subtipagem de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolados Utilizando PhyloProteomics baseados em espectrometria de massa (MSPP)

Resumo

Massa phyloproteomics à base de espectrometria (MSPP) foi usado para digitar uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isola a nível da estirpe em comparação com digitação sequência multilocus (MLST).

Resumo

MALDI-TOF MS oferece a possibilidade de diferenciar algumas bactérias não só ao nível de espécies e subespécies, mas ainda abaixo, a nível da estirpe. isoformas alélicas dos íons de biomarcadores detectáveis ​​resultar em deslocamentos de massa específica do isolados. phyloproteomics à base de espectrometria de massa (MSPP) é um nova técnica que combina as massas espectrometria de massa de biomarcadores detectáveis ​​em um esquema que permite a dedução de relações phyloproteomic de deslocamentos de massa específicos do isolado em comparação com uma estirpe de referência do genoma sequenciado. As sequências de aminoácidos deduzidas são então usados ​​para calcular dendrogramas baseados em MSPP.

Aqui nós descrevemos o fluxo de trabalho de MSPP digitando um ssp Campylobacter jejuni. Doylei coleção isolado de sete cepas. Todas as sete cepas eram de origem humana e multilocus digitação sequência (MLST) demonstraram a sua diversidade genética. MSPP-digitação resultou em sete tipos de seqüência MSPP diferentes, refletindo suficientemente sua phyrelações logenetic.

A C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP inclui 14 diferentes íons de biomarcadores, proteínas principalmente ribossômicas na faixa de massa de 2 a 11 kDa. MSPP pode, em princípio, ser adaptado para outras plataformas de espectrometria de massa com uma faixa de massa estendida. Portanto, esta técnica tem o potencial para se tornar uma ferramenta útil para nível de tensão tipagem microbiana.

Introdução

Durante a última década, laser assistida por matriz dessorção ionização espectrometria de tempo-de-voo de massa (MALDI-TOF MS) tem avançado para ser um método padrão altamente valorizado por género microbiana e identificação de espécies em microbiologia clínica ^{1, 2.} A identificação da espécie é baseada no registo de impressões digitais pequenas proteínas de células intactas ou de lisados ​​celulares. A faixa de massa típica para um espectrómetro de massa usado em microbiologia clínica de rotina é 2-20 kDa. Além disso, o espectro resultante pode ser utilizado para discriminar estirpes com as espécies e abaixo-abaixo-subespécies de nível ^três. Estudos pioneiros iniciais identificaram iões de biomarcadores específicos para um subgrupo particular de estirpes de Campylobacter jejuni ^{4, 5} Clostridium difficile, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi ^6, Staphylococcus aureus ^7-9, e Escherichia coli ^10-12.

A combinação de várias massas de biomarcadores para variáveis ​​correspondentes isoformas alélicas oferece a opção de subtipagem mais profunda. Anteriormente, foi implementado com sucesso um método para converter essas variações nos perfis de massa em relações phyloproteomic significativos e reprodutíveis chamados massa phyloproteomics baseados espectrometria (MSPP) em um C. ssp jejuni. coleção isolado jejuni ^13. MSPP pode ser usado uma espectrometria de massa equivalente a técnicas de subtipagem baseada na sequência de DNA como digitação sequência multilocus (MLST).

Espécies de Campylobacter são a principal causa de gastroenterite bacteriana em todo o mundo ^{14, 15.} Como consequência da Campilobacteriose sequela pós-infecciosa, ou seja, síndrome de Guillain Barré, artrite reactiva e doença inflamatória intestinal pode surgir ^16. As principais fontes de infecção sãocarne de gado contaminado de frango, peru, suínos, bovinos, ovinos e patos, leite e água de superfície ^{15, 17.} Portanto, estudos de vigilância epidemiológica regulares no contexto da segurança alimentar são necessários. MLST é o "padrão ouro" na tipagem molecular de espécies Campylobacter ^18. Uma vez que a sequenciação de Sanger-base MLST método é um trabalho intensivo, que consome tempo e relativamente cara, é restrito MLST tipagem de relativamente pequenas coortes isolados. Por conseguinte, existe uma necessidade de métodos de subtipagem barata e mais rápida. Essa necessidade pode ser satisfeita através de métodos de espectrometria de massa como MSPP.

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para MSPP-digitação usando uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolados e comparação de seu potencial com MLST.

Protocolo

1. Prepare um local de trabalho seguro, considerando condições de biossegurança

1. Familiarize-se com os regulamentos de laboratório e de segurança que são de relevância para trabalhar com microorganismos. A maioria dos microorganismos patogênicos humanos devem ser tratados a nível de biossegurança 2 condições, mas alguns, como a Salmonella enterica sorotipo Typhi, exigem biossegurança nível 3. Informações sobre nível de tratamento de cada agente patogénico pode ser acessado no www.cdc.gov/biosafety.
2. Independentemente da classificação de risco biológico do microorganismo específico, considerar todos os materiais que entraram em contato com o agente infeccioso como resíduos infecciosos que devem ser autoclavados antes do descarte. Respeitar as orientações de segurança regionais para materiais perigosos e substâncias biológicas. Assegurar que os recipientes adequados para eliminação imediata e adequada de materiais potencialmente contaminados (riscos biológicos) estão disponíveis.
3. Garantir que os instrumentos esterilizados (loops de inoculação), soluções e meios de cultura (placas de agar) estão disponíveis antes de iniciar cultura bacteriana.
4. Lavar as mãos com sabonete anti-séptico e água morna após manusear microorganismos infecciosos.

2. Selecione Referência e isola Coleção

1. Selecionar e obter uma referência sequenciado o genoma padrão isolar juntamente com as sequências do proteoma codificado, de preferência em formato FASTA. Se mais estirpes sequenciadas-genoma estão disponíveis, incluem estes na análise.
   Nota: Este isolado / estes isolados irão mais tarde ser usada para prever a identidade dos picos de massa observados em espectrometria de massa (ver Secção 7).
2. Seleccionar e obter uma variedade de potencialmente diversos isolados de tal maneira que eles cobrem a filogenia da espécie ou subespécie de interesse.
   Nota: Estes isolados, mais tarde, ser usado para demonstrar a variabilidade de biomarcadores na população (ver secção 8).
3. Certifique-se que a coleção inteira e isolado (s) de referência são proPerly digitado pelo respectivo padrão de ouro para este particular organismo ^18-20.
   Nota: Esta pode incluir uma variedade de métodos (sub) -typing, mas provavelmente irá recorrer a MLST, que ainda é o método padrão para demonstrar a diversidade genética da maioria das espécies microbianas.
4. Para inferir a filogenia dentro da coleção, calcular um filograma a partir dos dados de digitação, por exemplo, usando o método de grupo par não ponderada com média aritmética (UPGMA) em software MEGA6 para dados MLST ^21. Para dados MLST, também consultar um banco de dados MLST e atribuir tipos de seqüência e respectivos complexos clonais ^22.
   Nota: Isto irá mais tarde ser usado para analisar a congruência de MSPP com o método de digitação padrão ouro anteriormente (ver secção 9).

3. Prepare uma placa MALDI-alvo

CUIDADO: TFA é um ácido forte. O uso inadequado de TFA assume o risco de queimaduras graves na pele, lesões oculares e irritação grave of do trato respiratório superior se for inalado. Portanto, as medidas de segurança rigorosas devem ser respeitados e é necessário equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo óculos de segurança, protetores faciais, luvas adequadas, botas, ou mesmo um fato de protecção completa, durante o manuseio de TFA. Possível exposição ao TFA deve ser controlada por manipulação da substância sob ventilação adequada com um sistema de ventilação eficaz. Em caso de ventilação insuficiente, um respirador aprovado filtro deve ser utilizado. Além disso, TFA é prejudicial para a vida aquática, com efeitos prolongados. Qualquer liberação de TFA em águas residuais para o meio ambiente deve ser evitada.

Nota: Antes de manchar as amostras em um alvo MALDI, limpar a placa-alvo cuidadosamente se a placa foi usada anteriormente.

1. Preparar uma solução aquosa de etanol a 100 ml de 70% usando 30 ml de água desionizada e 70 ml de etanol puro.
2. Preparar 250 ul de um ácido trif luoroacético aquoso a 80% de solução (TFA) por mistura de 50ul de água desionizada e 200 ul de TFA a 100% em um tubo de reacção e o tubo de vortex durante 1 min.
3. Limpar o alvo de MALDI, colocando-o em um prato de vidro e submergindo-o em etanol aquoso a 70% durante cerca de 5 min a temperatura ambiente.
4. Lavar o alvo sob água quente.
5. Usando um lenço de papel, limpe a placa-alvo intensamente com solução a 70% de etanol aquoso para remover todas as amostras anteriores e outros detritos potencial.
6. Se uma limpeza adicional é necessária, lavar em água quente enquanto limpando com um lenço de papel.
7. Remover contaminantes residuais, e potencialmente invisíveis,, cobrindo a superfície do alvo com uma camada fina de 80% de TFA aquoso (~ 100 ul por 96 pontos) e limpar todas as posições alvo limpa com um lenço de papel.
8. Finalmente, lavar o alvo para remover o ácido, seque-o com um lenço de papel, e deixá-lo por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente para evaporar o líquido residual.

4. Preparação de um45; -ciano-4-hidroxi-cinâmico Ácido Matrix solução contendo um Calibrant interno

1. Prepara-se uma solução saturada de matriz pela dissolução de 10 mg α-ciano-4-hidroxi-cinâmico ácido (HCCA) em 1 ml de uma mistura de 50% de acetonitrilo, 47,5% de água, e 2,5% de TFA. Residual não dissolvido HCCA permanecerá se a solução está saturada.
2. Adicionar insulina humana recombinante como um calibrador interno. Por isso, se preparar uma solução-mãe a uma concentração final de 10 pg / mL em 50% de acetonitrilo aquoso, alíquota e armazenar a -20 ° C para posterior utilização.

5. MALDI-TOF Espectrometria de Massa

Nota: deve ser utilizado condições específicas de cultura para os organismos de interesse. As amostras de MALDI-TOF MS pode ser preparada quer por preparação de esfregaço ou extracção, dependendo do organismo (ver secção 8.4.1). Enquanto o método de extracção com ácido-etanol fórmico fornece suficiente inactivação dos agentes patogénicos, esfregaço tem de ser realizada sob suffcondições de biossegurança icient conforme necessário (ver secção 1). Normalmente, não há nenhum risco de infecção, após a aplicação da matriz, mas, para agentes patogénicos específicos são necessários protocolos de inactivação específicos. Assim, por exemplo, por MALDI-TOF MS de espécies Nocardia requer lise anterior das bactérias em água a ferver, seguida de precipitação com etanol de proteínas de ^23. EI Khéchine et ai. desenvolveram um processo para a inactivação de micobactérias, aquecendo as colónias bacterianas a 95 ° C durante 1 h, em tubos com tampa de rosca contendo água e 0,5% de Tween 20, ^24.

1. smear Preparação
   1. Espalhe uma quantidade cabeça de alfinete-de tamanho de uma colônia de bactérias diretamente para uma posição da placa-alvo MALDI ( "spot").
   2. Overlay cada ponto com 1 ml de HCCA matriz regular ou matriz que contém a calibração interna e deixar a cristalizar à temperatura ambiente. Para a determinação da massa exacta do pico de calibração, sobrepor um controlo spOT com 1 ul de Teste Padrão e 1 ul de matriz HCCA contendo a calibração interna.
      Nota: Aqui, como teste padrão um extrato de Escherichia coli DH5 alfa é usado que demonstra uma impressão digital proteína característica em MALDI-TOF MS. É enriquecida com duas proteínas que se estendem para o limite superior da gama de massa detectável.
2. Método de extracção
   1. Colheita aproximadamente cinco colónias de uma cultura de placa de agar com uma ansa de inoculação e completamente suspender em 300 uL de água duplamente destilada em um tubo de 1,5 ml de reacção. Adicionar 900 mL de etanol absoluto e misture bem por pipetagem repetida até que as colónias de bactérias estão totalmente suspensas.
      Nota: Neste passo é possível e bem estabelecida para armazenar as amostras à temperatura de -20 ° C. Além disso, a inactivação de agentes patogénicos pode ser testada por estrias 1-10 uL do extracto numa placa de agar apropriado a seguir à incubação em condições de crescimento óptimas. bem sucedido emactivação é indicado pela ausência de crescimento microbiano.
   2. Centrifugar a amostra a 13000 x g durante 1 min, descartar o sobrenadante, o sedimento seco e à temperatura ambiente durante 10 minutos. Ressuspender o sedimento cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo em 50 ul de ácido fórmico a 70%.
   3. Adicionar 50 ul de acetonitrilo e mistura-se. Remover os detritos por centrifugação a 13000 xg durante 2 min. Transferir 1 ml do sobrenadante para uma posição amostra numa placa alvo de MALDI e deixar secar ao ar durante 5 min à temperatura ambiente.
   4. Overlay cada ponto com 1 l de matriz HCCA contendo a calibração interna e deixar a cristalizar à temperatura ambiente.
3. Gravação de Espectros de Massa
   Nota: Pico-colheita a partir de espectros de massa é feita usando os procedimentos padrão recomendado (algoritmo Centróide; relação S / R:. 2; rel limiar de intensidade: 2%; largura do pico de 3 m / z, a subtracção da linha de base: TopHat)
   1. Calibrar o instrumento de acordo com PROTOC dos fabricantesol.
   2. Para cada ponto, recolher 600 espectros em 100-shots etapas.
      1. Vá até a aba "AutoXecute" do software de configuração do espectrômetro de massa. Abra o "Método" pela esquerda, clicando no botão "Método" e escolhendo o método por exemplo, "MBT_AutoX" no menu suspenso.
      2. À esquerda, clique no botão "Editar ..." direito do menu "Método" para abrir o "AutoXecute Method Editor". Vá até a aba "Acumulação". Defina o "Soma-se" valor para "600" e os "tiros satisfatórios em" _X_ "passos tiro" valor para "100".
4. Espectro interna Procedimento de Calibração
   Nota: os erros de medição Minuto são inerentes à espectrometria de massa. Dependendo da utilização do instrumento intermitente, temperatura do instrumento e re-calibração, os valores de medição obtidos podem variar entre experiências. Após a calibração instrumento de pré-medição e pós-medição de calibragem espectro a um calibrador interno é a maneira mais precisa para assegurar a comparabilidade inter-espectro.
   1. Execute os seguintes procedimentos para cada lista de pico de calibração:
      1. Inicie o navegador espectro (por exemplo, flexAnalysis e espectro aberto:. Menu "File" → "Open ...")
      2. Criar lista de controle de massa, com pico de calibração: menu "Método" → "Open ...".
      3. Escolha forma: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Open".
      4. Editar Lista de Controle de Massa: Desmarque todos os calibradores.
      5. Adicionar Calibrant pico no fundo: Label Peak: "Insulin_HIStag [M + H] + _ avg"; m_z: "5808,29"; Tolerância [ppm]: "50"; Verifique caixa Calibrant.
      6. Salvar como, por exemplo, "lista de calibração MSPP".
   2. Para cada espectro, escolher o pico de calibração a partir da lista, clique em "Atribuir Automatic" e pressione "Ok".

ove_title "> 6. Verifique o procedimento de calibração interna

1. Experimentalmente determinar a massa exata do Pico calibração.
   1. Prepare duas manchas com 1 ml de Teste Padrão cada (passo 5.1.1). Sobrepor o primeiro com 1 ml da matriz regulares HCCA, o segundo com matriz cravado-calibração 1 ml.
   2. Obter espectros de massa de cada local (secção 5.3), e calibrar internamente para os picos de teste padrão (Seção 5.4).
   3. Overlay ambos espectros abrindo-os com o navegador do espectro (por exemplo, flexAnalysis e espectro aberto: menu "File" → "Open ...") e encontrar o pico na massa esperada (insulina m / z = 5,808.29), que deve estar presente em o espectro cravado-calibrante, mas não no espectro obtido com a matriz regular.
2. Verifique se o Pico Calibrant não é dissimulados por quaisquer outras Biomarcadores do organismo de interesse.
   1. Prepare dois pontos (secção 5.1) com a estirpe de referência e overlay o primeiro com 1 ml de matriz regular, o segundo com matriz cravado-calibração 1 ml.
   2. Adquirir espectros de massa de ambos os pontos (secção 5.3) e sobrepor os espectros resultante por abri-los com o navegador do espectro (por exemplo, flexAnalysis e espectro aberto: menu "File" → "Open ..."). Certifique-se de que o pico de calibração é claramente visível no espectro obtido com a matriz cravada e não obscurecido por outro sinal adjacentes. Se este não for o caso, escolha outra calibração para este organismo em particular.
      Nota: Usando um calibrador interno cravado aumenta significativamente a precisão de determinar variações de massas de biomarcadores. Usando este método, as diferenças de massa inferiores a 1 Da pode ser detectada. Em alternativa, também invariantes massas provenientes dos organismos podem ser utilizados como calibradores. No entanto, por definição, todas as massas derivados do organismo deve ser considerado potencialmente variável, a menos que se prove o contrário.

7. Identificar biomarcadores íons na estirpe de referência

1. Medir o espectro de massa da estirpe de referência, usando a matriz cravado com o Calibrant Interno.
   1. Espalhe uma quantidade cabeça de alfinete-de tamanho de uma colónia bacteriana (secção 5.1) ou 1 ml de extrato de proteína bacteriana (secção 5.2) diretamente em uma posição da placa-alvo MALDI ( "spot").
   2. Overlay cada ponto com 1 l de matriz HCCA contendo a calibração interna e deixar a placa-alvo a cristalizar à temperatura ambiente (5.1.2 / 5.2.4).
   3. espectros registro massa da estirpe de referência (secção 5.3).
2. Internamente calibrar o espectro de referência para a massa de calibração (aqui: insulina a m / z = 5,806.29), e subsequentemente pré-processo, por subtracção da linha de base (TopHat) e de alisamento (parâmetros: SavitzkyGolay; largura: 2 m / z, 10 ciclos).
   1. Inicie o navegador espectro (por exemplo, flexAnalysis e espectro aberto: menu "File" → "Open ...; ").
   2. Escolha forma: menu "Método" suspenso → "Open ...", Esquerda-clique no método de escolha, por exemplo, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Open".
   3. Calibrar espectro escolhendo "Internal ..." no menu suspenso "Calibrar". Uma janela é aberta listando o pico de calibração (s) (seção 5.4). À esquerda, clique o pico de calibração (Insulin) → Esquerda-clique em "OK". Escolha "espectros processo" no menu suspenso "Processo".
   4. Por subtracção da linha de base activar o espectro na lista espectro no lado direito. Escolha "Subtrair Espectro de Massa Linha de Base" no menu suspenso "Processo".
   5. Para suavizar o espectro, activar o espectro na lista espectro no lado direito. Escolha "Smooth Espectro de Massa Linha de Base" no menu suspenso "Processo".
3. A partir dos dados de sequenciamento do genoma da estirpe de referência, calcular o theoretical monoisotópico peso molecular de cada uma das proteínas codificadas por traduzir a sequência de ADN para a sequência de aminoácidos correspondente, utilizando um editor de alinhamento de sequência. Copie e cole essa sequência de proteína na caixa de entrada no Portal ExPASy Bioinformatics Resource (http://web.expasy.org/compute_pi/). e pressione "Clique aqui" para calcular pi / Mw. No caso de C. jejuni ssp. doylei calcular a massa de 14 biomarcadores detectáveis.
4. Copiar os resultados em uma planilha, com uma coluna contendo o identificador de gene e no próximo o peso molecular. Ordenar as linhas de peso molecular calculado para facilitar a pesquisa de mais fácil das massas. Nota: Outras colunas são opcionais; anotação funcional pode ser especialmente útil para a interpretação mais tarde.
5. Inserir uma segunda coluna para a folha de cálculo para o peso molecular da forma methioninated-de, subtraindo 135 Da do peso molecular monoisotópica. Nota: Isto é porque algumas proteínas submeter póstranslacional por remoção proteolitica da metionina N-terminal.
6. Atribuir cada grande massa biomarcadores medidos para as massas calculados a partir da estirpe de referência, observando-se a massa medida da tabela do genoma preparado anteriormente (Tabela 1).
7. Se os íons de biomarcadores não pode ser atribuído a produtos de genes preditos, considere outras modificações pós-translacionais (metilação, acetilação, prenilação, etc., ver http://www.abrf.org/delta-mass para uma compilação das modificações e as mudanças em massa ligados ). Para qualquer outra modificação pós-translacional conhecido que é frequentemente observada em organismos de interesse adicionar outra coluna para a mesa e recalcular o peso molecular análogo ao do processo para a forma-de methioninated.
8. Configurar outro guia planilha e gravar para cada biomarcador ion a massa e identificador em uma coluna de mesa separada.

8. Avaliar Biomarcador Variabilidadena População

1. Calibrar espectros de massa obtidos da coleção isolados, como foi feito para a estirpe de referência (s) (secção 5.4.2).
2. Identificar biomarcadores variantes no espectro de massa. Uma massa variante caracteriza-se pela ausência de uma massa conhecida a partir do espectro de referência e a aparência de uma nova massa não presentes na referência. A diferença de massa deve estar em conformidade com uma única troca de aminoácidos (Tabela 2), ou uma combinação dos mesmos.
3. Em um isolado por linha, registrar a massa medida para cada biomarcador e a isoforma previsto nas respectivas colunas da tabela.
   Nota: Raramente, alguns deslocamentos de massa possa ser atribuída a várias trocas de aminoácidos diferentes, por exemplo, ambos, N trocado por D e Q trocado por E, e vice-versa, resultar em um deslocamento de massa de 0,985 Da (Tabela 2). Este problema intrínseco não pode ser resolvido só por espectrometria de massa. Portanto, diferentes isoformas no nível da sequência de proteínas com a mesma massadeve ser tratado como um único tipo MSPP. Paralelamente sequenciamento Sanger dos genes de íon de biomarcadores específicos confirmou que este problema não ocorrer enquanto MSPP-digitando o C. jejuni ssp. doylei isolar recolha utilizado no presente estudo.
4. Confirmar novos tipos MSPP por PCR-amplificar e sequenciar os respectivos genes biomarcadores. Por sua vez, este também serve como uma confirmação de que a identidade biomarcador foi atribuído correctamente.
   1. Cultura bacteriana isolados sob condições de crescimento óptimas. Cultura C. jejuni ssp. doylei estirpes em agar Columbia suplementadas com 5% de sangue de ovelha a 37 ° C sob condições microaerofílicas (5% _O2, 10% _CO2, 85% _N2). Incubar durante ca. 48 hr. Usar uma placa de agar em separado para cada isolado para evitar a contaminação cruzada.
   2. Extrair DNA genômico dos isolados bacterianos usando um / máquinas automatizadas kit de extração de DNA adequado de acordo com as instruções do fabricante.
   3. amplificar as respectivos genes biomarcador utilizando os iniciadores listados na Tabela 3 Realizar todas as reacções de PCR sob as seguintes condições:. desnaturação a 94 ° C durante 30 seg; hibridação a 55 ° C durante 30 seg; alongamento a 72 ° C durante 30 seg.
   4. Determinar a sequência de DNA de cada fragmento amplificado por Sanger de sequenciação utilizando uma quantidade adequada de ADN genómico (normalmente 600-700 ng de ADN é suficiente para uma concentração de cerca de 100 ng / mL) e um dos iniciadores de amplificação (geralmente isto é feito pela uso de um provedor de serviços).
5. Em uma tabela separada (ver Tabela 4), gravar a sequência de proteína deduzida para cada isoforma romance usando uma ferramenta de tradução adequada (por exemplo, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) ^25.

9. Calcule a filogenia baseada no MSPP e compare ao padrão-ouro

1. Concatenar as sequências de aminoácidos particulares biomarcador para t pertencenteTipo, ele MSPP dos isolados em uma seqüência contínua usando um editor de alinhamento de sequências, como BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) ²⁶ ou a planilha biomarcador.
2. Calcule filogenia pelo agrupamento como foi feito para os dados de digitação padrão-ouro, por exemplo, análise de agrupamento ^21.
3. Comparar a filogenia baseado no MSPP à obtida com o padrão de ouro ^{4, 13.}

Resultados

Anteriormente, nós estabelecemos com sucesso um esquema MSPP para C. ssp jejuni. jejuni ^13. Aqui, o objetivo foi estender o método para o irmão subespécie C. ssp jejuni. doylei. Neste cenário específico, sete C. jejuni ssp. doylei isolados foram adquiridos a partir da coleção belga de microorganismos / Laboratório de Microbiologia UGent BCCM / LMG Ghent, Bélgica. Todos os sete isolados utilizados...

Discussão

O passo mais crítico no estabelecimento de um regime de MSPP é a determinação genética inequívoca de identidades biomarcador íon. Se não for possível identificar um biomarcador, sem dúvida, então ele deve ser excluído do regime ^13.

A C. ssp. doylei esquema jejuni inclui 14 diferentes íons de biomarcadores. Estes são menos 5 em comparação com o C. jejuni ssp. esquema jejuni MSPP ¹³ .A diferença mais significat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	GT02554 G201	Mass spectrometer
bacterial test standard BTS	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	604537
BioTools 3.2 SR1	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	263564	Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8290190	5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG8843	ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG9143	Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG7790	ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG9243	Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG8871	NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG9255	Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate	Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium	LMG8870	NCTC A613/87
Columbia agar base	Merck, Darmstadt, Germany	1.10455 .0500	500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	251419	Software Package
defibrinated sheep blood	Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany	SR0051
ethanol	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	02854 Fluka
formic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	F0507
HCCA matrix	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	604531
Kimwipes paper tissue	Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	Z188956
MALDI Biotyper 2.0	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	259935	Software Package
Mast Cryobank vials	Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany	CRYO/B
MSP 96 polished steel target	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	224989
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
recombinant human insulin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	I2643
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	T6508
water, molecular biology-grade	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	W4502