JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kütle spektrometresi tabanlı phyloproteomics (MSPP) Campylobacter jejuni ssp bir koleksiyon yazın kullanıldı. Doylei multilokus dizisi yazarak (MLST) kıyasla gerilme seviyesinde izole eder.

Özet

-TOF MS tür ve alt türlerinin düzeyinde ama daha aşağıda, gerilme seviyesinde değil sadece bazı bakterileri ayırt etmek imkanı sunuyor. saptanabilir Biyomarker iyonlarının Alelık izoformları izole özgü kitle vardiya sonuçlanır. Kütle spektrometresi tabanlı phyloproteomics (MSPP) referans suşu dizisi bir genomu ile karşılaştırıldığında izole özgü kitle vardiya phyloproteomic ilişkilerin kesinti sağlayan bir düzeni kitle spektrometresi saptanabilir Biyomarker kitleleri birleştiren yeni bir tekniktir. çıkarsanan amino asit dizileri daha sonra MSPP tabanlı dendrogramlar hesaplamak için kullanılır.

Burada bir Campylobacter jejuni ssp yazarak MSPP iş akışını açıklar. Yedi suşları izole koleksiyonu doylei. Yedi suşları genetik çeşitlilik ortaya insan kaynaklı ve multilokus dizisi yazarak (MLST) vardı. MSPP yazarak yeterince onların rafi yansıtan yedi farklı MSPP dizisi türlerinde sonuçlandılogenetic ilişkiler.

C. jejuni ssp. MSPP Şema 2 ile 11 kDa kütle aralığı 14 farklı biyomarker iyonlarını çoğunlukla ribozomal proteinleri içerir doylei. MSPP ilke olarak, uzun bir seri dizi ile kütle spektrometrik platformlara uyarlanabilir. Bu nedenle, bu teknik zorlanma düzeyi mikrobiyal yazmak için kullanışlı bir araç olma potansiyeline sahiptir.

Giriş

Son on yılda, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) klinik mikrobiyoloji 1, 2 mikrobiyal cins ve türlerin tanımlanması için son derece değerli standart yöntem olarak ilerlemiştir. Türlere tanımlama sağlam hücreler veya hücre lizatları küçük protein parmak izi kayıt dayanır. Rutin klinik mikrobiyoloji kullanılan bir kütle spektrometresi için tipik kütle aralığı 2-20 kDa olduğunu. Buna ek olarak, sonuçta elde edilen spektrumlar aşağıda türlere suşları ve aşağıda alttür seviye 3 ayırmak için kullanılabilir. Ilk öncü çalışmalar, Campylobacter jejuni 4 suşları özel bir alt grubunun, Clostridium difficile, 5, Salmonella enterica SSP için özel biyomarker iyonları belirledik. serovar typhimurium 6, Staphylococcus aureus 7-9 ve E12 - scherichia 10 coli.

alel izoformları karşılık gelen birkaç değişken biyobelirteç kitlelerin kombinasyonu derin alttiplendirmesinde için seçenek sunar. Daha önce, başarılı bir C üzerinde kütle spektrometresi tabanlı phyloproteomics (MSPP) olarak adlandırılan anlamlı ve tekrarlanabilir phyloproteomic ilişkiler içine kitle profilleri bu varyasyonları dönüştürmek için bir yöntem uygulamaya jejuni ssp. jejuni izole koleksiyonu 13. MSPP multilokus sekansı yazarak (MLST) gibi bir DNA dizisi esas alt-tiplemesi tekniklerine kütle spektrometrik eşdeğer kullanılabilir.

Campylobacter türlerinin bakteriyel gastroenterit önde gelen nedeni, dünya çapında 14, 15 vardır. Campylobacteriosis enfeksiyon sonrası sekel bir sonucu olarak, yani, Guillain Barre sendromu, reaktif artrit ve iltihaplı bağırsak hastalığı 16 ortaya çıkabilir. Enfeksiyonun başlıca kaynaklarıdırtavuk, hindi, domuz, sığır, koyun ve ördekler, süt ve yüzey suyunun 15, 17 kontamine hayvan eti. Bu nedenle, gıda güvenliği bağlamında düzenli epidemiyolojik sürveyans çalışmalara ihtiyaç vardır. MLST Campylobacter türleri 18 için moleküler yazarak "altın standart" dır. MLST yöntemi göre Sanger sekanslama emek yoğun, zaman alıcı ve nispeten pahalı olduğu için, MLST yazarak nispeten küçük izole kohort sınırlıdır. Bu nedenle, daha ucuz ve daha hızlı alt-tiplemesi yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu ihtiyaç MSPP gibi kitle spektrometrik yöntemlerle bir araya olabilir.

Bu yazıda Campylobacter jejuni ssp bir koleksiyon kullanarak MSPP-yazmak için ayrıntılı bir protokol sunar. Doylei izolatları ve MLST ile potansiyel karşılaştırılması.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Biyogüvenlik Koşulları gözönüne alınarak Güvenli İşyeri hazırlayın

  1. mikroorganizmalar ile çalışmak için alaka olan laboratuvar ve güvenlik yönetmeliklerine aşina olmak. Çoğu insan patojen mikroorganizmalar, biyogüvenlik düzeyinde Salmonella serovar Typhi olarak 2 koşulları ancak bazı ele biyogüvenlik düzeyi www.cdc.gov/biosafety~~pobj ulaşılabilir her patojen taşıma düzeyine 3. bilgiler gerektirir gerekir.
  2. Belirli mikroorganizmanın biyolojik tehlike sınıflandırılması, atmadan önce otoklava gereken bulaşıcı atık olarak enfeksiyöz ajan ile temas geldi tüm malzemeleri görüyoruz. Tehlikeli Maddeler ve biyolojik maddeler için bölgesel güvenlik kurallarına uyun. potansiyel olarak kontamine olmuş malzemeler (biyolojik tehlikeler) derhal ve uygun bertarafı için bu uygun kaplara mevcut olduğundan emin olun.
  3. (Bu steril aletler (aşılama döngüler), çözümleri ve kültür ortamı sağlamakagar plakaları) bakteri kültürü başlamadan önce kullanılabilir.
  4. hemen bulaşıcı mikroorganizmaların dokunduktan sonra antiseptik sabun ve ılık su ile ellerinizi yıkayın.

2. Başvuru ve Koleksiyon izolatlar

  1. Seçin ve bir standart genom dizisi başvurusu elde ideal FASTA formatında kodlanmış proteom dizileri ile birlikte izole eder. Daha fazla genom dizisi suşlar varsa, analiz bu içerir.
    Not: Bu izolat / bu izolatların daha sonra kütle spektrometresi gözlenen kitle zirveleri kimliğini tahmin etmek için kullanılır olacaktır (bkz: bölüm 7).
  2. Seçin ve türler veya ilgi alttür soyoluşu kapsar şekilde potansiyel olarak çeşitli izolasyonlarını çeşitli elde edin.
    Not: Bu izolatlar daha sonra nüfusun biyomarkerların değişkenliği göstermek için kullanılacaktır (bakınız bölüm 8).
  3. Tüm toplama ve referans izolat (ler) yanlısı olduğundan emin olun20 - perly bu özel organizmanın 18 için ilgili altın standardına göre yazdınız.
    Bu (alt) -typing çeşitli yöntemler içerebilir, ancak büyük olasılıkla hala en mikrobiyal türlerin genetik çeşitliliği göstermek için standart bir yöntemdir MLST, başvuracağız: Not.
  4. Koleksiyonu içinde soyoluşu anlaması, MLST verileri 21 MEGA6 yazılımı aritmetik (UPGMA) ile ağırlıksız çifti grup yöntemi kullanılarak, örneğin yazarak verileri, bir phylogram hesaplayın. MLST veriler için aynı zamanda bir MLST veritabanı danışmak ve dizi türleri ve ilgili klonal kompleksleri 22 atayın.
    Not: Bu daha sonra daha önceki altın standart yazarak yöntemiyle (bölüm 9) ile MSPP ve congruency analiz etmek için kullanılır.

3. MALDI Hedef Plate hazırlayın

DİKKAT: TFA güçlü bir asittir. TFA hatalı kullanımı ciddi cilt yanıklarına, göz hasarı ve şiddetli tahriş o riskini taşımaktadırüst solunum yollarında f solunduğu takdirde. Bu nedenle, sıkı güvenlik önlemleri saygı duyulmalıdır ve koruyucu gözlük, yüz kalkanları, uygun eldiven, bot, hatta tam koruyucu elbise de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanımlar (KKD) TFA taşıma sırasında ihtiyaç vardır. TFA Olası maruz etkili egzoz havalandırma sistemi ile yeterli havalandırma altında madde ele tarafından kontrol edilmelidir. Yetersiz havalandırma durumunda, onaylı bir filtreli maske kullanılmalıdır gerekir. Ayrıca, TFA uzun ömürlü etkilerle sudaki yaşam için zararlıdır. Çevreye atık suda TFA herhangi salma kaçınılmalıdır.

Not: levha önceden kullanılan eğer bir MALDI hedef üzerine numuneler boyandıktan önce iyice hedef plakası temizleyin.

  1. 30 ml iyonu giderilmiş su ve 70 ml saf etanol kullanılarak 100 mi% 70 sulu etanol çözeltisi hazırlayın.
  2. 50 karıştırılarak% 80 sulu trifloroasetik asit (TFA) çözeltisi 250 ul hazırlanmasıdeiyonize su ve 200 ul bir reaksiyon tüpü içinde% 100 TFA ve 1 dakika boyunca tüp vorteks ul.
  3. oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika boyunca% 70 sulu etanol içinde bir cam tabak içine koyarak ve batırmak suretiyle MALDI hedef temizleyin.
  4. sıcak suyun altında hedef durulayın.
  5. Kağıt dokusu kullanılarak, önceki örnekleri ve diğer olası artıkları çıkarmak için% 70 sulu etanol çözeltisi ile yoğun bir şekilde hedef plakası silin.
  6. daha fazla temizlik gerekiyorsa kağıt dokusu ile silerken, sıcak suyun altında durulayın.
  7. % 80 ince bir tabaka sulu TFA ile hedef yüzeyini kaplayarak, kalıntı ve potansiyel görünmez kirleri çıkarmak (~ 100 96 noktalar başına ul) ve bir kâğıt havlu ile temizlemek tüm hedef pozisyonları silerek.
  8. Son olarak, asit kaldırmak bir kağıt mendil kullanarak kurulayın ve kalan sıvı buharlaşması oda sıcaklığında en az 15 dakika süreyle bırakın hedef durulayın.

Bir 4. hazırlanması45, bir dahili kalibrant İçeren Siyano-4-hidroksi-sinnamik asit matris solüsyon

  1. % 50 asetonitril,% 47.5 su ve% 2.5 TFA içeren bir karışım, 1 ml, 10 mg a-siyano-4-hidroksi-sinnamik asit (HCCA) eritilmesi ile doymuş bir matris çözeltisi hazırlayın. Çözelti doymuş rezidüel çözünmemiş HCCA kalır.
  2. bir iç kalibratörü olarak rekombinant insan insülini ekleyin. Bunun için, daha fazla kullanım için -20 ° C 'de% 50 sulu asetonitril, tablet ve deposunda 10 ug / ml bir son konsantrasyona kadar bir stok çözeltisi hazırlanır.

5. MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi

Not: ilgi organizmalar için özel kültür koşulları kullanılmalıdır. MALDI-TOF MS için numuneler, yayma hazırlama veya ekstraksiyon yoluyla hazırlanabilir, organizmaya bağlı olarak (bakınız bölüm 8.4.1 bakınız). etanol-formik asit ekstraksiyon yöntemi patojenlerin yeterli inaktivasyonuna sağlarken, yayma hazırlanması suff altında gerçekleştirilmelidirgerektiği gibi icient biyogüvenlik koşulları (bölüm 1). Genellikle, orada matris uygulamasından sonra enfeksiyon riski yoktur, ancak belirli patojenlere için özel inaktivasyon protokolleri gereklidir. Bu durumda, örneğin, Nocardia türleri MALDI-TOF MS kaynar su proteinlerin 23 etanolle çökeltme aşağıdaki bakterilerin mi parçalanması. EI Khéchine ve ark. Su ve% 0.5 Tween 20 ihtiva eden 24 vidalı kapaklı tüplerde 1 saat boyunca 95 ° C de bakteri kolonileri ısıtılması, Mikobakteri inaktivasyonu için bir prosedür geliştirilmiştir.

  1. smear hazırlanması
    1. doğrudan bir MALDI hedef plakası konumuna ( 'nokta') üzerine bakteri kolonisi bir toplu iğne başı büyüklüğünde yayıldı.
    2. İç kalibrant içeren HCCA düzenli matris veya matris 1 ul her nokta Yerleşimi ve oda sıcaklığında kristalize bırakın. Kalibrasyon zirvesinin tam kütlesinin belirlenmesi için, bir kontrol sp kaplaması1 ul Test Standard ve iç kalibrant içeren HCCA matris 1 ul ot.
      Not: Burada, Escherichia coli DH5a bir özü MALDI-TOF MS karakteristik bir protein parmak izi gösteriyor ki kullanılan test Standardı olarak. Bu saptanabilir kütle aralığının üst sınırını genişletmek iki protein ile çivili.
  2. Ekstraksiyon Yöntemi
    1. Hasat, 1.5 ml tepkime tüpü içinde yaklaşık beş bir aşılama halkası olan bir agar plaka kültüründen alınan koloniler ve iyice 300 ul askıya iki kez damıtılmış su. 900 ul mutlak etanol ekleyin ve bakteri kolonileri tamamen askıya alınır kadar tekrar pipetleme ile iyice karıştırın.
      Not: Bu adımda mümkündür ve de -20 ° C'de numune depolamak için oluşturulan. Buna ek olarak, patojenler inaktivasyonu optimal gelişim koşulları altında, inkübasyonu takiben, uygun bir agar plakası üzerine özü 1-10 ul çizgiler ile test edilebilir. başarılıAktivasyon mikrobiyal büyüme olmaması ile gösterilir.
    2. 1 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüjleyin supernatant atmak ve 10 dakika için oda sıcaklığında pelet kurutulur. ,% 70 formik asit içinde 50 ul yukarı ve aşağı pipetleme pelletini.
    3. asetonitril 50 ul ilave et ve karıştır. 2 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüjleme ile çöpleri çıkarın. Aktarım 1 MALDI hedef plaka örnek konumu üzerine yüzer ul ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kurumaya bırakın.
    4. İç kalibrant içeren HCCA matris 1 ul her nokta Yerleşimi ve oda sıcaklığında kristalize bırakın.
  3. Kütle spektrum kayıt
    Not: Tepe-toplama kütle spektrumları tavsiye edilen standart prosedürler kullanılarak yapılır (Geometrik algoritma; S / N oranı:. 2; rel Şiddeti eşiği:% 2; pik genişliği 3 m / z, bazal çıkarma: TopHat)
    1. üreticilerin protoc göre cihazı kalibreol.
    2. Her nokta için, 100-çekim adımlarla 600 spektrumları toplamak.
      1. kütle spektrometresi yapılandırma yazılımı "AutoXecute" sekmesine gidin. "Yöntem" butonuna ve açılan menüden yöntem örneğin, "MBT_AutoX" seçerek üzerine sol tıklayarak "Yöntem" açın.
      2. "AutoXecute Yöntemi Düzenleyicisi" açmak için "Yöntem" menüsünden "Düzenle ..." düğmesini sağa sola tıklayın. "Birikim" sekmesine gidin. "Özetleyin" değerini "600" ve _x_ "atış adımlar" değerine "100" "tatmin edici çekim" olarak ayarlayın.
  4. İç Spektrum Kalibrasyon Prosedürü
    Not: Dakika ölçüm hataları kütle spektrometresi doğasında vardır. Aralıklı aleti kullanmak gösterge sıcaklığı ve yeniden kalibrasyon bağlı olarak, elde edilen ölçüm değerleri, deneyler arasında değişebilir. Aşağıdaki öncesi ölçüm aleti kalibrasyonu ve bir iç kalibran sonrası ölçüm spektrum kalibrasyon arası spektrum karşılaştırılabilirliği sağlamak için en kesin yoludur.
    1. Her kalibrasyon tepe listesi için aşağıdaki prosedürleri uygulayın:
      1. Spektrum tarayıcısını başlatın (örn flexAnalysis ve açık spektrum:. Menü "Dosya" → "Aç ...")
      2. kalibrant zirve ile kitle kontrol listesi oluşturun: menü "Yöntem" → "Aç ...".
      3. yöntemi seçin: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Aç".
      4. Düzenleme Mass Control List: Tüm kalibranlarla işaretini kaldırın.
      5. altta kalibrant tepe ekleyin: Zirve Etiket: "Insulin_HIStag [M + H] + _ ort"; m_z "5808,29"; Tolerans [ppm]: "50"; Kalibrant onay kutusunu işaretleyin.
      6. Örneğin, "MSPP kalibrant listesi" olarak kaydedin.
    2. Her spektrum için, listeden kalibrant zirve seçin "Otomatik Assign" linkine tıklayın ve basın "Tamam".
ove_title "> 6. İç Kalibrasyon Prosedürü doğrulayın

  1. Deneysel Kalibrasyon Peak Tam Mass belirleyin.
    1. 1 ul Testi Standart her (adım 5.1.1) ile iki noktalar hazırlayın. 1 ul düzenli HCCA matrisi, 1 ul kalibrant-çivili matris ile ikinci ilk Yerleşimi.
    2. Her nokta (bölüm 5.3) kitle spektrumları elde ve içten Test Standard zirveleri (bölüm 5.4) kalibre.
    3. Spektrum tarayıcı ile onları açarak (örneğin, flexAnalysis ve açık spektrum: Menü "Dosya" → "Aç ...") hem spektrumları Yerleşimi beklenen kütlesinde tepe ve bulma (insülin m / z = 5,808.29), mevcut olmalıdır kalibrant-çivili spektrum değil normal matris ile elde edilen spektrumda.
  2. Kalibrant Tepe İlgi Organizmanın Herhangi Diğer biyobelirteci tarafından engellenemez olup olmadığını kontrol edin.
    1. Referans zorlanma ve ove iki noktalar (bölüm 5.1) hazırlayın1 ul düzenli matris, 1 ul kalibrant-çivili matris ile ikinci ilk rlay.
    2. Her iki noktalar kütle spektrumları (bölüm 5.3) Edinme ve spektrum tarayıcı ile açarak ortaya çıkan spektrumları bindirme (örneğin, flexAnalysis ve açık spektrum: Menü "Dosya" → "Aç ..."). kalibrant zirve çivili matris ile elde edilen ve başka komşu sinyal tarafından gizlenmiş değil spektrumunda açıkça görünür olduğundan emin olun. Bu durum söz konusu değilse, bu özel organizma için başka kalibrant seçin.
      Not: Bir kirpi iç kalibrant kullanarak önemli ölçüde biyobelirteç kitlelerin varyasyonlarını belirlemek için hassasiyet artar. Bu yöntem kullanılarak, 1 da aşağı doğru kütle farkı tespit edilebilir. Seçenek olarak ise, organizmalardan kaynaklanan da değişmeyen kütlelerin kalibranlarla olarak kullanılabilir. aksi ispat edilene kadar Ancak, tanımı gereği, bütün organizma kökenli kitleler, potansiyel olarak değişken kabul edilmelidir.

7. Referans Gerinim içinde Biyomarker İyonlar tespit

  1. İç kalibrant ile Matrix çivili kullanarak, Referans Strain Kütle Spektrumu ölçün.
    1. doğrudan bir MALDI hedef plakası konumuna ( 'nokta') üzerine bakteri kolonisi (bölüm 5.1) ya da bakteriyel protein ekstraktı (bölüm 5.2) 1 ul toplu iğne başı büyüklüğünde yayıldı.
    2. İç kalibrant içeren HCCA matris 1 ul her nokta Yerleşimi ve oda sıcaklığında (bölüm 5.1.2 / 5.2.4) de kristalize için hedef plakası bırakın.
    3. Referans suşu rekor kütle spektrumları (bölüm 5.3).
  2. Dahili referans kalibrant kütlesine spektrumu kalibre (burada: m / z = 5,806.29 insülini), ve daha sonra, taban çıkarma (TopHat) hem de (parametreler: SavitzkyGolay; genişliği: 2, m / z, 10 devir) ile, ön işlem.
    1. Örneğin, flexAnalysis ve açık spektrum spektrum tarayıcı (Başlat: Menü "Dosya" → "Aç ...; ").
    2. Yöntemi seçin: açılan menü "Metot" → "Aç ...", seçim yöntemi, örneğin, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Aç" sol tıklayın.
    3. açılan menüden "Kalibre" dan "Dahili ..." seçerek spektrum kalibre edin. Bir pencere kalibrant tepe (ler) (bölüm 5.4) listeleme açılır. "Tamam" tıklayın Sol → kalibrant tepe (İnsülin) Sol tıklayın. "Süreç" açılan menüden "Süreç spektrumları" seçiniz.
    4. Bazal çıkarma için sağ tarafta spektrum listesinde spektrumu etkinleştirin. Seç "Süreç" açılan menüden "Kütle Spektrumu Taban Çizgisi Çıkart".
    5. spektrum pürüzsüz, sağ tarafta spektrum listesinde spektrumu etkinleştirin. Seç "Süreç" açılan menüden "Kütle Spektrumu Taban Çizgisi Smooth".
  3. Referans suşu genom sıralama verilerinden, Teorik hesaplamakl monoizotopik bir dizi sıralaması düzenleyicisi kullanarak karşılık gelen amino asit dizisi, DNA dizisi tarafından kodlanan çeviri proteinlerin her birinin molekül ağırlığı. EXPASY Biyoinformatik Kaynak Portal (http://web.expasy.org/compute_pi/) de giriş kutusuna bu protein sekansı Kopya yapıştırın. ve basın / Mw pI hesaplamak için "burayı tıklayın". C. halinde jejuni ssp. doylei 14 saptanabilir biyomarkerların kütlesini hesaplamak.
  4. bir gen tanımlayıcı içeren sütun ve bir sonraki molekül ağırlığı, bir elektronik tabloya sonuçları kopyalayın. Sıralama hesaplanan molekül ağırlığı ile satır kitlelerin daha kolay arama kolaylaştırmak için. Not: Diğer sütunlar isteğe bağlıdır; Fonksiyonel açıklama daha sonra yorumlanması için özellikle faydalı olabilir.
  5. monoizotopik molekül ağırlığı 135 Da çıkarılarak de-methioninated formunun molekül ağırlığı için hesap tablosu, içine ikinci bir sütun ekleyin. Not: Bazı proteinler yazı geçmesi nedeniN-terminal metionin proteolitik ayrılmasıyla modifikasyon.
  6. (Tablo 1) yukarıda hazırlanan genom tablosundan ölçülen kitle bakarak referans suşu hesaplanan kitlelere her önemli ölçülen biyomarker kitle atayın.
  7. Biyomarker iyonları tahmin gen ürünlerinin tahsis edilemiyorsa, vb diğer posttranslasyonel değişiklikler (metilasyon, asetilasyon, prenilasyonu, düşünün; değişikliklerin bir derleme ve bağlantılı kütle değişiklikleri http://www.abrf.org/delta-mass bakın ). Sık sık ilgi organizmalarda gözlenen diğer bilinen posttranslasyonel modifikasyonu tabloya başka bir sütun eklemek ve de-methioninated formu sürecine benzer moleküler ağırlığı yeniden hesaplamak için.
  8. başka bir elektronik tablo sekmesini kurmak ve ayrı bir tablo sütununda kütle ve tanımlayıcı iyon her biyobelirteci kaydedin.

8. Biyomarker Değişkenliği değerlendirinNüfus

  1. koleksiyonundan elde edilen kütle spektrumları kalibre referans suşu (ler) (bölüm 5.4.2) için yapıldığı gibi, izole eder.
  2. kütle spektrumları varyant biyobelirteçleri belirleyin. Bir varyant kütle referans spektrumu ve referans mevcut olmayan yeni bir kütle ortaya bilinen bir kütle olmaması ile karakterize edilir. Kütle farkı tek bir amino asit değişimi (Tablo 2), veya bunların bir kombinasyonu uygun olmalıdır.
  3. satır başına bir izolat, her biyolojik belirteç ve ilgili tablo sütunlarında tahmin izoformu için ölçülen kitle kaydedin.
    Not: Nadiren, bazı kitle vardiya hem örneğin, birkaç farklı amino asit değişimleri atfedilebilecek olabilir, N D alışverişinde ve Q E tarafından alışverişinde ve tersi, 0.985 Da (Tablo 2) bir kitle kayma ile sonuçlanır. Bu içsel sorun tek başına kütle spektrometresi ile çözülemez. Bu nedenle, protein sekansı düzeyinde farklı izoformlar, aynı kütleye sahip olanTek bir MSPP türü olarak tedavi edilmelidir. Özellikle biyomarker iyon genlerinin Paralel Sanger dizileme C MSPP-yazarken bu sorun ortaya olmadığını doğruladı jejuni ssp. doylei Bu çalışmada kullanılan toplama izole eder.
  4. PCR yükseltilmesi ve ilgili biyomarker genleri sıralanmasıyla yeni MSPP türlerini onaylayın. Buna karşılık, bu da biyobelirtecin kimliğin düzgün atanmıştır teyidi olarak hizmet vermektedir.
    1. Kültür bakteriyel optimal gelişim koşulları altında izole eder. Kültür C. jejuni ssp. mikroaerofilik koşullar altında (% 5 O2,% 10 CO2,% 85 N2) altında 37 ° C de,% 5 koyun kanı ile takviye edilmiş Columbia agar suşları doylei. takriben inkübe 48 saat. Her çapraz bulaşmayı önlemek için izole için ayrı bir agar plaka kullanın.
    2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir DNA ekstraksiyon kiti / otomatik makinelerle izolatların genomik DNA ekstrakte edin.
      3. <. li> Tablo 3'te listelenen primerler kullanılarak ilgili biyomarker genleri yükseltin Tüm PCR, aşağıdaki koşullar altında reaksiyonları gerçekleştirmek: 30 saniye için 94 ° C 'de denatürasyon, 30 saniye için 55 ° C 'de tavlama; 30 saniye için 72 ° C 'de uzama.
    3. genomik DNA, uygun bir miktarda kullanarak Sanger sekanslama her amplikon DNA sekansını belirlemek genellikle şu şekilde yapılır ve amplifikasyon primerlerinin bir ((DNA, genellikle 600-700 ng bir yaklaşık 100 ng / ul konsantrasyonda yeterlidir) bir servis sağlayıcının kullanımı).
  5. Ayrı bir tabloda (Tablo 4) uygun bir çeviri aracı (örneğin, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) kullanarak her yeni izoformu için azaltılmış protein dizisi kayıt 25.

9. MSPP tabanlı Filojeniyi hesaplayın ve Altın Standardı Karşılaştırması

  1. Özellikle biyomarker amino asit dizileri t ait bitiştirmekBöyle Bioedit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 veya biyobelirteç elektronik tablosu gibi bir dizi hizalama editörü kullanarak bir sürekli dizisine izolatların, bir o MSPP türü.
  2. Altın standart yazarak verileri, örneğin, UPGMA kümeleme 21 yapıldığı gibi kümelenme ile soyoluşu hesaplayın.
  3. Altın standart 4, 13 ile elde edilen birine MSPP tabanlı filogeni karşılaştırın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Daha önce, başarılı C için bir MSPP düzeni kurulmuş jejuni ssp. 13 jejuni. Burada, biz kardeş C alttür yöntemi uzatmak amaçlanmıştır jejuni ssp. doylei. Bu özel ortamda, yedi C. jejuni ssp. doylei izolatları / Laboratuvarı Mikrobiyoloji UGent BCCM / LMG Ghent, Belçika mikroorganizmaların Belçika koleksiyonundan elde edilmiştir. Bizim analizler için kullanılan tüm yedi izolatının i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bir MSPP düzeni kurulması en kritik adım biyomarkır iyon kimliklerin kesin genetik belirlenmesidir. Hiç şüphesiz bir biyobelirteç tanımlamak mümkün değilse, o zaman düzeni 13 uzak tutulmalıdır.

C. jejuni ssp. doylei Şema 14 farklı biyomarker iyonları içerir. Bu 5 daha C'ye göre olan saptanabilir C arasında jejuni ssp. jejuni MSPP şeması 13 hayranlarıyla en önemli fark jejuni ssp....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

We are grateful to Hannah Kleinschmidt for excellent technical support. This paper was funded by the Open Access support program of the Deutsche Forschungsgemeinschaft and the publication fund of the Georg August Universität Göttingen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
acetonitrileSigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany34967
Autoflex III TOF/TOF 200 systemBruker Daltonics, Bremen, GermanyGT02554 G201Mass spectrometer
bacterial test standard BTSBruker Daltonics, Bremen, Germany604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Germany263564Software Package
Bruker IVD Bakterial Test StandardBruker Daltonics, Bremen, Germany82901905 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8843ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG7790ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8871NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8870NCTC A613/87
Columbia agar base Merck, Darmstadt, Germany1.10455 .0500500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Germany251419Software Package
defibrinated sheep blood Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, GermanySR0051
ethanolSigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany02854 Fluka
formic acidSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyF0507
HCCA matrixBruker Daltonics, Bremen, Germany604531
Kimwipes paper tissueKimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyZ188956
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, Bremen, Germany259935Software Package
Mast Cryobank vialsMast Diagnostica, Reinfeld, GermanyCRYO/B
MSP 96 polished steel targetBruker Daltonics, Bremen, Germany224989
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany51304
recombinant human insulinSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyI2643
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyT6508
water, molecular biology-gradeSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyW4502

Referanslar

  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247(2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004(2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924(2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86(2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720(2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 116MALDI TOFa a da t rlerin farkl la masphyloproteomicsICMSCampylobacter jejuni Ssp doyleiMSPPmikrobiyoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır