Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

Résumé

L'objectif de ce protocole est de démontrer comment surveiller la dynamique des protéines étiquetées par fluorescence sur des surfaces de cellules végétales avec angle variable épifluorescence microscopie, montrant clignoter points de GFP-tagged PATR1, une protéine de trafic membranaire, dans le cortex cellulaire du complexe stomatique dans Arabidopsis thaliana.

Résumé

A plant’s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed ‘residence time’) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

Introduction

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell’s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes^1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant’s responses to environmental cues at the molecular level.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization³, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass–water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells⁵. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging^6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface⁷, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants⁶.

The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis⁸. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells⁸ and subsidiary cells⁹, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min⁹.

Protocole

1. Préparation de semis

1. Stériliser les graines.
   1. Préparer la solution de stérilisation en ajoutant 500 ul de NaClO (chlore disponible: 5,0%) et 1 ul de 10% de Triton X-100 à 500 pi d'eau stérile.
   2. Lieu ca. 10 transgénique A. thaliana graines transportant GFP-PATR1 ⁸ dans un tube de 1,5 ml.
   3. Ajouter une solution d'éthanol 1 ml de 70%, et bien mélanger en inversant cinq fois. Laissez pendant 1 min.
   4. Observer les graines tombent au fond du tube. Dans une hotte à flux laminaire propre, retirez délicatement l'éthanol à 70% à l'aide d'une micropipette, et ajouter 1 ml de solution de stérilisation. Mélangez bien en inversant cinq fois et laisser reposer pendant 5 min.
   5. Laver les graines. Je travaille toujours dans des conditions aseptiques sur un banc propre, retirez délicatement la solution à l'aide d'une micropipette, et ajouter 1 ml d'eau stérile. Répétez cette opération cinq fois. Les graines stérilisées peuvent être stockés dans de l'eau stérile à 4 ° C pendant 2 jours.
2. Ainsiw les graines stérilisées sur une augmentation de 0,5% de gomme de gellane solidifié 1/2 Murashige et Skoog plaque de milieu (pH 5,8) ^9. Tape le couvercle sur la plaque à l'aide de deux couches de ruban adhésif chirurgical.
3. Incuber la plaque à l'obscurité à 4 ° C avec une chambre de stockage à froid, O / N.
4. Transférer la plaque dans une chambre de croissance fixé à 23,5 ° C avec un cycle lumière-obscurité / 12 h-12 h en utilisant 100-pmol m ^{-2 s} -1 lumières blanches, et incuber pendant 7 jours. Les semis avec cotylédons d'environ 1 mm de long peuvent alors être récoltées.

2. Sky Goutte montage des spécimens Cotylédon

REMARQUE: Un facteur important dans la préparation des échantillons pour l'observation VAEM est d'éviter l'inclusion de bulles d'air entre l'échantillon et le verre de protection. Bubbles réduisent considérablement la qualité de l'image en VAEM provoquant des différences dans l'indice de réfraction. Une méthode simple, que nous avons appelé «chute de ciel» de montage, peut être utilisé pour éviter les bullesentre l'A. cotylédons thaliana et le verre de protection. Cela devrait être fait immédiatement avant l'observation.

1. Placer 30 ul de tampon de base de [5 mM de 2- (N-morpholino) -éthanesulfonique Tris-acide (MES-Tris) à pH 6,5, KCl 50 mM, _CaCl2 100 pM] sur le centre d'une lame de verre (taille: 76 × 26 mm, épaisseur: 1,0-1,2 mm).
2. Retirer les cotylédons d'un semis 7-day-old avec des ciseaux de dissection. Flotteur cotylédon avec la face d'observation tournée vers le haut sur ​​la chute de la mémoire tampon de base (figure 1, étape 1).
3. Placez 30 pi de tampon de base sur le centre d'un verre de couverture (taille: 18 × 18 mm, épaisseur: 0,12-0,17 mm) (figure 1, étape 2). Tournez le couvercle en verre à l'envers doucement. La tension superficielle empêche la chute de tampon de tomber. Tenez le couvercle en verre avec des pincettes sur un bord. Placez le bord opposé de la lame de verre de telle sorte que la chute de tampon est d'environ au-dessus du cotylédon.
4. Avec le bord du verre de couverture encore sur la diapositive, et tenant toujours le bord opposé avec des pincettes, ajuster la position de la chute de tampon sous le couvercle en verre de sorte qu'il est directement au-dessus de l'échantillon des cotylédons (figure 1, étape 3). Lâchez le couvercle en verre. Monter une goutte sur l'échantillon résultant à une préparation sans bulles d'air.
5. Essuyez l'excès de tampon en utilisant des tissus non pelucheux. Observez la préparation immédiatement (voir étape 3).
   NOTE: Il n'y a pas besoin pour sceller les échantillons.

3. VAEM Observation et Movie Acquisition

Remarque: Le système de microscope TIRF ⁹ utilisé dans la présente étude est décrite comme suit: Un microscope inversé est équipé d'une unité de TIRF et une lentille d'objectif TIRF avec une ouverture numérique de 1,49. Pour le contrôle informatisé de l'angle d'entrée de laser, une boîte de contrôle est utilisé. La protéine fluorescente verte (GFP) est excité avec un 488 nm à pompage optique laser semi-conducteur, et til fluorescence est détectée à travers un filtre passe-bande de 510 à 550 nm pour empêcher autofluorescence de chloroplastes. La valeur maximale mesurée de la puissance de sortie de la fibre est de 13,0 à 13,5 mW. Pour la détection, une multiplication d'électrons dispositif à couplage de charge (CCD-EM) système de tête de caméra et une unité C-mount changement caméra de grossissement sont utilisés.

1. Calibrer le laser de centrage et en se concentrant selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: Cette étape est cruciale pour les observations de VAEM précises. Il est fortement recommandé que des contrôles périodiques des procédures d'ajustement de chemin de laser, appropriée à votre microscope, sont effectuées.
   1. Déterminer la position centrale illuminée avec un chemin de lumière sans lentille objective sur le plafond de la salle de microscopie. Pour marquer la position centrale, mettre un joint de cercle de couleur sur le plafond (Figure 2, étape 1, 2).
   2. Éclairer le plafond avec une lentille d'objectif (figure 2, étape 3, 4). Déplacez le illuminated région de la position centrale (figure 2, étape 5). Concentrer le laser (Figure 2, étape 6). Peaufinez la position du laser focalisé au centre (Figure 2, étape 7).
2. Définir un échantillon sur la platine du microscope et de sélectionner des cellules d'observation en utilisant un éclairage à fond clair.
3. Vérifier que la protéine fluorescente peut être observé dans les cellules, et mis en la position de la z à la surface cellulaire en utilisant un éclairage à épifluorescence (figure 3A).
4. Effectuer des observations VAEM.
   1. Incliner l'angle du faisceau laser d'entrée progressivement avec le boîtier de commande. Dans le même temps, de surveiller attentivement l'image en direct. Initialement, l'image sera floue (figure 3B).
   2. Comme le laser angle augmente, l'image VAEM deviendra moins floue, éventuellement produire une image claire (figure 3C et D). À ce stade, arrêter Increachanter l'angle laser. Si le signal de fluorescence est perdue, pour diminuer un angle moins profond.
   3. Peaufinez l'angle d'entrée laser pour obtenir une meilleure image. Fine-tuning de la position de la z peut également améliorer l'image. Si nécessaire, ajuster les paramètres optiques (puissance de laser, longueur d'onde et de jeux de filtres) et des paramètres de capteur d'image [taille de l'image, le temps d'exposition, gain, numériseur et électrons multipliant (EM) Gain].
      Remarque: dans le cas de l'équipement de microscope TIRF décrit ci-dessus, les paramètres représentatifs sont les suivants. Grossissement de lentille juste en face de la caméra: 2X; Sortie laser: 1,0 mW; Taille de l'image: 512 x 512 pixels; Temps d'exposition: 100 ms; Gain: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; et EM Gain: 100.
5. Acquérir un film comme un fichier image TIFF multi-page à l'aide du logiciel de microscope commerciale. Ici, le film est de points GFP marquée à clignoter sur la surface des cellules des stomates.
   REMARQUE: les conditions d'acquisition d'image représentatifs sont comme folbas. Mode d'acquisition: Stream RAM; Nombre de cadres: 600; et la taille multi-page du fichier TIFF: ~ 302 MB.

4. Analyse kymographe pour la quantification de la GFP marquée Dot Temps de résidence Utilisation Fidji Software

1. Installez Fidji (Fidji est Juste ImageJ ') ¹⁰ logiciels en utilisant les instructions des auteurs (http://fiji.sc/Fiji).
2. Exécutez Fidji et ouvrir le multi-page du fichier TIFF acquise en utilisant le menu Fidji "Fichier-Ouvrir".
3. Placez une ligne sur le site d'intérêt, en utilisant l'outil barre de menu Fidji outil "Sélection de droite". Eventuellement, utiliser l'outil "Sélection de ligne sectorielle» ou «Outil de sélection Freehand Line". Dans les résultats présentés ici, une ligne droite de 100 pixels (correspondant à 8,0 um) a été placée sur une cellule filiale (figure 4A).
4. Faire une image en utilisant le menu kymographe Fidji "Image-Piles-dynamique trancher de nouveau "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (figure 4B). Eventuellement, "Retourner verticalement" et "pivoter de 90 degrés" dans une fenêtre de case sont également disponibles (non utilisé dans les résultats présentés ici). X et Y-axe dans l'image de kymographe indiquent la position de la ligne (100 pixels correspondant à 8,0 um) et l'heure d'observation (600 pixels correspondant à 60 sec), respectivement. Si l'image de kymographe est pas satisfaisante, la position et le type (droite, segmentés et à main levée) de la ligne sur l'image multi-pages peuvent être modifiées. Comme les changements de ligne, l'image de kymographe change dynamiquement. enregistrer une image de kymographe comme un fichier TIFF en utilisant le menu Fidji "File-Save As-Tiff".
5. Mesurer la longueur de la goutte dans l'orientation de l'axe des temps.
   1. Pour effectuer la réduction du bruit, appliquer un filtre gaussien aux images kymographe en utilisant le menu Fidji "processus Filtres-Flou gaussien". Le «Sigma (Radius) "paramètre est accordable (1 rayon de pixel est utilisé pour les résultats présentés).
   2. Segment les régions de signal par un seuil, en utilisant le menu Fidji "Image-Adjust-Threshold".
      NOTE: Il ya plusieurs algorithmes de seuillage à choisir. Dans les résultats présentés, l'algorithme "Yen" a été choisi (figure 4C).
   3. Préparez-vous à mesurer le temps (y) -axis longueur du blob en utilisant le menu "Analyser Set-mesures". Cochez la case "rectangle englobant" dans la fenêtre "Set Mesures". Idéalement, l'ensemble de la zone doit être aussi petit que possible, d'exclure le bruit. Ici, la superficie minimale a été fixée à 50 pixels. Mesurer le temps (y) -axis longueur du blob en utilisant le menu "Analyze-analyser des particules". Pour obtenir les valeurs de résultat et de prouver la crédibilité des régions de mesure, vérifier les «Résultats» et «Ajouter au Gestionnaire </ em> "boîtes.
   4. Les valeurs dans la colonne «Hauteur» sont le temps (y) axe des x longueurs pour le blob mesurée (Figure 4D). Enregistrer les valeurs en utilisant le menu de la table des résultats "File-Save As» et de calculer et de traiter l'ensemble de données de durées d'image de blob en utilisant un logiciel d'analyse statistique et / ou d'un tableur (figure 4E).

Résultats

Dans cet article, de la vidéo, les protocoles d'observation VAEM de GFP-PATR1 dans A. cellules complexes thaliana cotylédons stomates sont fournis. Montage de chute de Sky est une méthode de préparation simple qui peut aider à réduire l'apparition de bulles d'air dans les préparations VAEM de A. cotylédons thaliana (Figure 1). Une inclinaison trop importante du laser d'entrée et / ou z-positionnement des spécimens pour VAEM fournira une image...

Discussion

Dans cet article, de vidéo, les protocoles sont donnés pour surveiller et mesurer le comportement dynamique des points GFP-PATR1 sur le complexe stomatique de Arabidopsis thaliana. Comme indiqué ici, l'observation VAEM est un outil puissant pour l'imagerie en direct de la surface des cellules de la plante. Dans les conditions expérimentales utilisées ici pour la surveillance GFP-PATR1, il y avait très peu de photoblanchiment de fluorescence dans l'échantillon utilisé pendant 1 min de capture...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser angle control box	Chuo Seiki	QT-AK
Optically pumped semiconductor laser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter	Olympus	U-FBNA
EM CCD camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual	Olympus	AX7385	Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 degrees)