки лазера пути, соответствующие вашим микроскопом, осуществляются.
   1. Определите центральную позицию подсветкой с пути света линзы объектива без на потолке микроскопии комнате. Чтобы отметить центральное положение, положить цветную печать круг на потолке (рис 2, стадии 1, 2).
   2. Осветите потолок с объективом (рис 2, стадия 3, 4). Перемещение IСветовая область в центральное положение (рисунок 2, пункт 5). Фокус лазер (рисунок 2, шаг 6). Тонкая настройка позиции сфокусированного лазерного к центру (рис 2, шаг 7).
2. Установите образец на столик микроскопа и выберите ячейки для наблюдения с использованием яркое освещение поля.
3. Убедитесь, что флуоресцентный белок можно наблюдать в клетках, и установите Z ось позицию на поверхности клеток с использованием эпифлуоресцентной освещения (рис 3а).
4. Выполните VAEM наблюдения.
   1. Наклоните угол входа лазерного луча постепенно с коробкой управления. В то же время, мониторинг в режиме реального изображения тщательно. Первоначально изображение будет смазанным (3В).
   2. По мере увеличения угла лазерных изображение VAEM станет менее размыты, в конечном итоге производить четкое изображение (рис 3C и D). В этот момент, остановить increaпеть угол лазерного. Если сигнал флуоресценции теряется, уменьшается до меньшим углом.
   3. Тонкая настройка угол лазерного запись, чтобы получить лучшее изображение. Тонкая настройка г -Axis положение может также улучшить изображение. При необходимости, отрегулируйте параметры (оптические мощности лазера, длина волны и наборов фильтров) и параметры датчика изображения [размер изображения, время экспозиции, усиления, дигитайзер и электронно-умножения (EM) GAIN].
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае с TIRF микроскоп оборудования описано выше, представитель параметры следующим образом. Увеличение объектива только в передней части камеры: 2X; Мощность лазера: 1,0 мВт; Размер изображения: 512 × 512 пикселей; Время экспозиции: 100 мс; Выигрыш: 5 ×; Дигитайзер: 11 МГц; Е. М. усиления: 100.
5. Приобретать фильм как мульти-страницы файл изображения в TIFF, используя коммерческое программное обеспечение микроскопа. Здесь, фильм из GFP-меченых точек мигающих на поверхности клеток устьичные.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные условия захвата изображений являются ВОЛСминимумы. Режим съемки: поток в ОЗУ; Количество кадров: 600; и размер многостраничный файл TIFF: ~ 302 Мб.

4. Анализ кимографе для количественного определения GFP-меченых Dot Residence времени, используя программное обеспечение Фиджи

1. Установите Фиджи ('Фиджи Просто ImageJ "), программное обеспечение, следуя инструкциям ¹⁰ авторов (http://fiji.sc/Fiji).
2. Запустите Фиджи и открыть полученную многостраничный файл TIFF с помощью меню Фиджи "Файл-Открыть".
3. Поместите линию на участке интерес, используя инструмент Фиджи барное меню "Прямая линия Выбор инструмента". При желании, использовать "Сегментированный Line Tool Selection" или "Freehand Tool Line Selection". В результатах, представленных здесь, прямая линия 100 пикселей (что соответствует 8,0 мкм) помещали на дочерней клетки (фиг.4А).
4. Сделать кимографе изображение, используя меню "Изображение Fiji-Стеки-динамический Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (4В). При желании, "Отразить по вертикали" и "Поворот на 90 градусов" в окне флажок, также доступны (не используется в результатах, представленных здесь). X- и Y-ось в кимографа изображения указывают на положение линии (100 пикселей, соответствующее 8.0 мкм) и время наблюдения (600 пикселей, соответствующее 60 сек), соответственно. Если кимограф изображения не является удовлетворительным, положение и тип (прямой, сегменты и от руки) линии на изображении мульти-страницы могут быть изменены. В изменения линии, кимограф изображения динамически меняется. Сохранить кимографе изображение в виде файла TIFF с помощью меню "Файл Фиджи-Сохранить как-Tiff".
5. Измерение длины сгустка в ориентации оси времени.
   1. Для выполнения уменьшения шума, применить Gaussian фильтр к кимографе изображений с помощью меню Фиджи "Process-Фильтры-Gaussian Blur". К "Сигма (РадВМС) "параметр перестраиваемый (1 Радиус пикселя используется для представленных результатов).
   2. Сегмент сигнальные регионы по пороговой, используя меню "Изображение Fiji-Adjust-Порог".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько алгоритмов Thresholding, чтобы выбрать из. В представленных результатов, "Йен" алгоритм был выбран (рис 4C).
   3. Подготовьте для измерения времени (у) ось длину BLOB с помощью меню "Анализ-Set измерений". Проверьте "прямоугольник", ограничивающие в окне "Набор измерений». В идеале набор зона должна быть как можно меньше, чтобы исключить шум. Здесь минимальная площадь была установлена ​​на уровне 50 пикселей. Измерьте время (у) ось длину BLOB с помощью меню "Анализ-Анализ частиц". Для получения значения результат и доказать достоверность регионов измерения, проверить "Показывать результаты" и "Добавить в менеджера </ EM> "коробки.
   4. Значения в колонке «Рост» являются время (у) ось длины для измеряемой каплю (рис 4D). Сохраните значения с помощью меню Таблица результатов "Файл-Сохранить как" и рассчитать и обрабатывать набор данных BLOB изображения продолжительности с использованием статистического пакета и / или электронных таблиц (рис 4д).

Результаты

В этом видео статьи, протоколы для VAEM наблюдения GFP-ПАТРУЛЬ 1 в А. THALIANA семядолей устьичных сложные клетки обеспечены. Небо падение монтаж простой способ получения, которые могут помочь уменьшить возникновение воздушных пузырьков в VAEM препаратов А. THALIANA семядоли (Рисунок 1)...

Обсуждение

В этом видео статьи, протоколы приведены для мониторинга и измерения динамических характеристик GFP-ПАТРУЛЬ 1 точек на устьичного комплекса Arabidopsis THALIANA. Как показано здесь, VAEM наблюдения является мощным инструментом для живых изображений клеток растений поверхностей. В условиях эк...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser angle control box	Chuo Seiki	QT-AK
Optically pumped semiconductor laser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter	Olympus	U-FBNA
EM CCD camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual	Olympus	AX7385	Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 degrees)