sottotipizzazione di<em&gt; Jejuni Campylobacter</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolati Utilizzando PhyloProteomics Spettrometria di Massa-based (MSPP)

Riepilogo

Massa phyloproteomics spettrometria-based (MSPP) è stato utilizzato per digitare una collezione di Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolati a livello di sforzo rispetto a tipizzazione sequenza multilocus (MLST).

Abstract

MALDI-TOF MS offre la possibilità di differenziare alcuni batteri non solo a livello di specie e sottospecie ma anche al di sotto, a livello di ceppo. isoforme alleliche del ioni biomarcatori rilevabili provocano spostamenti di massa specifico per isolare. phyloproteomics spettrometria di massa a base di (MSPP) è una tecnica innovativa che combina le spettrometria di massa masse biomarcatori rilevabili in uno schema che consente la deduzione delle relazioni phyloproteomic da isolare specifici turni di massa rispetto a un genoma sequenziato ceppo di riferimento. Le sequenze di amminoacidi dedotta vengono poi utilizzati per calcolare dendrogrammi MSPP-based.

Qui si descrive il flusso di lavoro di MSPP digitando un ssp Campylobacter jejuni. Doylei raccolta isolato di sette ceppi. Tutti e sette i ceppi erano di origine umana e multilocus sequenza di battitura (MLST) dimostrato la loro diversità genetica. MSPP-tipizzazione portato a sette diversi tipi di sequenze MSPP, sufficientemente che riflette la loro PHYrelazioni logenetic.

Il C. jejuni ssp. doylei schema MSPP comprende 14 diversi ioni biomarker, proteine soprattutto ribosomiali nel range di massa di 2 a 11 kDa. MSPP può in linea di principio, essere adattato ad altre piattaforme di spettrometria di massa con una gamma di massa estesa. Pertanto, questa tecnica ha il potenziale per diventare uno strumento utile per la tipizzazione microbica livello di deformazione.

Introduzione

Durante l'ultimo decennio, matrix-assisted laser desorbimento di ionizzazione tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) ha avanzato ad essere un metodo standard di grande valore per il genere microbica e l'identificazione delle specie in microbiologia clinica ^{1, 2.} identificazione di specie si basa sulla registrazione di piccole impronte proteici di cellule intatte o lisati cellulari. La gamma di massa tipico di uno spettrometro di massa usata nella routine microbiologia clinica è 2-20 kDa. Inoltre, gli spettri risultante può essere utilizzato per discriminare ceppi ai sotto-specie e sotto-sottospecie livello ^3. I primi studi pionieristici hanno identificato specifici ioni biomarker per un particolare sottogruppo di ceppi di Campylobacter jejuni ^{4, 5} Clostridium difficile, Salmonella enterica ssp. enterica sierotipo Typhi ^6, Staphylococcus aureus ^7-9, ed Escherichia coli ^{10 - 12.}

La combinazione di diverse masse biomarker variabili corrispondenti alle isoforme alleliche offre la possibilità per il sottotipo più profondo. In precedenza, abbiamo implementato con successo un metodo per convertire queste variazioni nei profili di massa nelle relazioni phyloproteomic significative e riproducibili chiamate di massa phyloproteomics basate spettrometria (MSPP) su un C. jejuni ssp. collezione jejuni isolare ^13. MSPP può essere utilizzato una spettrometria di massa equivalente alle tecniche basate sottotipizzazione sequenza del DNA, come la tipizzazione sequenza multilocus (MLST).

Specie Campylobacter sono la principale causa di gastroenterite batterica in tutto il mondo ^{14, 15.} Come conseguenza di Campilobatteriosi sequela post-infettive, cioè, sindrome di Guillain Barre, artrite reattiva e la malattia infiammatoria intestinale può sorgere ^16. Le principali fonti di infezione sonodi carni animali contaminati da pollo, tacchino, suino, bovino, ovino e le anatre, il latte e di superficie ^{15, 17.} Pertanto, sono necessari studi di sorveglianza epidemiologica regolari nel contesto della sicurezza alimentare. MLST è il "gold standard" nella tipizzazione molecolare per le specie Campylobacter ^18. Poiché il Sanger-sequenziamento metodo MLST base è alta intensità di lavoro, che richiede tempo e relativamente costosa, MLST digitazione è limitata a relativamente piccole coorti isolare. Pertanto, vi è la necessità di metodi sottotipizzazione più economico e rapido. Questa esigenza potrebbe essere soddisfatta con metodi di spettrometria di massa come MSPP.

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per MSPP-tipizzazione mediante una raccolta di Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolati e il confronto delle sue potenzialità con MLST.

Protocollo

1. Preparare un ambiente di lavoro sicuro, considerando biosicurezza Condizioni

1. Acquisire familiarità con le norme di laboratorio e di sicurezza che sono di rilevanza per l'utilizzo di microrganismi. La maggior parte dei microrganismi patogeni umani devono essere gestite a livello di biosicurezza 2 condizioni, ma alcuni, come la Salmonella enterica sierotipo Typhi, richiedono livello di biosicurezza 3. Informazioni sul livello di gestione di ogni agente patogeno si può accedere a www.cdc.gov/biosafety.
2. Indipendentemente dalla classificazione di rischio biologico del microrganismo specifico, considerare tutti i materiali che al contatto con l'agente infettivo come rifiuti infettivi che devono essere autoclave prima dello smaltimento. Rispettare le linee guida di sicurezza regionali per materiali pericolosi e sostanze biologiche. Garantire che i contenitori adatti per lo smaltimento immediato e corretto di materiali potenzialmente contaminati (rischi biologici) sono disponibili.
3. Garantire che gli strumenti sterili (loop inoculazione), soluzioni e terreni di coltura (piastre di agar) sono disponibili prima di iniziare la coltura batterica.
4. Lavare le mani con sapone antisettico e acqua calda subito dopo aver maneggiato microrganismi infettivi.

2. Selezionare di riferimento e la raccolta Isolati

1. Selezionare e ottenere uno standard di riferimento del genoma sequenziato-isolare insieme con le sequenze del proteoma codificato, idealmente in formato FASTA. Se più ceppi genoma sequenziato sono disponibili, includerli nell'analisi.
   Nota: Questo isolato / questi isolati saranno successivamente essere utilizzato per prevedere l'identità dei picchi di massa osservati in spettrometria di massa (vedi sezione 7).
2. Selezionare e ottenere una serie di potenziali diversi isolati in modo tale da coprire l'filogenesi della specie o sottospecie di interesse.
   Nota: Questi isolati saranno in seguito utilizzati per dimostrare la variabilità dei biomarcatori nella popolazione (vedi sezione 8).
3. Assicurarsi che l'intera collezione e isolato di riferimento (s) sono proPerly digitato dal rispettivo gold standard per questo particolare organismo ^{18 - 20.}
   Nota: Questo può includere una varietà di (sotto) i metodi -typing, ma è probabile che ricorrere a MLST, che è ancora il metodo standard per dimostrare la diversità genetica della maggior parte delle specie microbiche.
4. Per inferire la filogenesi all'interno della collezione, calcolare un phylogram dai dati di battitura, ad esempio, utilizzando il metodo non ponderata gruppo coppia con media aritmetica (UPGMA) nel software per i dati MEGA6 MLST ^21. Per i dati MLST, consultare anche un database MLST e assegnare tipi di sequenze e rispettivi complessi clonali ^22.
   Nota: Questo sarà successivamente essere utilizzato per analizzare la congruenza del MSPP con il metodo di tipizzazione gold standard in precedenza (vedi paragrafo 9).

3. Preparare una piastra MALDI target

ATTENZIONE: TFA è un acido forte. L'uso improprio di TFA si assume il rischio di ustioni della pelle, danni agli occhi e grave irritazione of tratto respiratorio superiore se inalato. Pertanto, le misure di sicurezza rigorose devono essere rispettati e è necessario un equipaggiamento di protezione individuale (DPI) tra cui occhiali di sicurezza, visiere, guanti, stivali adeguati, o addirittura una tuta protettiva completa, durante la manipolazione TFA. Possibile esposizione a TFA deve essere controllato da manipolazione della sostanza sotto una ventilazione adeguata con un sistema di ventilazione di scarico efficace. In caso di ventilazione insufficiente, deve essere utilizzato un respiratore con filtro approvato. Inoltre, TFA è nocivo per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. Qualsiasi rilascio di TFA nelle acque reflue per l'ambiente deve essere evitata.

Nota: Prima di individuare i campioni su un bersaglio MALDI, pulire la piastra segnale a fondo se la piastra è stata utilizzata in precedenza.

1. Preparare la soluzione acquosa di etanolo al 100 ml di 70% con 30 ml di acqua deionizzata e 70 ml di etanolo puro.
2. Preparare 250 ml di acido trifluoroacetico acquosa all'80% di soluzione (TFA) mescolando 50ml di acqua deionizzata e 200 microlitri 100% TFA in un tubo di reazione e vortex la provetta per 1 min.
3. Pulire la porta MALDI mettendolo in un piatto di vetro e submersing in etanolo acquoso al 70% per circa 5 min a temperatura ambiente.
4. Risciacquare il bersaglio sotto l'acqua calda.
5. Usando un fazzoletto di carta, pulire la piastra segnale intensamente con il 70% in soluzione acquosa di etanolo per rimuovere tutti i campioni precedenti e altri detriti potenziale.
6. Se è necessaria una pulizia più approfondita, sciacquare con acqua calda mentre asciugandosi con un fazzoletto di carta.
7. Rimuovere i contaminanti residui, e potenzialmente invisibili,, coprendo la superficie di destinazione con un sottile strato di 80% acquosa TFA (~ 100 ml per 96 punti) e pulire tutte le posizioni di destinazione pulite con un fazzoletto di carta.
8. Infine, sciacquare l'obiettivo di eliminare l'acido, asciugarlo con un fazzoletto di carta, e lasciarlo per almeno 15 minuti a temperatura ambiente per far evaporare il liquido residuo.

4. Preparazione di45; ciano-4-idrossi-cinnamico Matrix soluzione acida contenente un Calibrant interno

1. Preparare una soluzione di matrice satura sciogliendo 10 mg α-ciano-4-idrossi-cinnamico acido (HCCA) in 1 ml di una miscela di 50% acetonitrile, acqua 47,5% e 2,5% TFA. Residuo indisciolto HCCA rimarrà se la soluzione è satura.
2. Aggiungere insulina umana ricombinante come un calibrante interna. Per questo, preparare una soluzione madre ad una concentrazione finale di 10 pg / ml nel 50% acquosa acetonitrile, aliquotare e conservare a -20 ° C per un ulteriore uso.

5. MALDI-TOF spettrometria di massa

Nota: è necessario utilizzare specifiche condizioni di coltura per i microrganismi di interesse. I campioni per MALDI-TOF MS possono essere preparati mediante preparazione striscio o di estrazione, a seconda del microrganismo (vedere la sezione 8.4.1). Mentre il metodo di estrazione di acido formico etanolo-fornisce sufficienti inattivazione degli agenti patogeni, la preparazione striscio deve essere eseguita sotto suffcondizioni di biosicurezza icient come richiesto (vedi capitolo 1). Di solito, non vi è alcun rischio di infezione dopo l'applicazione della matrice, ma per patogeni specifici sono richiesti protocolli specifici inattivazione. Così, per esempio MALDI-TOF MS di specie Nocardia richiede precedente lisi dei batteri in acqua bollente, seguito da precipitazione in etanolo di proteine ^23. EI Khéchine et al. sviluppato un procedimento per l'inattivazione di micobatteri, riscaldando le colonie batteriche a 95 ° C per 1 ora in provette con tappo a vite contenenti acqua e 0,5% Tween 20 ^24.

1. Smear Preparazione
   1. Stendere una quantità capocchia di spillo dimensioni di una colonia batterica direttamente su una posizione piastra segnale MALDI ( 'spot').
   2. Sovrapposizione ogni punto con 1 ml di HCCA matrice regolare o matrice contenente il calibrante interna e lasciare cristallizzare a temperatura ambiente. Per la determinazione della massa esatta del picco di calibrazione, sovrapporre un sp di controlloOT con 1 ml di prova standard e 1 ml di matrice HCCA che contiene il calibrante interna.
      Nota: Qui, come prova standard un estratto di Escherichia coli DH5 alfa viene utilizzato che dimostra un'impronta digitale proteina caratteristica MALDI-TOF MS. Si è drogata con due proteine ​​che estendono il limite superiore del range di massa rilevabile.
2. Metodo di estrazione
   1. Harvest circa cinque colonie da una cultura piastra di agar con un ciclo di inoculo e accuratamente sospendere in 300 ml di acqua bidistillata in una provetta da 1,5 ml di reazione. Aggiungere 900 ml di etanolo assoluto e mescolare bene pipettando ripetutamente fino a quando le colonie batteriche sono completamente sospese.
      Nota: A questo punto è possibile e ben stabilito conservare i campioni a -20 ° C. Inoltre, l'inattivazione degli agenti patogeni può essere testato strisciando 1-10 ml di estratto su una piastra di agar adatto a seguito di incubazione a condizioni di crescita ottimali. successo inattivazione è indicato dall'assenza di crescita microbica.
   2. Centrifugare il campione a 13.000 xg per 1 minuto, scartare il surnatante, e asciugare il pellet a temperatura ambiente per 10 minuti. Risospendere il pellet accuratamente pipettando su e giù in 50 ml di acido formico al 70%.
   3. Aggiungere 50 ml di acetonitrile e mescolare. Rimuovere i detriti per centrifugazione a 13.000 xg per 2 min. Trasferimento 1 ml di surnatante SU UN posizione del campione su una piastra segnale MALDI e lasciare asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Sovrapposizione ogni punto con 1 ml di matrice HCCA che contiene il calibrante interna e lasciare cristallizzare a temperatura ambiente.
3. La registrazione della Messa Spectra
   Nota: Picco-picking da spettri di massa viene fatto usando le procedure standard consigliate (algoritmo Centroide; Rapporto S / N:. 2; rel soglia Intensità: 2%; larghezza del picco di 3 m / z, sottrazione della linea di base: TopHat)
   1. Calibrare lo strumento secondo ProtoC dei costruttoriolo.
   2. Per ogni punto, raccogliere 600 spettri in 100 colpi passi.
      1. Vai alla scheda "AutoXecute" del software di configurazione dello spettrometro di massa. Aprire il "Metodo" di sinistra-clic sul pulsante "Metodo" e la scelta del metodo ad esempio, "MBT_AutoX" dal menu a tendina.
      2. Sinistro del mouse con il tasto destro "Modifica ..." del menu "Metodo" per aprire la "AutoXecute Method Editor". Vai alla scheda "accumulazione". Impostare la "somma up" valore "600" ed i "colpi soddisfacenti" _X_ "passi Shot" valore "100".
4. Spectrum interno Procedura di calibrazione
   Nota: gli errori di misurazione Minute sono inerenti alla spettrometria di massa. A seconda dell'uso strumento intermittente, temperatura dello strumento e ri-calibrazione, i valori di misurazione ottenuti possono variare tra esperimenti. Dopo la calibrazione dello strumento di pre-misurazione e post-misurazione di calibrazione spettro di un calibrante interna è il modo più preciso per garantire inter-spettro comparabilità.
   1. Eseguire le seguenti procedure per ogni lista di picco di taratura:
      1. Inizia spettro browser (ad esempio, flexAnalysis e lo spettro aperto:. Menu "File" → "Apri ...")
      2. Crea elenco di controllo di massa con calibrante picco: menu "Method" → "Apri ...".
      3. Scegli il metodo di: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Apri".
      4. Modifica Mass Control List: deselezionare tutte le calibranti.
      5. Aggiungere Calibrant picco a fondo: Etichetta di punta: "Insulin_HIStag [M + H] + _ avg"; m_z: "5.808,29"; Tolleranza [ppm]: "50"; Controllare casella Calibrant.
      6. Salva come, ad esempio, "lista calibrante MSPP".
   2. Per ogni spettro, scegli il picco calibrante dalla lista, fare clic su "Assegna automatica" e premere "OK".

ove_title "> 6. Verificare la procedura di calibrazione interno

1. Sperimentalmente determinare la massa esatta del picco di calibrazione.
   1. Preparare due punti con 1 ml di prova standard ciascuna (fase 5.1.1). Sovrapporre il primo con 1 ml di matrice regolare HCCA, la seconda a matrice calibrante-spillo 1 ml.
   2. Ottenere spettri di massa da ogni punto (paragrafo 5.3), e calibrare internamente per i picchi di test standard (sezione 5.4).
   3. Sovrapporre entrambi gli spettri aprendole con il browser dello spettro (ad esempio, flexAnalysis e lo spettro aperto: menu "File" → "Apri ...") e trovando il picco a La massa prevista (insulina m / z = 5,808.29), che dovrebbe essere presente in lo spettro calibrante-spillo, ma non nello spettro ottenuto con la matrice regolare.
2. Verificare che il Calibrant Peak non è oscurate da altre Biomarker del Organismo di interesse.
   1. Preparare due punti (paragrafo 5.1) con il ceppo di riferimento e overlay il primo con 1 ml di matrice regolare, la seconda a matrice calibrante-spillo 1 ml.
   2. Acquisire spettri di massa da entrambi i punti (paragrafo 5.3) e sovrapporre gli spettri risultante aprendole con il browser dello spettro (ad esempio, flexAnalysis e lo spettro aperto: menu "File" → "Apri ..."). Assicurarsi che il picco calibrante è chiaramente visibile nello spettro ottenuto con la matrice spillo e non oscurata da un altro segnale adiacenti. Se questo non è il caso, scegliere un'altra calibrante per questo particolare organismo.
      Nota: Utilizzando un calibrante interna spillo aumenta notevolmente la precisione per determinare le variazioni delle masse biomarker. Utilizzando questo metodo, le differenze di massa fino a 1 Da possono essere rilevati. In alternativa, anche masse invarianti provenienti dagli organismi possono essere utilizzati come calibratori. Tuttavia, per definizione, tutte le masse organismo di derivazione devono essere considerati potenzialmente variabile, fino a prova contraria.

7. Identificare biomarcatori ioni nel ceppo di riferimento

1. Misurare la massa spettro del ceppo di riferimento, Usare Matrix spillo con il Calibrant interno.
   1. Stendere una quantità capocchia di spillo dimensioni di una colonia batterica (paragrafo 5.1) o di 1 ml di estratto di proteine ​​batteriche (paragrafo 5.2) direttamente su una posizione piastra segnale MALDI ( 'spot').
   2. Sovrapposizione ogni punto con 1 ml di matrice HCCA che contiene il calibrante interna e lasciare la piastra segnale a cristallizzare a temperatura ambiente (sezione 5.1.2 / 5.2.4).
   3. spettri Record massa del ceppo di riferimento (paragrafo 5.3).
2. Internamente calibrare lo spettro di riferimento alla massa calibrante (qui: insulina a m / z = 5,806.29), e successivamente pre-processo per sottrazione della linea di base (TopHat) e levigante (parametri: SavitzkyGolay; larghezza: 2 m / z, 10 cicli).
   1. Avviare il browser spettro (ad esempio, flexAnalysis e lo spettro aperto: menu "File" → "Apri ...; ").
   2. Scegli il metodo di: menu a tendina "Metodo" → "Apri ...", sinistro del mouse il metodo di scelta, ad esempio, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Apri".
   3. Calibrare spettro scegliendo "interno ..." dal menu a tendina "Calibra". Si apre una finestra che elenca il picco calibrante (s) (sezione 5.4). Sinistro del mouse il picco calibrante (insulina) → Sinistra-clic su "OK". Scegliere "spettri di processo" dal menu a tendina "Processo".
   4. Per sottrazione basale installa lo spettro nell'elenco spettro sul lato destro. Scegliere "Sottrarre Spettro di massa di base" dal menu a tendina "Processo".
   5. Per smussare lo spettro, attivare la spettro nell'elenco spettro sul lato destro. Scegliere "Smooth Spettro di massa di base" dal menu a tendina "Processo".
3. Dai dati sequenziamento del genoma del ceppo di riferimento, il calcolo del Theoretical monoisotopico peso molecolare di ciascuna delle proteine ​​codificate da tradurre la sequenza di DNA nella sequenza amminoacidica corrispondente utilizzando un editor di allineamento di sequenze. Copia-incolla questo sequenza della proteina nella casella di input al portale ExPASy Bioinformatica Resource (http://web.expasy.org/compute_pi/). e premere il tasto "Clicca qui" per calcolare pi / Mw. Nel caso di C. jejuni ssp. doylei calcolare la massa di 14 biomarcatori rilevabili.
4. Copiare i risultati in un foglio, con una colonna contenente l'identificatore gene e la successiva il peso molecolare. Ordina le righe in peso molecolare calcolata per facilitare la semplice ricerca delle masse. Nota: altre colonne sono opzionali; annotazione funzionale può essere particolarmente utile in seguito per l'interpretazione.
5. Inserire una seconda colonna nel foglio di calcolo del peso molecolare della forma de-methioninated, sottraendo 135 Da dal peso molecolare monoisotopico. Nota: Questo è perché alcune proteine ​​subiscono postaletraduzionali mediante rimozione proteolitica della metionina -Terminal N.
6. Assegnare ogni grande massa biomarker misurato alle masse calcolati dal ceppo di riferimento, cercando la massa misurata dalla tabella genoma preparata sopra (Tabella 1).
7. Se gli ioni biomarker non possono essere assegnati ai prodotti genici previsti, in considerazione altre modificazioni post-(metilazione, acetilazione, prenilazione, ecc; vedere http://www.abrf.org/delta-mass per una raccolta di modifiche e cambiamenti di massa associati ). Per qualsiasi altro noto modificazione post-traslazionale che è frequente negli organismi di interesse aggiungere un'altra colonna alla tabella e ricalcolare il peso molecolare analogo al processo per la forma de-methioninated.
8. Impostare un'altra scheda foglio di calcolo, e registrare per ogni biomarker ioni la massa e l'identificatore in una colonna tabella separata.

8. Valutare Biomarker Variabilitànella popolazione

1. Calibrare spettri di massa ottenuti dalla raccolta isolati, come fatto per il ceppo di riferimento (s) (sezione 5.4.2).
2. Identificare biomarcatori variante negli spettri di massa. Una massa variante è caratterizzata dall'assenza di una massa nota dallo spettro di riferimento e l'aspetto di una massa romanzo non presenti nel riferimento. La differenza di massa deve essere conforme ad un singolo scambio amminoacido (Tabella 2), o una loro combinazione.
3. A un isolato per riga, registrare la massa misurata per ogni biomarker e l'isoforma previsto nelle rispettive colonne della tabella.
   Nota: Raramente, alcuni spostamenti di massa possono essere attribuibili a diversi scambi aminoacidi differenti, ad esempio, sia, N scambiato da D e Q scambiato da E, e viceversa, comporta uno spostamento massa di 0.985 Da (Tabella 2). Questo problema intrinseco non può essere risolto mediante spettrometria di massa da solo. Pertanto, diverse isoforme a livello di sequenza proteina avente la stessa massadevono essere trattati come un unico tipo MSPP. Parallel Sanger sequenziamento dei geni particolari ioni biomarker confermato che questo problema non si è verificato mentre MSPP-digitando il C. jejuni ssp. doylei isolare raccolta utilizzato in questo studio.
4. Confermare nuovi tipi MSPP di PCR-amplificazione e sequenziamento dei rispettivi geni biomarker. A sua volta, questo serve anche come la conferma che l'identità biomarker è stato assegnato correttamente.
   1. Coltura batterica isola in condizioni di crescita ottimali. Cultura C. jejuni ssp. doylei ceppi su Columbia agar integrato con sangue di pecora 5% a 37 ° C in condizioni microaerofili (5% O _2, il 10% di CO _2, 85% N _2). Incubare per ca. 48 hr. Utilizzare una piastra di agar separato per ogni isolato per evitare la contaminazione incrociata.
   2. Estrarre il DNA genomico degli isolati batterici utilizzando un macchinario adeguato kit di estrazione del DNA / automatico in base alle istruzioni del produttore.
   3. amplificano i rispettivi geni biomarker utilizzando i primer elencati nella tabella 3 Eseguire tutte le reazioni PCR nelle seguenti condizioni:. denaturazione a 94 ° C per 30 sec; annealing a 55 ° C per 30 sec; allungamento a 72 ° C per 30 sec.
   4. Determinare la sequenza di DNA di ciascun amplicone da Sanger sequenziamento utilizzando una quantità appropriata di DNA genomico (di solito 600-700 ng di DNA è sufficiente ad una concentrazione di circa 100 ng / ml) e uno dei primer di amplificazione (solitamente ciò avviene uso di un fornitore di servizi).
5. In una tabella separata (vedi tabella 4), registrare la sequenza della proteina dedotta per ogni romanzo isoforma utilizzando uno strumento di traduzione appropriata (ad esempio, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) ^25.

9. Calcolare una filogenesi MSPP-based e confronta con il Gold Standard

1. Concatenare i particolari sequenze di amminoacidi biomarker che appartiene a tegli MSPP tipo degli isolati in una sequenza continua utilizzando un editor di allineamento di sequenze, come BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) ²⁶ o il foglio di calcolo biomarker.
2. Calcolare filogenesi per il clustering, come fatto per i dati di tipizzazione gold standard, ad esempio, il clustering UPGMA ^21.
3. Confrontare la filogenesi MSPP-based a quella ottenuta con il gold standard ^{4, 13.}

Risultati

In precedenza, abbiamo stabilito con successo un sistema di MSPP per C. jejuni ssp. jejuni ^13. Qui, abbiamo voluto estendere il metodo per il fratello sottospecie C. jejuni ssp. doylei. In questo contesto specifico, sette C. jejuni ssp. doylei isolati sono stati acquisiti dalla collezione belga di microrganismi / Laboratorio di Microbiologia UGent BCCM / LMG Gand, in Belgio. Tutti i sette isolati utilizzati per le nostre an...

Discussione

La fase più critica nella creazione di un sistema MSPP è la determinazione genetica inequivocabile di identità biomarker di ioni. Se non è possibile identificare un biomarker senza dubbio, allora dovrebbe essere escluso dal regime ^13.

Il C. ssp. doylei schema jejuni comprende 14 diversi ioni biomarker. Questi sono 5 meno rispetto al C. jejuni ssp. schema jejuni MSPP ¹³ .La differenza più significativa tra il rilevabile <...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	GT02554 G201	Mass spectrometer
bacterial test standard BTS	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	604537
BioTools 3.2 SR1	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	263564	Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8290190	5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG8843	ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG9143	Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG7790	ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG9243	Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG8871	NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG9255	Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG8870	NCTC A613/87
Columbia agar base	Merck, Darmstadt, Germany	1.10455 .0500	500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	251419	Software Package
defibrinated sheep blood	Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany	SR0051
ethanol	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	02854 Fluka
formic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	F0507
HCCA matrix	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	604531
Kimwipes paper tissue	Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	Z188956
MALDI Biotyper 2.0	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	259935	Software Package
Mast Cryobank vials	Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany	CRYO/B
MSP 96 polished steel target	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	224989
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
recombinant human insulin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	I2643
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	T6508
water, molecular biology-grade	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	W4502